Determinação da Microbial Extracelular Enzyme actividade nas águas, solos e sedimentos, utilizando alta taxa de transferência de microplaca Ensaios

Resumo

Procedimentos em microplacas são descritos para a análise colorimétrica ou fluorimétrica da atividade da enzima extracelular. Estes procedimentos permitem o rápido ensaio de tal atividade em um grande número de amostras ambientais dentro de um prazo administrável.

Resumo

Grande parte da ciclagem de nutrientes e processamento de carbono em ambientes naturais ocorre através da atividade de enzimas extracelulares produzidos por microorganismos. Assim, a medição da atividade dessas enzimas extracelulares pode dar insights sobre as taxas de processos de nível do ecossistema, como a decomposição da matéria orgânica ou de azoto e de mineralização do fósforo. Os ensaios de actividade da enzima extracelular em amostras ambientais tipicamente envolver a exposição das amostras de substratos colorimétricos ou fluorométricos artificiais e rastreando a taxa de hidrólise do substrato. Aqui nós descrevemos os métodos em microplacas para estes procedimentos que permitem a análise de um grande número de amostras dentro de um curto espaço de tempo. As amostras são deixados reagir com substratos artificiais dentro microplacas de 96 poços ou de poço profundo blocos de microplacas, e a actividade da enzima é subsequentemente determinada por absorção ou fluorescência do produto final resultante utilizando uma microplaca Reade típicor ou fluorímetro. Tais procedimentos de alto rendimento não só facilitar as comparações entre os locais ou ecossistemas espacialmente separadas, mas também reduzir substancialmente o custo de tais ensaios, reduzindo os volumes totais de reagentes necessários por amostra.

Introdução

Os microrganismos, tais como bactérias e fungos obter nutrientes e de carbono a partir de compostos orgânicos complexos, através da produção de enzimas extracelulares. Estas enzimas normalmente hidrolisar polímeros em subunidades menores que podem ser tomadas para a célula. Portanto, a nível ecológico, estas enzimas extracelulares microbianos são responsáveis ​​por grande parte da mineralização de nutrientes e decomposição da matéria orgânica, que ocorre em ambientes naturais. Enzimas tais como celobiohidrolase (CBH) e β-glucosidase são importantes para a degradação da celulose e do trabalho em uníssono para catalisar a hidrólise da celulose em glicose ^1,2, o que proporciona um substrato de carbono utilizáveis ​​para a absorção e assimilação microbiana. A fosfatase enzima libera grupos fosfatos inorgânicos solúveis de organofosforados, essencialmente mineralização de fosfato e tornando-o disponível para uso pela maioria dos organismos ^3. Outros enzimas, tais como a N-acetilglucosaminidase (NAGase), são important na degradação da quitina e pode fazer tanto carbono e nitrogênio disponível para aquisição microbiana ^4.

Um dos procedimentos para o ensaio da atividade enzimática extracelular microbiana em ambientes naturais é o uso de p-nitrofenil artificial (p NP) substratos ligados, uma abordagem que foi originalmente desenvolvido para detectar a atividade da fosfatase do solo ^5. Esta abordagem baseia-se na detecção de um produto final colorido, p-nitrofenol, o qual é libertado, quando o substrato artificial é hidrolisado pela enzima apropriada. O p-nitrofenol pode ser subsequentemente quantificados colorimetricamente através da medição da sua absorvância de cerca de 400-410 nm. Este método já foi utilizada para a detecção de outras enzimas tais como a NAGase ^6, e tem sido utilizado em vários estudos procurando a actividade enzimática extracelular microbiana no solo e nos sedimentos ^7-9.

