Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

Resumo

Nós descrevemos um método de microscopia correlativa que combina alta velocidade de microscopia de luz fluorescente de células vivas 3D de alta resolução tomografia crio-eletrônico. Nós demonstrar a capacidade do método dinâmico de imagem por correlativo, as pequenas partículas de HIV-1 que interagem com células HeLa hospedeiras.

Resumo

Tomografia crio-eletrônico (cryoET) permite a visualização em 3D de estruturas celulares com resolução molecular em um estado próximo do fisiológico ^1. No entanto, a visualização directa de complexos virais individuais no seu ambiente celular do hospedeiro com cryoET é um desafio ^2, devido à natureza pouco frequentes e dinâmica de entrada viral, especialmente no caso do VIH-1. Enquanto lapso de tempo de imagem de células vivas produziu uma grande quantidade de informações sobre muitos aspectos do ciclo de ^HIV-janeiro 03-07 de vida, a resolução oferecida por microscopia de células vivas é limitado (~ 200 nm). Nosso trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um método de correlação que permite a visualização direta dos eventos iniciais da infecção pelo HIV-1 pela combinação de microscopia de luz fluorescente de células vivas, crio-microscopia fluorescente e cryoET. Deste modo, os sinais vivo de células e crio-fluorescente pode ser utilizada para orientar a amostragem de precisão cryoET. Além disso, a informação estrutural obtida a partir de cryoET pode be complementado com os dados funcionais dinâmicos adquirida através de imagens ao vivo de células de alvo marcado fluorescente.

Neste artigo de vídeo, nós fornecemos métodos detalhados e protocolos para investigação estrutural do HIV-1 e interações célula hospedeira usando imagens ao vivo de células em 3D correlativo de alta velocidade e análise estrutural cryoET de alta resolução. As células HeLa infectadas com o HIV-1 partículas foram caracterizadas pela primeira vez por microscopia confocal em células vivas, e a região contendo a mesma partícula viral foi então analisado por tomografia crio-electrónica para detalhes estruturais 3D. A correlação entre dois conjuntos de dados de imagem, de imagem óptica e eletrônica de imagem, foi realizada através de microscopia de luz fase crio-fluorescência construídos em casa. A abordagem aqui pormenorizadas serão úteis não só para o estudo das interacções das células do vírus-hospedeiro, mas também para várias aplicações em biologia celular, tais como sinalização, o tráfico de receptor de membrana da célula, e em muitos outros processos celulares dinâmicas. </ P>

Introdução

Tomografia crio-eletrônico (cryoET) é uma técnica de imagem poderosa que permite a visualização tridimensional (3D) de células e tecidos e fornece insights sobre a organização de organelas nativas e estruturas celulares com resolução molecular em um de perto o estado fisiológico ^1. No entanto, a natureza inerentemente não corado de baixo contraste amostra congelada-hidratado, combinada com a sua sensibilidade à radiação, torna difícil localizar áreas de interesse dentro de uma célula e, subsequentemente, realizar a série de inclinação com êxito, sem danificar a zona alvo. A fim de superar estes problemas, uma abordagem que combina correlativo microscopia óptica e electrónica é necessária. Especificidades destacadas por meio de rotulagem fluorescente são identificados e localizado por microscopia de fluorescência de luz, e, em seguida, as suas coordenadas são transferidos para o microscópio electrónico de aquisição de dados estruturais de alta resolução em 3D. Este método correlativo ajuda para localizar o alvo de umreas de interesse a serem abordados. Devido à limitação da espessura da amostra com cryoEM (<300 nm), actualmente apenas as regiões periféricas da célula são adequadas para análise estrutural por CryoET 3D. Reduzindo ainda mais a espessura das amostras congeladas hidratadas por vítreo secção ⁸ ou crio-concentrado feixe de íons (FIB) moagem ⁹ iria expandir a capacidade de imagem correlativa.

Anteriormente, os métodos correlatos foram utilizados principalmente para facilitar a aquisição de dados cryoET para grandes e estática das estruturas ^10-13. Nestes estudos, crio etapas foram implementadas para aceitar grades cryoEM e caber em cada um microscópio vertical ou um microscópio invertido ^10,11,14. Embora a mudança grades parece bastante simples em seus projetos, há adicional de transferência etapas envolvidas para a grade de EM, aumentando a chance de que a grade pode ser deformada, danificada e contaminada. Recentemente, demonstrou um avanço técnico emmicroscopia correlativa que nos permite visualizar diretamente os eventos dinâmicos que são, por natureza, difícil de capturar, como o HIV-1 e as interações da célula hospedeira em estágios iniciais da infecção ^15. Conseguimos isso através da concepção e implementação de um estágio da amostra crio-microscopia de luz que adapta um sistema de cartucho para minimizar os danos espécime devido ao manuseio da rede, facilitando assim a correlação. Nosso projeto inclui um suporte integrado cartucho espécime, permitindo que tanto crio-microscopia de luz e crio-eletrônico a ser realizado, em seqüência, no mesmo suporte da amostra, sem transferência de amostras, agilizando assim o processo correlato. Além disso, também implementado um procedimento de correlação exacta e fiável utilizando esferas de látex fluorescentes como marcadores fiduciais.

