Imagem direta de cálcio ER com Targeted-Esterase Induzida Dye Loading (TED)

Resumo

Targeted-esterase induzida corante de carregamento (TED) suporta a análise da dinâmica intracelular de cálcio loja por imagens de fluorescência. O método baseia-se na segmentação de uma carboxilesterase recombinante para o retículo endoplasmático (ER), onde se melhora o desmascaramento do local sintético de baixa afinidade Ca ^{2 +} Corantes indicador no lúmen ER.

Resumo

Visualização da dinâmica do cálcio é importante para entender o papel do cálcio na fisiologia celular. Para examinar a dinâmica de cálcio, Ca ^{2 +} indicadores fluorescentes sintéticos tornaram-se populares. Aqui demonstramos TED (= targeted-esterase induzida corante de carga), um método para melhorar a libertação de ^{Ca2 +} corantes indicadoras no lúmen do ER de diferentes tipos de células. Até à data, o TED foi utilizado em linhas de células, células gliais e neurónios, in vitro. TED sobre bases eficientes, recombinante alvo de uma atividade de alto carboxilesterase para o lúmen ER usando vetores construções que carboxilesterases rápidas (CES). Os últimos vectores TED contendo um elemento de núcleo de CES2 fundida com uma proteína fluorescente vermelha, permitindo assim imagiologia simultânea de duas cores. A dinâmica do cálcio livre na ER são gravadas em uma cor, enquanto a estrutura ER correspondente aparece em vermelho. No início do processo, as células foram transduzidas com um lentivírus. Posteriormente, as células infectadas are semeadas em lamínulas para finalmente permitir imagens de células vivas. Em seguida, as células vivas são incubadas com o éster acetoximetílico (AM-éster) forma de baixa afinidade Ca ^{2 +} indicadores, por exemplo Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, ou Mag-Fura2-AM. A actividade de esterase nos cliva fora do ER cadeias laterais hidrófobas da forma AM do indicador de Ca ^{2 +} e de um corante fluorescente / Ca ^{2 +} complexo hidrófilo é formado e preso no lúmen do ER. Depois de corante de carga, as células foram analisadas num microscópio confocal laser scanning invertido. As células são continuamente perfundido com soluções de Ringer-like e as dinâmicas ER cálcio são diretamente visualizados por imagem time-lapse. Libertação de cálcio a partir do ER é identificado por uma redução na intensidade de fluorescência em regiões de interesse, enquanto que o reenchimento da loja ER cálcio produz um aumento na intensidade de fluorescência. Finalmente, a mudança na intensidade de fluorescência ao longo do tempo é determinada pelo cálculo da Af / F _0.

Introdução

A fim de resolver as respostas fisiológicas de cálcio do ER, desenvolvemos uma nova estratégia para melhorar a retenção de corantes sensíveis cálcio sintéticos para o ER. O método permite o monitoramento em tempo real direto, sem interrupções de livre ER cálcio na presença de cálcio extracelular.

Função e sinalização de cálcio ER

Sinais de cálcio são encontradas em diferentes tipos de células, células musculares, por exemplo, neurónios e células gliais e a sua gama de funções de mediar a contração do músculo a um envolvimento na transmissão sináptica na aprendizagem e na memória ^1,2. As alterações na concentração de cálcio livre são de interesse científico porque o cálcio está envolvido na regulação da transcrição de genes, a proliferação celular, a excitabilidade neuronal, morte celular e outros eventos de sinalização celular ^1-7. Todos estes sinais de cálcio celulares estão funcionalmente ligados e contribuir para cálcio intracelularloja dinâmica ^8-10.

Uma característica comum a todos os sinais de cálcio é o fluxo de cálcio entre o espaço extracelular, o citosol e organelas, principalmente, o ER e mitocôndrias. Isto faz com que as alterações dinâmicas na concentração de cálcio dentro destes organelos, que são detectados pelos diferentes componentes de sinalização. Em geral, a concentração de cálcio em gamas de RE entre 100 a 800 | iM, no citosol da concentração de cálcio é de cerca de 100 nM, e no espaço extracelular, a concentração é de cerca de 1-2 mM. Assim, não existe uma força motriz maior para o fluxo químico cálcio para o citosol ^2,9,10.