Uma abordagem alternativa que era originally desenvolvido para avaliar a actividade de glicosidase extracelular em ambientes aquáticos ^10,11 faz uso de 4-metilumbeliferona (MUB) substratos ligados. O produto final libertada (4-metilumbeliferona) é altamente fluorescente e pode ser detectada usando um fluorómetro, com uma configuração de excitação / emissão em torno de 360/460 nm. Uma variedade de substratos artificiais MUB-ligadas estão disponíveis, permitindo a medição fluorométrico da actividade de, pelo menos, como muitas enzimas (por exemplo, β-glicosidase, celobiohidrolase, Nagase, fosfatase), como pode ser testada utilizando o procedimento colorimétrico NP-substrato p. Outras enzimas extracelulares microbianos, tais como a leucina-aminopeptidase proteína-degradante, pode ser ensaiada fluorometricamente utilizando 7-amino-4-metilcumarina (COU) substratos ligados. Ambos MUB-e substratos COU-ligados foram utilizados para determinar a actividade da enzima em diferentes amostras terrestres e aquáticos ^12,13.

Embora estudos anteriores têm described microplaca fluorométrica ou colorimétrico abordagens para determinar a atividade da enzima extracelular ^14, há uma necessidade de uma apresentação clara de como conduzir tais ensaios. Aqui demonstramos procedimentos para a realização de técnicas de alto rendimento de microplacas para a análise da atividade da enzima extracelular em solos e sedimentos, utilizando a abordagem de substratos ligados ao NP p colorimétrico e em águas naturais usando o MUB fluorescente ligada técnica substratos. Nós nos concentramos na medição das atividades de β-glicosidase, NAGase e fosfatase como essas enzimas pode ser amarrado ao carbono, nitrogênio, fósforo e ciclismo, respectivamente. No entanto, os processos descritos aqui podem ser aplicados para a medição de outras enzimas extracelulares usando diferentes substratos artificiais.

Protocolo

Colorimétrico Análise da atividade da enzima extracelular em solos e sedimentos

1. Preparação do Substrato e Soluções Tampão de Análises colorimétrica de atividade enzimática

1. H preparar 50 mM de tampão de acetato (pH 5,0-5,5) por mistura de 50 ml de 0,1 M de ácido acético (2,87 ml de ácido acético glacial em 500 ml de água), 150 ml de 0,1 M de acetato de sódio, e 200 ml de água destilada ₂ O. Ajustar o pH para 5,0-5,5 com ácido acético 0,1 M, se necessário.
2. Prepara-se uma solução de hidróxido de sódio 1 M (NaOH), em _H2O destilada
3. Preparar soluções de substrato ligado ao NP p em 50 mM de tampão acetato. Para ensaiar fosfatase preparar p NP-fosfato 5 mM em 50 mM de tampão de acetato, para ensaiar β-glicosidase preparar 5 mM de p-NP β-glucopiranósido; para ensaiar NAGase preparar 2 mM de pNP-β-N-acetylglucosaminide. Prepare todas as soluções de substrato em estéreis 15 ml ou 50 ml tubos de centrífuga. As soluções podem ser armazenadas a 4 ° C durante 2-3 semanas.

2. Determinação de um padrão para converter Absorbance para p NP Concentração

1. Prepare soluções padrão de p-nitrofenol em 50 mM de tampão de acetato. Concentrações devem variar 0,025-1 mM.
2. Transferência de três repetições de 100 ul de cada concentração de um de 96 cavidades de microplacas claro. Adicionar 10 ul de NaOH 1 M e 190 ul de _H2O destilada a cada poço.
3. Ficha de absorção a 410 nm utilizando um leitor de microplacas.
4. Concentrações multiplicam na curva padrão de 0,3 para obter ^ moles NP p por 300 mL de volume de reação. Traçar uma curva de absorção versus mole de p NP. A inclinação da curva serve como o factor de conversão (C) que se relacionam absorvância a umole de p NP em cada reacção enzimática.