Protocolo

1. Cultura de células HeLa em revestido de carbono, EM Localizador Grids ouro

1. Descarga luminescente do lado de carbono de um R2 de 200 mesh / 2 Quantifoil ouro EM localizador grade com menos de 25 mA para 25 seg.
2. Brasão da grade EM com fibronectina, flutuando-lo, do lado do carbono para baixo, em uma gota de 40 mL de 50 mg / ml solução fibronectina, em seguida, desinfectá-lo sob a luz UV por 2 horas em uma capa de cultura de tecidos.
3. As células HeLa placa na grade a uma densidade de 2 x ⁴ 10 células / ml (total de 2 ml de cultura) em uma placa de cultura de vidro de fundo e crescer as células a 37 ° C, com 5% de _CO2, em DMEM suplementado com 4,5 g / L de L-glutamina e glicose, 10% de soro inactivado pelo calor fetal de vitelo, 100 unidades / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, por aproximadamente 18 horas. As células HeLa são infectadas após S / N cultura.

2. HIV-1 e infecção de células imagens ao vivo

1. Adicionar um rastreador celular fluorescente (CMTPX Red, 1 ml / 2 ml) para a cultura com fundo de vidroprato (a partir do passo 1.3) e incubar o prato a 37 ° C durante 10 minutos, para permitir a absorção dos do corante fluorescente.
2. Lavar as células com PBS e adicionar 50 ul de meio fresco pré-aquecido.
3. Coloque o prato sobre a câmara da célula viva, a 37 ° C, de um campo varrido microscópio confocal scanner. Selecione vários campos (10-15 posições) que contêm 1-3 células / quadrados, com as células entre duas fases de mitose quando eles estão mais espalhada e plana (ver Figuras 2C e 2D), pois requer cryoEM regiões relativamente finas do amostra. Guarde estas posições para a imagem futura (passo 2.5).
4. Infectar as células com VSV-G pseudo tipados HIV-1 que contêm partículas de GFP-Vpr (usamos 40 uL de uma amostra contendo 40 ng / ml de p24). Quando a adição das partículas de vírus na parte inferior do prato, ter o cuidado de não perturbar a grade EM, uma vez que as posições para a imagiologia já foram seleccionados e armazenados.
5. Imediatamente após a adição de viriões, recolher time-lapse de alta velocidade imagens confocal 3D, nas posições previamente selecionadas (a partir do passo 2.3) para 20-40 min.
6. Imagens confocal foram adquiridos usando MetaMorph e analisados ​​pelo rastreamento de partículas 3D automatizado para a dinâmica de partículas individuais, utilizando software Imaris (veja a Figura 1). Uma vez que estamos relacionando o comportamento dinâmico de difração limitada HIV-1 com partículas ultra celular, time-lapse de imagens ao vivo de células e de rastreamento de partículas 3D são fundamentais para os resultados. No entanto, para uma estrutura grande e estática, uma imagem de fluorescência simples (sem células viva) seria suficiente para a análise correlativos.

3. Frozen-hidratado EM Preparação de Amostras

Para minimizar o atraso de tempo entre a colheita da última imagem confocal e crio-fixação da amostra, a FEI Vitrobot (ou outro dispositivo de vitrificação) deve ser iniciado e preparado para imersão de congelamento durante a recolha de imagens ao vivo de células de fluorescência confocal.

1. Ligue o dispositivo de vitrificação e definir a sua temperatura ambiente até 22 ° C, a humidade alvo de 100%, o tempo de blotting para 7 seg, e o tempo de espera e tempo para drenar um seg.
2. Coloque a caixa de armazenamento da rede no êmbolo Dewar e preparar etano líquido frio. Monte o Dewar para o dispositivo vitrificação.
3. Imediatamente após imagens de células ao vivo confocal (seção 2), coloque o prato de cultura em um bloco de cobre resfriado e transferi-lo para a sala de preparação de amostras cryoEM. Coloque a grade de EM para a pinça especializados e rapidamente apagar afastado todos os meios de comunicação sobre a grade. O mata-borrão é feito manualmente, com papel de filtro, após o que 4 ul de solução de 15 nm de ouro grânulo misturado com microesferas fluorescentes de 0,2 um é imediatamente colocada na grelha. As contas de ouro são utilizados como marcadores fiduciais para auxiliar a recolha de dados tomográficos e alinhamento. As microesferas fluorescentes são usadas para ajudar correlação entre as imagens fluorescentes e cryoEM (Veja Figuras 2c-2F).
4. Coloque as pinças para o dispositivo de vitrificação e instruir o dispositivo para apagar e mergulhar congelamento em etano líquido ^16. Os parâmetros optimizados blotting para alcançar o melhor resultado são: tempo blot, 7 seg; blot deslocamento, 0; tempo de drenagem, 1 s, a temperatura de 22 ° C, e humidade de 100%.
5. Transferir a grade congelado-hidratado a um detentor cryoEM para imagiologia cryoET imediata, ou para um armazenamento de azoto líquido para posterior utilização do dewar.