Os sinais de cálcio ER derivados mais comumente investigados dependem da estimulação dos receptores acoplados à proteína G (GPCR), que, em seguida, activam a fosfolipase C (PLC). PLC em vez produz o inositol 1,4,5-trifosfato (IP ₃₎ ^1. Após a ligação de IP ₃ à sua conseptor (IP _3-Rec, Figura 1) na ER-membrana, os íons cálcio são liberados a partir do lúmen ER. Historicamente, a liberação de cálcio ₃ mediada IP do ER foi o primeiro - mesmo que indiretamente - medido em células pancreáticas acinares por Streb et al, em 1983, ^11.. Esta publicação sugeriu pela primeira vez que uma cascata de sinalização que envolvem a acetilcolina, a fosfolipase C e _IP3. Esta forma de libertação de cálcio é geralmente denominado libertação de cálcio induzida por IP ₃ (IiCR) (Figura 1). Ativação da quinase dependente de fosfolipase Cy por receptores tirosina quinases liga a ação de fatores de crescimento e fatores neurotróficos para ER cálcio sinalização após IP ₃ elevação ^12. Além IiCR, elevação de cálcio podem ser a entrada de cálcio mediada por receptores ionotrópicos, por exemplo através de canais de cálcio dependentes da voltagem (Ca _V), e subsequente libertação de cálcio induzida por cálcio (CICR) por re rianodinaceptors (RyR). IiCR e CICR são fisiologicamente ligado a entrada de cálcio loja operado (SOCE). SOCE inclui a ação do STIM (molécula interagindo estroma), que é um sensor para a liberação ER cálcio. STIM foi mostrada para estimular a entrada de cálcio extracelular através de canais de receptores transientes potenciais (Trp) ^13, Orai canais de cálcio de ¹⁴ e até mesmo dos canais de cálcio dependentes da voltagem ¹⁵ (Figura 1). Perda de ER cálcio é dinamicamente resgatado pela ação do Sarco-retículo endoplasmático cálcio ATPase (SERCA), que ativamente bombas de cálcio de volta para o ER. O bloqueio da SERCA com drogas tais como tapsigargina revela uma perda contínua de cálcio RE para o compartimento citosólico. Este requisito de cálcio "fuga" é causado por ER intramembrane complexos de poros, tais como o complexo de proteína de ^16,17 Sec61 (Figura 1).

Em 1998, Berridge publicou um modelo, o "neurônio dentro de um modelo de neurônio", which sugere um papel fisiológico princípio da ER na integração de cálcio neuronal ^5. Este modelo considera a existência de um sistema de membrana ER contínuo formando uma "imagem" intracelular da membrana plasmática neuronal ^5. Este sistema de membranas eucarióticas binário foi reivindicada a ser um pré-requisito básico para a integração temporal e espacial dos sinais de cálcio rápidas e lentas em neurônios. Sinais de cálcio que ocorrem ou concomitantemente ou posteriormente em diferentes espinhos ou dendritos de um mesmo neurônio são conferidos a soma ou núcleo através da ER, onde se resumem ^5,18 da célula. Então, a soma pode ter efeitos sobre a excitabilidade do neurônio, a regulação da transcrição do gene ou a integração de cascatas de sinalização. Assim, o ER suporta a integração de sinais de cálcio. Um pré-requisito para este conceito é a continuidade do ER de uma única célula, o que foi reivindicado em diversos estudos e que foi provado pelo menos para somato-dáreas endritic e curta distância projeções axonais ^19-21. Se há continuidade ER dentro projeções axonais longas é uma questão de debate.