3. Conduzir o ensaio enzimático

1. Para o solo, preparar uma pasta de cada amostra a ser ensaiada em um tubo de centrífuga de 15 ml estéril a uma concentrção de cerca de 1 g / ml ^-1 usando 50 mM de tampão de acetato. Para sedimentos, adicionar tampão acetato suficiente para fazer a pasta facilmente pipettable. O volume exacto de pasta necessária irá variar de acordo com o número de enzimas testadas, mas recomenda-se um mínimo de 5 ml. Vortex cada pasta até que todos os pedaços de solo ou sedimento se dispersaram e anote o volume final.
2. Re-vórtice cada lama e pipetar imediatamente 150 pi em cada um de seis poços em um bloco de 96 poços deepwell (Figura 1). É importante vórtice completamente e frequência, a fim de manter as partículas do solo em suspensão. Deixar pelo menos duas cavidades por bloco vazio para servir como um controle de substrato. Nota: o clipe de fim de pontas de pipeta com uma tesoura antes de pipetar como suspensões de solo tendem a obstruir dicas. Preparar um bloco de 96 poços para cada enzima a ser testada.
3. Deita aproximadamente 5 ml de tampão de acetato de dentro de um reservatório de pipeta e usar um pipetador de 8 canais para adicionar 150 ul do tampão para o last dois poços de cada amostra (estes serão controlos de tampão da amostra) e as duas cavidades de controlo de substrato (Figura 1)
4. Despeje a cerca de 10 ml da solução apropriada de substrato p-NP para um reservatório de pipeta e usar um pipetador de 8 canais para adicionar 150 ul da solução de substrato para os primeiros quatro poços de cada amostra e as duas cavidades de controlo de substrato (Figura 1). Observe o tempo que a reação começa assim que é adicionado à solução de substrato.
5. Incubar as placas a temperatura ambiente (22 ° C) durante 0,5-4 h. Tempo de incubação exacta vai variar dependendo do nível de actividade em amostras e a enzima a ser testada. Para a maioria dos solos e sedimentos, fosfatase e β-glicosidase requerem tempos de incubação de 0,5-1,5 h, enquanto NAGase e outras enzimas requerem tempos de incubação de> 2 horas.
6. Enquanto ensaios estão incubando preparar claro microplacas de 96 poços de ler absorbância. Prepare uma microplaca para cada bloco deepwell (ou seja, para cada enzyme ensaiada). Pipetar 10 ul de NaOH 1 M e 190 ul de água destilada em cada poço da microplaca. Nota: NaOH retarda a reacção enzimática e eleva o pH o que melhora a cor da p NP libertado durante a reacção.
7. Após a incubação, centrifugar os blocos de 96 poços a 2.000-5.000 x g durante 5 min para sedimentar as partículas do solo.
8. Usar uma pipeta de canais múltiplos para retirar 100 ml de cada cavidade, tendo o cuidado de evitar a pelota, e transferi-la para a cavidade correspondente no preparado claro microplaca de 96 poços.
9. Ligue o leitor de microplacas e configurar qualquer software necessário. Ficha de absorção a 410 nm. Se a absorção de um bem determinado for superior ao limite de detecção linear do leitor de placas, que bem diluir 1:1 com água e re-medida. Se a absorvância é ainda demasiado elevado, o ensaio deve ser repetido com um tempo de incubação mais curto.

4. Determinação da Massa Seca das Amostras

1. Pipete 1 mL de cada sampl e lama em uma panela de alumínio previamente pesado.
2. A seco em um forno de secagem de 75 ° C durante 48 horas e pesar. Subtrair o peso do recipiente a partir deste valor para obter a massa seca de solo ou de sedimento em 1 ml de suspensão. Multiplicar por um factor de 0,15 para determinar a massa seca da amostra em 150 ul adicionados a cada cavidade no ensaio de enzima.

5. Cálculo da atividade enzimática por Massa Seca de solo ou sedimento

1. Calcular absorvância final de cada amostra subtraindo a absorvância da amostra de controlo a partir da absorvância da amostra de ensaio. Se os controles de substrato têm alta absorção (cerca de> 0.060), em seguida, subtrair aqueles também.
2. Calcular a actividade da enzima em mole hr ^-1 g de massa seca ^-1 a partir da equação:

A atividade da enzima = / (massa C x tempo de incubação x amostra seca) absorção final

Análise fluorescente da atividade da enzima extracelular em Águas Naturais

tle "> 1. Preparação de substrato, Standard e Soluções Tampão para análises fluorométricos de atividade enzimática