4. Cryo-fluorescência Microscopia de Luz

Um sistema de home-built, câmara de amostra crio-fluorescência e fase (Figura 3) é necessária para levar a cabo os passos 4,1-4,10. As especificações detalhadas e descrição da fase pode ser encontrada em junho et al. ^15.

1. Encha um líquido auto-pressurizado nitrogênio Dewar com nitrogênio líquido, pelo menos 2 horas antes de começar a microscopia de luz crio-fluorescência (ver Figura 3A).
2. Montar uma homebuilt crio-ffase de amostra luorescence ¹⁵ (Figura 3) num microscópio de fluorescência invertida de luz, tal como uma Olympus IX 71.
3. Ligação a entrada de azoto líquido da fase de crio-amostra ao Dewar auto-pressurizado e colocar a tomada de protecção de sobrecarga de azoto líquido para um recipiente adequado. Conecte uma linha de gás nitrogênio seco a uma luva colocada sobre a lente objetiva manter a lente quente e livre de geada.
4. Depositar uma plataforma de bloco de cobre (seta preta na Figura 3b) para a câmara de-fase de crio para o carregamento da grelha amostra congelada-hidratado. Esfriar e encha a câmara de estágio crio cobre com nitrogênio líquido através da linha de entrada da auto-pressurizado Dewar enchimento.
5. Quando o estágio crio atinge a temperatura de nitrogênio líquido (em ~ 4-6 min), a transferência de caixa de armazenamento da rede (a partir do passo 3.5) para o estágio crio.
6. Coloque a grade de amostra congelada hidratado no cartucho espécime EM sobre o bloco de cobre e clipe da glivrar no local usando um anel C (se estiver usando um cartucho de microscópio Polara), ou colocar um anel de cobre pré-arrefecido na parte superior (seta preta na figura 3d), para manter a grade no lugar e também para facilitar a recuperação da rede após imagem crio-fluorescência (se, por um não-Polara microscópio crio-eletrônico).
7. Coloque o cartucho (a partir do passo 4.6) na câmara interior do crio-fase (seta branca na Figura 3b).
8. Procurar e encontrar as mesmas partículas virais a partir dos dados de imagem em células vivas. Desde a grade EM tem um índice, é fácil de localizar a mesma partícula no grid em ambas as imagens de células ao vivo e imagens de crio-florescence.
9. Adquirir crio-DIC e imagens GFP nas posições identificadas de acordo com crio-condição, utilizando um microscópio de luz com um longo trabalho (2,7-4 mm) lente objetiva. Durante a imagem crio-fluorescência, verificar periodicamente o nível de nitrogênio líquido no estágio crio e recarregá-lo, se necessário, para manter a fase de amostra abaixo -170° C.
10. Após a conclusão da imagiologia crio-fluorescência, cuidadosamente devolver o cartucho de amostra até a plataforma de bloco de cobre e armazenar o cartucho num vaso Dewar de azoto líquido para análise futura cryoET com um sistema Polara. Se estiver usando um não-Polara microscópio crio-eletrônico, retire o anel de cobre, recuperar a malha amostral, coloque-o em uma caixa de armazenamento de rede, e armazenar a amostra em nitrogênio líquido Dewar até que a amostra é analisada por cryoET.
11. Para a análise de dados, se sobrepõem os crio-DIC e GFP imagens obtidas a partir do passo (4.9, ver figura 4b) e correlacionar as posições dos sinais de GFP na imagem crio-fluorescência com aqueles obtidos na série de imagens ao vivo de células.