Estratégias para medir o fluxo de cálcio livre sobre a membrana ER

Sinais de cálcio são mais frequentemente monitorados no citosol ^22,23. Portanto, não pode ser facilmente distinguida se Ca ^{2 +} a fluir para o citosol a partir extracelular ou de reservas intracelulares ^6,24. Para superar esta limitação, foram desenvolvidas estratégias metodológicas para a imagem latente de cálcio direto ER. Em resumo, são utilizadas as seguintes estratégias: (1) ER-alvo geneticamente modificadas indicadores de ^{proteína-25-27} de baixa afinidade de Ca ^{2 +} os indicadores baseados Proteína utilizar a proteína bioluminescente aequorina GFP ou em combinação com uma proteína. Sensível ao cálcio. Estes Ca ^{2 +} indicadores geneticamente modificados (Gecis) podeser orientada para o ER, com a ajuda de um péptido de sinal e são activamente mantido no ER e de retenção utilizando um padrão de recuperação. Comum ER Ca ^{2 +} indicadores de base no princípio da Cameleon e são o Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon divisão YC7.3ER ^29, e Cameleon D1 ^30. (2) direto carregamento de AM-éster de baixa afinidade Ca ² tintura baseada em indicadores esterase ^{+ 31,32.} Dos corantes indicadoras (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM ou Fluo5N-AM) derivativos AM passar o membranas biológicas em um estado de cálcio-insensitive lipofílico. Em seguida, no citosol, bem como no ER, esterases endógenas de clivar o grupo de AM-éster e libertar o indicador de ^{Ca2 +,} deixando para trás uma certa quantidade de corante activa no citossol e no ER. Por conseguinte, esta abordagem é útil em condições de uma elevada concentração de cálcio no ER, enquanto a concentração de cálcio citosólico permanece bem inferior ao nível delimite de protecção dos indicadores de baixa afinidade, em particular durante os sinais característicos de cálcio (por exemplo, de baixo nM até uM). (3) Carga AM-éster, em combinação com a permeabilização da membrana do plasma ^32. Qualquer citosólica de ^{Ca2 +} indicador remanescente é removido por permeabilização da membrana do plasma com quantidades pequenas de um detergente "leve" (por exemplo, saponina) num tampão intracelular artificial. Assim, as membranas intracelulares podem ser estimuladas, por exemplo, com IP ₃ intracelular no tampão, directamente através de "poros" da membrana plasmática. (4) Diálise do citosol sob configuração de célula inteira e medições simultâneas de Ca ^{2 +} no lúmen ER e citosol ^32,33. Uma célula é carregado pela primeira vez com uma baixa afinidade Ca ^{2 +} indicador (por exemplo, Mag-Fura2- AM, raciométrica, UV-luz). Depois, com a ajuda de uma pipeta de remendo, qualquer cit remanescenteosolic baixa afinidade de Ca ^{2 +} indicador é dialisado para fora do citosol com um tampão contendo um indicador de ^{Ca2 +} de elevada afinidade (por exemplo, Fluo-3, luz visível). Esta estratégia permite a gravação simultânea de sinais derivados citosólicas e ER. (5) Targeted-esterase induzida corante de carga de ^8,34. Carboxilesterase (CES) está voltado para o lúmen do RE e proporciona uma elevada actividade de esterase de aprisionamento eficaz da forma de AM-éster de baixa afinidade de Ca ^{2 +} indicadores.

Targeted-esterase induzida corante de carregamento (TED)

Para melhorar o direcionamento de baixa afinidade de Ca ^{2 +} indicadores para o lúmen ER, TED foi desenvolvido. TED requer a superexpressão de uma carboxilesterase alvo rato ER (CES2) (Figura 2), o que é conseguido por meio de construções de expressão. As células que expressam uma construção recombinante CES-são incubadas com a forma de AM-éster de cálcio emcorante dicator (Fluo5N-AM, a Figura 2). Em seguida, no ER, o corante é convertido para o ^{Ca2 +} sensíveis, a membrana impermeável de Ca ^{2 +} complexo indicador (Fluo5N/Ca ^{2 +),} pela elevada actividade de esterase, aprisionando, por conseguinte, o corante numa concentração elevada no lúmen ER ^{8 , 34.} O método é especialmente útil para investigar ER-libertação de cálcio através dos IiCR-vias, por exemplo por meio de purinérgicos ou receptores de glutamato metabotrópicos, ^8,34 e visualizar a depleção de cálcio através da "ER" canais de vazamento, por exemplo, directamente após o bloqueio da ¹⁷ SERCA ^{, 34.} Para nossa experiência, a baixa afinidade Ca ^{2 +} indicador Fluo5N-AM é atualmente o melhor indicador disponível para usar com a estratégia de carregamento TED corante. Fluo5N-AM tem uma baixa afinidade pelo Ca ^{2 +} (constante de dissociação K _D ~ 90 mM, figura 2), é quase não-fluorescente em seu AM-forma, mas oferece emissão de fluorescência de alta sobre calciu^8,34 m de ligação. O Fluo5N/Ca ^{2 +} complexo pode ser excitado com uma fonte de luz padrão de ~ 490 nm, o que corresponde a corantes convencionais, tais como FITC, Alexa 488, ou eGFP. Sinais de cálcio citosólico dificilmente atingir uma concentração na gama uM baixo e são, portanto, apenas detectada por Fluo5N no citosol ^35.

Para melhorar o desempenho TED, várias construções de vectores recombinantes foram desenvolvidos (Figura 3). Originalmente, os vectores de TED baseados na sequência de codificação de CES2 (RefSeq número de acesso NM_145603, CES2c) e melhor desempenho TED é observado com a expressão estável de CES construtos. Novos vetores TED expressar um elemento central da CES2 fundido à proteína fluorescente vermelha TagRFP-T2 ^36. Estes vectores possuem a vantagem de que eles podem ser utilizados para identificar as células transduzidas e utilizar a fluorescência vermelha como um controlo interno para a normalização de alterações na Fluo5N/Ca ^{2 +} fluorescência. A fluorescência vermelha também oferece a possibilidade de visualizar a distribuição estrutural do ER e as alterações na dinâmica do ER sob condições de estimulação.