1. Preparar 200 uM soluções de substratos MUB-ligados (por exemplo, 4-MUB-β-glucopiranósido, 4-MUB-fosfato, 4-MUB-N-acetil-β-D-glucosaminida) por dissolução do substrato apropriado na estéril (autoclavado) destilada H ₂ O em estéreis 15 ml ou 50 ml tubos de centrífuga. Enrole tubos em papel de alumínio para excluir a luz e armazenar na geladeira antes de usar. Os substratos devem ser estáveis ​​durante pelo menos 1 semana se armazenada desta maneira.
2. Prepara-se uma norma MUB fazendo uma solução de estoque de 100 mM de 4-metilumbeliferona em estéril _H2O destilada Loja refrigerado em âmbar ou garrafa embrulhada em papel alumínio. Imediatamente antes do uso, dilui-se a solução de estoque 100 mM por 1/10 em H ₂ O estéril para fazer uma solução de trabalho de 10 pM para os ensaios enzimáticos.
3. Prepara-se uma solução de reserva de tampão de bicarbonato a 100 mM por dissolução de 8,4 g de NaHCO _{3 em 1 LH 2 O e autoclavagem. Dilui-se esta solução de reserva de 1/20 em H 2 O estéril conforme necessário para produzir uma solução de trabalho de 5 mM para os ensaios enzimáticos.}

2. Organizar amostras de água em uma Preto microplacas de 96 poços

1. Organizar uma microplaca para cada enzima, seguindo o exemplo mostrado na Figura 2. Note-se que para permitir a replicação adequada, os padrões e os controlos, este processo pode-se testar a actividade de uma enzima única para até nove amostras de água sobre uma microplaca de 96 poços preta.
2. Deita aproximadamente 5 ml da primeira amostra para um reservatório de pipeta e usar um pipetador de 8 canais para pipette200 ul em todos os poços na coluna 1 da microplaca (s). Descarte as pontas de pipeta usados ​​e repita conforme necessário para cada amostra de água para encher colunas 1-9.

3. Configuração de Amostra, Padrão, Quench e Controles de substrato

1. Estabelecer controles para explicar amostras, padrãos, substrato e têmpera na mesma microplaca preta como as amostras (Figura 2).
2. Controlos exemplo contêm água da amostra e tampão de bicarbonato, e não são utilizados para os cálculos de actividade mas irá demonstrar leitura consistência ao longo do curso do experimento. Os controlos consistem de têmpera de água da amostra e uma quantidade padrão de marcação fluorescente e são usados ​​para medir a fluorescência de difracção em água da amostra. Substrato e controlos padrão são feitas de tampão ou ligada ao substrato ou a etiqueta fluorescente padrão, respectivamente, e bicarbonato.
3. Despeje cerca de 5 ml de 5 mM de tampão bicarbonato em um reservatório pipeta limpa. Pipetar 50 ul de tampão para poços de 1 a 9, em linhas D e E, para formar dois replicar poços de controlo de amostra por amostra. Dicas Mudança de pipetas, em seguida, transferir 200 mL de tampão bicarbonato de poços de 10 a 12 em linhas A e H.
4. Reduza a iluminação do ambiente, escurecendo ou desligar lights como o padrão fluorescente é sensível à luz.
5. Despeje a cerca de 5 ml de 10 mM de 4-metilumbeliferona num reservatório pipeta limpa. Pipetar 50 mL em poços de 1 a 12 na Linha H, e em poços de 1 a 9 em linhas G e F para formar três repetições de controles de têmpera por amostra e controles globais padrão. Ou colocar a microplaca no escuro ou cobrir com uma tampa opaca para reduzir a degradação de luz MUB.
6. Ligue o fluorímetro e set-up de qualquer software necessário para estar pronto para ler antes de adicionar o substrato. Nota: algumas lâmpadas fluorómetro pode exigir um tempo de aquecimento de 3 min ou mais.
7. Deita aproximadamente 5 ml de substrato MUB ligada apropriado (por exemplo, 4-MUB-fosfato) para um reservatório de pipeta limpa. Use uma pipeta de 12 canais de pipeta 50 ul em poços de 1 a 12 na linha A, e em poços de 1 a 9 em linhas B e C para formar três ensaios de réplicas para cada amostra e três controles de substrato. Immediately avançar para o passo 4.1, fluorescência de gravação.