5. Cryo-elétron Tomografia

1. Coloque o cartucho de amostra para a estação de um microscópio eletrônico equipado com uma arma de emissão de campo, como Polara G2 microscópio crio-transferência.
2. Em modo de baixa-dose-pesquisa com uma ampliação de 140X, identify e salvar as quadrículas associadas (a partir do passo 4.11) em um arquivo de palco.
3. Sob o modo de baixa dose busca em uma ampliação de 3.500 X, insira um 100 mM objetivo abertura, busca e salvar todos os cargos correlacionados com sinais GFP em um segundo arquivo de palco.
4. Sob o modo de baixa dose de exposição, encontrar uma área em branco para ajustar a intensidade do feixe a uma dose de 1 ou 2 e ^- / a ² e refinar o eixo de inclinação, usando a função y palco, pela queima de longe o gelo em uma região de carbono sem importância com várias contas de ouro.
5. No modo de baixa dose de focagem, ajuste a distância focal para ~ 3 mM e ajustar o ângulo de alinhamento da direcção do foco a ser paralelo ao eixo de inclinação.
6. Sob o modo de baixa dose-pesquisa, lembre-se posições salvas (a partir do passo 5.3), ajuste a altura eucentric amostra e verificar a faixa de inclinação para a área de interesse. Adquirir uma imagem de projeção com muito baixa dose de elétrons (~ 1 e ^- / a ²⁾ entre 8 e 10 um desfocagem, em exposiçõesmodo ure, para confirmar as partículas do vírus correlatos para tomografia crio-eletrônico.
7. Mude para o modo de baixa dose-foco. No menu de funções de auto TEM, preceder a altura eucentric automatizada e concentrar funções na área do foco.
8. Configurar os parâmetros para a aquisição de uma série de inclinação. Para Figura 4 neste artigo, ângulos de inclinação variando ± 70 °, abaixo e acima de 45 °, a 3 ° e 2 ° de inclinação incrementos, respectivamente, foram utilizados, com 6 um desfocar e aproximadamente 70 e ^- / uma dose de ² total.
9. Repita os passos 5.7 e 5.8 para todos os cargos salvos. Batch tomografia software pode ser utilizado para a recolha automática de dados em múltiplas posições para aumentar o rendimento.

6. Reconstrução tridimensional usando IMOD ¹⁷

1. Inspecione a série tilt-prima para ajustar os valores mínimos e máximos de densidade e determinar se há qualquer ponto de vista a ser excluído devido à mudança de imagem grande.
2. Comece eTomo e painel tomogram configuração usando o tipo de eixo, tamanho do pixel, diâmetro fiducial, etc. Em seguida, crie pt scripts.
3. Configurar o intervalo principal de tal forma que várias fases do cálculo tomogram pode ser ajustado / seguido simultaneamente. Modificar os parâmetros necessários e executar os programas específicos que são exigidos por cada etapa de processamento (Veja eTomo tutorial, http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
4. Na fase final, criar uma pilha alinhada completo (com uma média de erro residual inferior a 0,6) e reconstruir tomografias utilizando um algoritmo de projecção de trás ponderada em IMOD.
5. DeNoise áreas potenciais de interesse utilizando um programa de reforço da borda de difusão anisotrópica não linear implementado em 3D IMOD com parâmetros apropriados para aumentar o contraste e clareza.

Resultados

Para caracterizar o comportamento dinâmico das partículas de vírus, as células HeLa infectadas com o HIV-1 foram visualizados por meio de microscopia confocal de células vivo de alta velocidade e os movimentos das partículas foram analisadas por rastreamento automatizado de partículas 3D (Figura 1). Para evitar que o lapso de tempo de vários minutos, que pode ocorrer entre a colheita da última imagem ao vivo de células confocal e de imersão de congelação (o que pode ser suficiente para perd...

Discussão

Nós apresentamos um conjunto simples de protocolos para fornecer uma abordagem correlativa avançada para analisar eventos celulares dinâmicos usando time-lapse imagens de fluorescência confocal, em células vivas seguido por cryoET. Nosso desenvolvimento metodológico para correlacionar a imagem ao vivo de células em 3D com alta resolução cryoET é fundamental para investigar muitos problemas biológicos desafiadoras, tais como a visualização, dinâmico (não estático, como relatado anteriormente), e difraçã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine	Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA	12-604F
Fibronectin	Sigma, St. Louis, MO	F1141-1MG	HeLa cell culture on EM grids
Cell tracker	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	C34552	Red CMTPX
Protein A gold conjugates	Ted Pella, Inc., Redding, CA	15822-1	15 nm diameter
0.2 μm fluorescent microspheres	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	F8811	Yellow-green fluorescent
Heat-inactivated fetal calf bovine serum	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	10082-139
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	15140-122
Glass-bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Gold quantifoil finder EM grids	Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany	R2/2 Au NH2 200 mesh
PBS	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	70011-044
Equipment
Glow-discharge device 100X	EMS, Hatfield, PA
Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun	FEI, Hillsboro, OR		300 keV
Vitrobot Mark III	FEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 microscope	Olympus America Inc., Center Valley, PA		LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens
Nikon TiE microscope	Nikon Instruments, Melville, NY		using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens
Sweptfield confocal microscope	Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit live cell chamber	Tokyo, Japan
Cryo-fluorescence sample stage	Home-made		Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.