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Protocolo

Este protocolo apresenta a TED aplicada a linhas de células, neurónios do hipocampo e células da glia corticais. TED desempenho é melhor quando vetores TED são estavelmente expressa, por exemplo, lentivirais. Uma visão geral esquemática do método TED é mostrado na Figura 4.

1. Preparação das soluções

As seguintes soluções devem ser preparadas antes de partida e pode ser armazenado tal como indicado. Nós usamos geralmente vidro esterilizado e material plástico e água esterilizada.

1. Prepara-Ringer HEPES (em mM): 125 NaCl, 3 de KCl, 25 de HEPES, 2 de MgSO ₄ .7 H ₂ O, 2 de _CaCl2, 1,25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O.. Isenta de cálcio-Ringer HEPES consiste em (em mM): 127 NaCl, 3 de KCl, 25 de HEPES, 2 de MgSO ₄ .7 H ₂ O, 1,25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O e 0,1 EGTA.. Sem glicose estas soluções de imagem pode be armazenado a 4 ° C. A quantidade necessária de D-glucose é recém-acrescentado antes da utilização.
2. Para a análise TED em neurônios do hipocampo, é recomendável líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF). ACSF é composta por (em mM): 127 NaCl, 23 _NaHCO3, 3 de KCl, NaHPO ₄ 2,5 H ₂ O, 25 D-glucose.H ₂ O, 2 de _CaCl2, 2 de MgCl ₂ 0,7 H ₂ 0 em DDH. ₂ 0.
3. Prepara Fluo5N-AM a uma concentração de 5 mM. Para ajudar a solubilização de adicionar 8,9 mL de 20% de Pluronic F-127 (em DMSO, armazenada a temperatura ambiente, protegidos da luz e humidade) e 50 ug de liofilizado Fluo5N-AM. Então solubilizar Fluo5N-AM por meio de um banho de água sonicador durante pelo menos 2 min. Loja alíquotas de 0,5 mL a -20 ° C, protegido da luz e umidade.
4. Prepare antagonista e ações agonistas, conforme necessário. Por exemplo: a) 10 mM ATP ou ADP (em H ₂ O, a activação de receptores purinérgicos metabotrópicos), b) 10 mM de carbacol em _H2O (agonistado receptor muscarínico de acetilcolina), c), 30 mM de ácido ciclopiazônico (CPA) em DMSO (bloqueador do SERCA), d) DHPG 50 mM em PBS (agonista do receptor de glutamato metabotrico do tipo _I e para mGluR do mGluR _5), e), 10 mM de Glutamato em H ₂ S, f) ionomicina 1 mM em DMSO (ionóforo), g), 5 mM em DMSO, tapsigargina (bloqueador de elevada afinidade do SERCA). Loja de alíquotas a -20 ° C.
5. Lentivirais: Este protocolo inclui a utilização de partículas de vector de expressão lentiviral TED. Sua produção e armazenamento não faz parte do presente protocolo. Usamos lentivirais da segunda geração para a transferência de carboxilesterases recombinantes de linhagens celulares, células da glia e os neurónios. Nossas bases do sistema lentivírus no vetor de expressão FUGW ^37, e os plasmídeos de empacotamento pCMVΔR8.91 ou psPAX2 eo pseudotipagem plasmídeo pMD2.G ^38,39 ATENÇÃO:. Considere-se que o trabalho com recombinantes auto-inativando lentivirais requer o cuidadoconsideração de normas de biossegurança. Em muitos países, esses vetores são classificados como grupo de risco de risco biológico 2. Para mais informações consulte http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. Preparação e infecção viral do mouse neurônios do hipocampo

1. Lave lamínulas de vidro em um copo de Petri de 20 cm de diâmetro (100 lamelas por prato) 1x em etanol 70% por aproximadamente 30 min. Finalmente, adicionar etanol a 100% (PA) durante 2 min. Remover o etanol residual e as lamelas secar sob um exaustor estéril.
2. Prepare-se dois tipos diferentes de mídia para culturas de neurônios do hipocampo: (a) média neurobasal com B27 01:50, (b) meio cheio: médio neurobasal com B27 01:50, Glutamax 1:100, e N2 suplemento de 1:100. Estéril filtrado a mídia e armazená-los na célula incubadora até o uso.
3. Um dia antes da dissecação, as lamelas são preparados colocando em primeiro lugar uma lamela de 10 mm estéreis, em cadapoço de uma placa de cultura de células de 4 poços. Em seguida, cuidadosamente revestimento cada lamela com 80-100 ul de 0,1% de poli-L-lisina e armazenar os pratos numa incubadora durante a noite.
4. No dia da dissecção e cultura de células, começam com as lamelas de lavar três vezes com 100 ul de HBSS e transferir 100 ul de meio neurobasal cada lamela. Coloque os pratos em uma incubadora de equilíbrio (por exemplo, durante a dissecção de camundongos).