4. Gravação de fluorescência

1. Ler a fluorescência inicial imediatamente após a adição do substrato para a microplaca. Após a leitura de fluorescência, incubar a microplaca à temperatura ambiente (22 ° C), quer no escuro ou coberta com uma tampa opaca para reduzir a degradação pela luz do MUB.
2. O tempo de incubação necessário para medir a actividade da enzima potencial máximo em uma amostra de água dependerá da concentração de enzima na amostra. Uma vez que este efeito é desconhecido antes do ensaio está completado, a microplaca terá de ser lida a vários intervalos de tempo. Tipicamente, a leitura em intervalos de 10-15 minutos ao longo de 1 hora é aceitável para muitas enzimas, embora as amostras com actividade muito elevada para certos enzimas pode pico antes de 10 min.
3. Continuar a leitura de fluorescência na microplaca a seus intervalos designados para, pelo menos, 1 hora. Certifique-se de manter a microplaca cobertos ou no escuro entre a leituras.

5. Cálculo da atividade da enzima por volume de água

1. Para cada amostra em cada intervalo de tempo calcular as: média de fluorescência da amostra inicial (poços D e E), a fluorescência da amostra média final (poços AC), a média de fluorescência padrão (poços H10-11), ea média de saciar controle de fluorescência (poços FG).
2. Para cada intervalo de tempo, calcular a actividade enzimática em nmol hr ^{-1 -1} ml a partir da equação:

A atividade da enzima = (média de fluorescência da amostra - média de fluorescência da amostra inicial) / ((média padrão de fluorescência / 0,5 mol) x (média saciar controle de fluorescência / média padrão de fluorescência) x (0,2 ml) x (tempo em horas))

3. Examine os valores de atividade calculados para cada passo de tempo. Determinar a actividade potencial final a partir do intervalo de tempo com a actividade mais elevada. Se os valores de atividade continuam a aumentar, em seguida, podem ser necessários passos de tempo mais tarde, se valores de atividade cair throughout o curso da execução, em seguida, executar novamente com passos mais curtos. Atividade final é em nmol de substrato consumido hr ^{-1 -1} ml, mas pode ser ampliado para expressar como ^ moles hr ^-1 L ^-1.

Resultados

Solos e sedimentos aquáticos têm tipicamente níveis apreciáveis ​​de actividade da enzima extracelular, como resultado de comunidades microbianas acoplados (biofilmes) que crescem na superfície das partículas. Figura 3 mostra como esta actividade muda dependendo do tamanho das partículas obtidas a partir da superfície do sedimento de um terceiro fluxo de ordem no norte Mississippi, EUA. Um estudo anterior demonstrou que as comunidades bacterianas em partículas de sedimentos deste fluxo pode...

Discussão

Determinar a atividade de uma variedade de enzimas extracelulares microbianas em solos e sedimentos pode fornecer informações úteis sobre as taxas de mineralização de nutrientes e processamento de matéria orgânica ^17. No entanto, os solos podem variar em seus níveis de umidade, por isso é importante para padronizar a atividade de peso seco de solo. Isso requer uma etapa de secagem adicional (normalmente de dois dias) além de simplesmente medir a atividade da enzima. Assim, em contraste com os ensaio...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid			Various suppliers
Sodium acetate			Various suppliers
Sodium hydroxide			Various suppliers
p-Nitrophenol	Fisher	BP612-1	Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate	Sigma	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide	Sigma	N9376	pNP-substrate
Clear 96-well microplates	Fisher	12-563-301	Alternates available
96-well deep well blocks	Costar	3958	Alternates available
Aluminum weigh pans			Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes			Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes			Various suppliers
4-Methylumbelliferone	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate	Sigma	M8883	MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide	Sigma	M2133	MUB-substrate
Sodium bicarbonate			Various suppliers
Black 96-well microplate	Costar	3792
Pipette reservoir			Various suppliers
EQUIPMENT
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge rotor	Eppendorf	A-4-81	For microplates/deep-well blocks
Microplate reader	BioTek	Synergy HT	Alternates available
Microplate fluorometer	BioTek	FLx 800	Alternates available
8-channel pipettor			Various suppliers