Dissecação

Realizamos nossos experimentos com ratos, de acordo com as orientações da União Europeia, conforme aprovado pelo nosso cuidado com os animais institucional e comitê de utilização.

5. Remover o cérebro total e dissecar o hipocampo bilateralmente.
6. Remova cuidadosamente qualquer meninges e tecido diferente do hipocampo e coloque um hipocampo cada um em um tubo de 1,5 ml contendo 450 ul de HBSS. Armazenar o tecido em gelo até um número suficiente de hipocampo foi isolada.

cultura celular

7. Adicionar 50 ul de 1% de tripsina (Worthington) a cada tubo e incubar em banho de água a 37 ° C durante 15 min. Agitar os tubos ocasionalmente. Para parar a reacção de digestão, adicionar 50 ul de inibidor de tripsina de de 1% a cada tubo e inverter o tubo várias vezes.
8. Transferir todo o tecido de até 5 hipocampos de 15 ml para um tubo Falcon de evitar a transferência de líquido. Adicionar meio B27 (a), para um volume final de 5 ml.
9. Triturar o tecido usando um fogo polido Pasteur pipeta de vidro com cuidado pipetando para cima e para baixo CUIDADO:. Evite bolhas de ar!
10. Spin com 400 xg durante 3 minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio B27 (a).
11. Tritura-se o tecido uma vez com a pipeta de vidro, e, em seguida, duas vezes com a ajuda de uma ponta de filtro de plástico ul 1000. Executar esta como descrito nas etapas 2.9 e 2.10.
12. Após a última centrifugação, ressuspender o sedimento celular em 2 ml cheio medium (b), e tritura-se as células com uma ponta de filtro de plástico pi 200. Para separar aglomerados de células restantes a partir da suspensão de uma única célula, vamos aglomerados de células sossegar por 1-2 min.
13. Contar as células e calcular o número total de células necessárias para a infecção virai. Para usar imagens TED 25.000 células por 10 milímetros lamela.
14. Plating adicional de 25.000 células não transduzidas, como controlo é recomendada neste ponto.

Infecção viral

15. Transferência da suspensão de células para a infecção virai em um novo tubo Falcon de 15 ml e centrifugar durante 3 min a 400 x g.
16. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 300 ul de meio (b)
17. Adicionar uma quantidade apropriada de partículas de vector de expressão de lentivírus infecciosas TED e deixar o tubo Falcon de repousar à temperatura ambiente durante 10 min.
18. Encher o tubo com o meio completo (b) para o volume final necessário para revestimento (100 uL para cada lamela 10 milímetros), aspirar o meio a partir do coverslip e coloque imediatamente 100 mL suspensão celular em cada lamela.
19. Coloque os pratos na incubadora até que todas as células se estabeleceram (aproximadamente 2 horas) e preencher cuidadosamente os pratos até que eles contêm 2 ml de meio (b).
20. Deixe neurónios crescer durante pelo menos uma semana. Substituir 50% do meio de cada semana.

3. Cultura e Viral-infecção de células gliais corticais mouse

Preparação

1. Comece a preparação meio basal glia (mistura 1:1 de DMEM/F12 com 10% de FCS, 5% de HS, 1% de penicilina / estreptomicina, 0,45% de glucose) e revestimento de um frasco de cultura de célula T75 com 4 ml a 0,5 ng / ml Poly -DL-ornitina bromidrato (PORNÔ) (diluído em solução de ácido bórico 150 mM, pH 8,35). Após incubação a 37 ° C durante 2 horas ou durante a noite, lava-frasco de cultura de célula, três vezes com HBSS e adicionar 18 ml de meio basal contendo glia B27 1:50 e 10 ng / ml de EGF. Equilibrar frasco de cultura de célula na incubadora (até 3 horas).

Dissection

1. Realizamos nossos experimentos com ratos, de acordo com as orientações da União Europeia, conforme aprovado pelo nosso cuidado com os animais institucional e comitê de utilização.
2. Dissecar o cérebro de um rato P5, P7 e remover o hipocampo e as meninges de ambos os hemisférios, como descrito em 2.5.
3. Dissecar o córtex frontal, corte-o em vários pedaços pequenos e coletá-los em um tubo de 1,5 ml contendo HBSS. Armazenar o tubo em gelo e prosseguir para a parte de cultura de células.

A cultura celular

4. Transferir todo o tecido a partir do tubo de um tubo de 15 ml Falcon usando uma pipeta de vidro polido fogo.
5. Adicionar meio basal até um volume final de 5 ml e tritura-se o tecido diversas vezes, pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de vidro polido fogo. Após centrifugação a 300 xg durante 3 minutos, aspirar o meio, e ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio basal.
6. Repita o passo 3.5 duas vezes.
7. Após a third centrifugação, ressuspender o sedimento celular em 2 ml de meio basal contendo glia B27 (1:50) e 10 ng / ml de EGF.
8. Titruate mais uma vez e transferir a suspensão de célula para o frasco de cultura de célula T75 preparado e deixar crescer as células durante 3-4 dias.

Lavagem das células gliais (após 3-4 dias de cultura):

9. Lave as células uma vez com 10 ml PBS e vigorosamente toque ou gentilmente bater o frasco algumas vezes com a mão, segurando-a firmemente com a outra mão. Por este passo os restos celulares e agregados de células são removidas a partir da cultura.
10. Aspirar o PBS e adicionar meio fresco contendo basal glia B27 (1:50) e 10 ng / ml de EGF. Além disso cultivar a cultura por 5-7 dias até que as células chegar a 80% de confluência.

Divisão, transdução e semeadura final células gliais:

11. Revestimento 10 milímetros lamelas com 100 ul de poli-D-lisina (Solução stock: 0,1%, diluído 1/50 ad 20 ug / ml em PBS ou HBSS) e incubarlos numa incubadora durante a noite. Lavar as lamelas três vezes com HBSS e adicionando 100 ul glia meio basal. Equilibrar as lamelas na incubadora (3 h).
12. Lave as células gliais duas vezes com 10 ml de PBS, aspiração do PBS, e adicionar 3 ml de tripsina (TrypLE, não diluída). Trypsinize células por até 1 min ATENÇÃO:. Evite o excesso de tripsinização. Normalmente mais de 80% de todas as células são separadas após 1 min e isso é suficiente para ter vários milhões de células saudáveis.
13. Parar a reacção por adição de 10 ml de meio basal glia, a transferência da suspensão de células para um tubo Falcon de 15 ml, de centrifugação a 300 xg durante 3 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio basal glia.
14. Novamente, girar e aspirar como descrito no passo 3.15, em seguida, voltar a suspender as células em 5 ml de meio basal Glia.
15. Transferir a quantidade necessária de células para um tubo de 1,5 ml. 10 ^{4 4-2x10} células gliais são suficientes para uma lamela de 10 milímetros. Geralmente, a suspensão volUME para transduzir as células de um 4-bem-prato é inferior a 200 ul. Adicionar uma quantidade apropriada de partículas de vector lentiviral TED de expressão para as células e incubar à temperatura ambiente durante 10 min. Em seguida, encher a suspensão com o meio glia basal ao volume de semeadura (100 mL por lamela).
16. Semente de 100 uL de células infectadas por lamela e incubar durante cerca de 2 horas, em seguida, adicionar meio basal contendo glia B27 1:50 e 10 ng / ml de EGF até um volume final de 2 ml.
17. Para as condições ideais de cultura usam células para experimentos no dia 3-7 após o plaqueamento.

4. Geração e Cultura da Linha celular Reporter

Linhas de células repórter TED foram estabelecidas com base em células HeLa, BHK21, HEK293 e SH-SY5Y. Aqui nós fornecemos o protocolo para as células HeLa, mas o protocolo pode ser transferida para qualquer outra linha celular bem.

Geração de linha estável de células HeLa

1. Dividir uma linhagem de células HeLa tipo selvagem e de transferência de 100 mil cells em um volume de 200 ul a um tubo de 1,5 ml.
2. Adicionar uma quantidade apropriada de partículas de vector lentiviral TED de expressão para o tubo e incubar a suspensão de células-vírus, durante 10 min à TA. Então as células de semente num volume total de 2 ml de meio (DMEM, 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina) num prato de 30 milímetros e incubar durante 3 dias.
3. Após lavagem uma vez com PBS, aspirar meio e adicionar 500 ul de tripsina (TrypLE, 2:03 em PBS). Incubar por aprox. 3 min e, em seguida, parar a reacção por adição de 3 ml de meio. Transferir a suspensão em um tubo de 15 ml Falcon e centrifugar a 400 xg durante 3 min.
4. Ressuspender o sedimento celular em 200 ul de meio e novamente infectar as células com as partículas lentiviral, conforme descrito no item 4.2. Em seguida, as células de semente num frasco de cultura T25 células em 10 ml de meio.
5. Crescer as células até uma confluência de 60-80% é atingido. Em seguida, dividir a cultura.

Linhas de células repórter TED

6. Linhas de células repórter TED pode ser mantered em qualquer meio padrão, por exemplo, meio DMEM contendo 5% ou 10% de FCS e 1% de penicilina / estreptomicina é usado.
7. Placa de um número adequado de células em um prato de 4 poços contendo lamelas de 10 mm estéreis (ver acima), por exemplo, de 10.000 a 20.000 células por lamela.
8. Cultivar células por pelo menos dois dias antes de os utilizar para o TED imagiologia.

5. Preparação para o exame de imagem ao vivo no microscópio invertido

1. 1. Pré-aquecer HEPES-Ringer até à temperatura ambiente e adiciona-D-glucose.
   2. Pré-aquecer a ACSF (sem Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +),} até à temperatura ambiente e adiciona-D-glucose. Arejar a ACSF com carbogen por 5 minutos. Em seguida, adicionar uma solução stock M de _CaCl2 e _MgCl2 até às concentrações finais de 2 mM de cada um.
2. Inicie os microscópios imagens ao vivo e todos os programas de computador.
3. Comece perfusão em uma câmara de imagem "dummy" e equilibrar o sistema de tubo.
4. Pré-aquecer o aquecedor de solução em linha ea câmara de imagem no estágio do microscópio. Fixe a câmara de imagem em uma inserção de aquecimento.
5. Equilibrar o sistema para 32-37 ° C antes de iniciar o procedimento de carregamento corante CUIDADO:. Para evitar fluxo acidental de solução de perfusão no sistema microscópio usamos laços de cabelo em torno dos objetivos e folhas de silicone elastômero (1mm) para proteger o estágio do microscópio.

6. Dye Carregando de qualquer tipo celular

1. Ressuspender uma alíquota de Fluo5N-AM (ver 1.3) na solução de imagem pré-aquecido 100 l (HEPES-Ringer ou ACSF).
2. Solubilizar Fluo5N-AM na solução de imagem (HEPES-Ringer ou ACSF) num banho de água de ultra-sons durante 90 segundos.
3. É um novo 4 - ou uma solução de 24 poços da placa e transferência de 400 ul de imagem pré-aquecido a uma cavidade. Adicionar a solução corante para a mesma bem vir a 500 ul de uma solução a 5 uM.
4. Com cuidado, coloque uma lamela com células (eg10-18 mm de diâmetro) no poço, as células para cima.
5. Incubar durante um período de tempo apropriado numa incubadora de cultura de células a 37 ° C (entretanto preparar configurações de imagem na fase de microscópio). Vezes corante de carregamento típicos são os neurônios e células gliais 7-15 min e para linhas de células de 10-20 min.

Crucial: tempo de carregamento de corante e concentração do corante dependerá do tipo de célula, a densidade celular, e as necessidades específicas do experimento! Longos tempos de incubação em presença do corante pode prejudicar as células, especialmente os neurónios primários e células gliais primários e isso é fundamental para a capacidade de resposta a estímulos fisiológicos. Vezes longo de incubação (por exemplo, 30 minutos) apenas irá ser útil para ER experiências de localização de cálcio para investigar a distribuição de cálcio ER em pequenas estruturas subcelulares, por exemplo, finos ou espinhas neurites. Em algumas experiências, uma mistura de 1/3 meio de crescimento com a solução de imagem pode ajudar a proteger as células durante Fluo5N-AMcarregamento.

6. Instantaneamente, transferir a lamela para outra cultura de células bem contendo solução de imagem (HEPES-Ringer ou ACSF) e começar a montagem das células na câmara de imagem.

7. ER-cálcio imagens de células vivas com um Laser invertido microscópio confocal de varredura

1. Use um pincel para aplicar graxa de alto vácuo para a câmara de imagem. O lubrificante é necessário para fixar a lamela para o fundo da câmara de perfusão. Nós usamos câmaras de imagem self-made por 10-12 lamelas mm com um pequeno volume, permitindo altas velocidades de perfusão de até troca de buffer de 15 vezes por minuto. Uma câmara de perfusão comercialmente disponível para 18 milímetros lamelas, podem ser adquiridos a partir de Warner Instruments (RC-49FS). Esta câmara também permite estimulação do campo de neurónios.
2. Escolha-se a lamela com as células carregadas com Fluo5N e adicionar uma pequena gota de solução de imagem (50-100 ul) sobre as células para manter as células cobertas com a solução de imagem.Vire a lamela de cabeça para baixo e montar as células na câmara de imagem. Para pressionar a lamela no silício-cola, use um cotonete (por exemplo, Q-tips).
3. Limpe tampão residual da parte inferior da lamela de vidro com cotonetes CUIDADO:. Limpe cuidadosamente a umidade residual quando se usa um objetivo-óleo com alta abertura numérica em alta resolução de imagem. Sal residual é melhor removido pela água. Esfregaço acidental de gordura pode ser retirado com acetona ou etanol puro.
4. Troca da câmara "dummy" de imagem com a câmara de imagem experimental. Lave as células durante 5-10 min de perfusão contínua.
5. Lave as células por 5 - 10 minutos de perfusão contínua.
6. Para a seleção da célula utilizar uma quantidade mínima de iluminação laser, altas taxas de varredura (2-4 Hz), um tamanho pequeno de imagem, e um ganho elevado.
7. ATENÇÃO: Para a seleção das células Fluo5N-rotulados não usar excesso de iluminação de luz ou direto com epifluorescent luz. Iluminação brilhante da Fluo5N/Ca ^{2 +} complexos provoca a perda completa da fluorescência específica-ER dentro de 2-4 segundos (Figura 5).
8. Configure o microscópio de acordo com o experimento planejado. Para orientação, as configurações representativos de imagem com diferentes vectores de TED são dadas na Tabela 1. Para a laser invertido microscopia confocal de varredura, usamos um microscópio Olympus IX81 combinado com um sistema confocal 1000 Fluoview que está equipado com lasers de diodo (473 nm, 15 mW, 559 nm, 20 mW) e um sistema detector espectral.
9. No início do documento experiência as células de interesse por X de alta resolução, pilhas de imagens yz.
10. Realize x, yt imagem para monitorar a dinâmica de cálcio ER sob as condições experimentais específicas. As configurações típicas para o nosso sistema são listados na Tabela 2.
11. Monitorar as alterações no cálcio ER sob perfusão contínua com solução de imagem. Taxas de buffer típicos são exemplarily: (a) lavagem da célula e armazenam-depleção pelo bloco SERCA: 1,5 ml / min, (b), ATP / DHPG estimulação: 3 mL / min.
12. Aquisição de imagens digitais, preferencialmente, com 12 bits (4096 valores de cinza). Para imagens em paralelo de Fluo5N/Ca ^{2 +} e RFP, imagens de 8 bits (256 valores de cinza) pode resgatar o seu sistema de estouro de dados.
13. Armazenar imagens ao vivo de células de série temporal (x, yt) ou pilhas de imagem 3D (x, yz) (para a distribuição celular de ⁺ complexos Fluo5N/Ca ²⁾ em um formato compatível ImageJ (por exemplo, TIFF).

8. Processamento de Imagem e Análise de Dados

1. Abra a pilha de imagens no programa ImageJ. Em caso de multicolor imagens, dividir os canais RGB quando perguntado por ImageJ.
2. Identifique sua região (s) de interesse (ROI) através de um exame cuidadoso das pilhas de imagens (por exemplo, com a ajuda de uma intensidade em função do tempo parcela)
3. Use o plugin Analyzer Time-Series para ler a intensidade média dos pixels em um ROI _(F-primas). Depending de propósito, chamar ROIs em torno ou a ER completo ou pequenas regiões do ER, por exemplo ER de dendritos das células de regiões periféricas. Também incluem 1-3 ROI em áreas sem células para subtração de fundo.
4. Calcule a média de fluorescência de fundo (F _b) através do cálculo do valor de fluorescência média do ROI fundo e subtrair o fundo valor F _b dos valores de _F-primas para obter o valor _roi F.
5. Calcular F _0, que é a fluorescência basal das células, através do cálculo do valor médio de dez a 30 valores fluorescentes para cada ROI em estado de repouso.
6. Calcule as background-corrigidos alterações relativas na fluorescência por Af / F ₀ pela fórmula:

7. Mudanças relativas presentes na fluorescênciance como um traço com Af / F ₀ para o eixo Y e tempo para o eixo-X.

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Resultados

Este protocolo fornece uma abordagem sem interrupções para a imagem direta de livre ER cálcio. Baixa afinidade sintético ^{Ca2 +} indicadores são libertados e preso no lúmen do ER, com a ajuda de um ER alvo, a actividade da enzima esterase recombinante. Melhoria carregamento dos Ca ^{2 +} indicador de corantes para o lúmen ER permite que uma imagem direta e rápida de dinâmicas armazenam cálcio ER.

Tipos de células para TED

A viabilidade do...

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Discussão

As vantagens e desvantagens do método TED foram amplamente discutidas em publicações recentes ^34,35. Em comparação com os outros métodos descritos acima, o TED contorna o problema da interrupção e perfundir as células. Além disso, dois aspectos precisam ser enfatizados. O princípio de TED para ER imagem requer cálcio (1.) A expressão de um alvo carboxilesterase activo no lúmen do ER, com a ajuda de TED construções de vectores e (2.) A libertação eficiente e preferencial de baixa afinidade si...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham's F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.