Rápidas alto rendimento amilose Determinação em amostras liofilizadas tubérculo

Resumo

Este protocolo descreve um elevado através do método colorimétrico de colocar que se baseia na formação de um complexo entre o iodo e cadeias de moléculas de glucose em amido. Iodo forma complexos com tanto amilose e amilopectina em longas cadeias. Após a adição de iodo a uma amostra de amido, o máximo de absorção de amilose e amilopectina ocorre a 620 e 550 nm, respectivamente. A proporção de amilose / amilopectina pode ser estimada a partir da razão dos valores de absorvância de 620 e 550 nm e comparando-os com uma curva padrão em que as concentrações específicas conhecidas são traçados em função de valores de absorção. Esta alta taxa de transferência, método barato é confiável e reprodutível, permitindo a avaliação de grandes populações de clones de batata.

Resumo

Este protocolo descreve um elevado através do método colorimétrico de colocar que se baseia na formação de um complexo entre o iodo e cadeias de moléculas de glucose em amido. Iodo forma complexos com tanto amilose e amilopectina em longas cadeias. Após a adição de iodo a uma amostra de amido, o máximo de absorção de amilose e amilopectina ocorre a 620 e 550 nm, respectivamente. A proporção de amilose / amilopectina pode ser estimada a partir da razão dos valores de absorvância de 620 e 550 nm e comparando-os com uma curva padrão em que as concentrações específicas conhecidas são traçados em função de valores de absorção. Esta alta taxa de transferência, método barato é confiável e reprodutível, permitindo a avaliação de grandes populações de clones de batata.

Introdução

Cerca de 80% do peso fresco de um tubérculo da batata é água; quase toda a matéria seca remanescente é de amido ^1. A maior parte do amido (70%) é composto de amilopectina, enquanto que o restante é amilose. A relação entre a amilose e amilopectina é a propriedade mais importante que influencia as propriedades físicas do amido. Amilose é um alfa 1-4 cadeia glicose linear, enquanto a amilopectina é uma cadeia alfa 1-4 linear com alfa 1-6 ramos ^2. Métodos tais como iodo de ligação, calorimetria diferencial de varrimento (DSC), cromatografia de exclusão de tamanho de elevado desempenho (HPSEC) e concanavalina A interacções têm sido desenvolvidos para a determinação de amido em diferentes espécies de plantas ^3,4. Cada protocolo requer habilidades e equipamentos especiais, o que torna difícil para escalar até quantificar numerosas amostras de cada vez. O método que apresentamos aqui é um protocolo modificado de Hovenkamp-Hermelink et al. ^5, que é uma associação de iodo comprimento de onda duplométodo baseado em grânulos de amido coradas. As vantagens deste método em relação a outras incluir a determinação do teor de amilose de amido em bruto sem purificação e a utilização do sistema de duplo comprimento de onda para aumentar a precisão do método ^4,6.

Protocolo

1. Determinação de amilose de batata Tuber Amido

1. Descasque e corte os tubérculos frescos em cubos pequenos.
2. Coloque cubos de batata em pequenos sacos castanhos e armazenar durante a noite a -80 ° C.
3. Transfira os cubos de batata para sacos de nylon e por liofilização.
4. Depois de liofilizado, moer a amostra de batata em pó utilizando almofariz e pilão ou um Wiley Mill.
5. Num tubo de 50 ml, adicionar 20-30 mg da, amostra tubérculo solo seco por congelação.
6. Prepara-se uma solução de 45% (w / v) de ácido perclórico (misturar 24,4 ml de ácido perclórico a 60% e 25,6 ml de água ultra-pura.
7. Adicionar 500 mL de 45% (w / v) de ácido perclórico e agitar ou agite-a para dispersar os grânulos de amido.
8. Após um período de incubação de quatro minutos à temperatura ambiente, adicionar 16 ml de água ultra-pura a solução e misturar por vortex.
9. Depois que o material não solúvel tem assentado no fundo do tubo (7-10 minutos mais tarde), a transferência de 40 mL da solução a uma placa de microtitulação (evitando a pipetagem de quaisquer partículas).
10. Adicionar 50 ul de solução de iodo (2 g de KI e 1 g de I ₂ por 900 ml de água ultra-pura) e misturar a amostra por pipetagem.
11. Ler a absorvância a 550 nm e 620 nm imediatamente.
12. Determinar a percentagem de amilose depois de comparar a proporção de amilose / amilopectina de cada amostra (620 nm/550 nm de absorvância) com uma curva padrão gerada a partir de amilose e amilopectina soluções a uma gama de concentrações. Este procedimento será descrito a seguir. Leia a (solução de iodo e ácido perclórico) em branco juntamente com as amostras de teste. Use apagado dados para as análises.

2. Amilose / amilopectina Curve

1. Em tubos separados pesa 12,5 mg de teor de amilose e de amilopectina de 12,5 mg.
2. Adicionar a cada tubo 5 mL de 45% (w / v) de ácido perclórico e dissolver completamente.
3. Para cada uma das soluções (amilose e amilopectina) e levar a um volume final de 50 ml com água ultra-pura.
4. Misture 6,25ml de estoque de amilose da etapa anterior com 18,75 ml de água ultra-pura. Isso fará com que uma solução de amilose 6,25 mg / ml.
5. Repetir o procedimento para a solução de amilopectina.
6. Usando o teor de amilose e amilopectina soluções padrão a partir de passos 2.4 e 2.5, preparar os padrões de amilose por cento que são 0-100% de amilose (100-0% de amilopectina) com um volume final de 5 mL para criar a curva padrão em intervalos de 10%.
   Por exemplo, para se preparar:
   A amilose / amilopectina padrão de 100% a 0%, pipeta de 5 ml de solução de amilopectina.
   A amilose / amilopectina de 90% norma 10%, 0,5 ml de combinar amilose e 4,5 ml de soluções de amilopectina.
   A amilose / amilopectina padrão de 80% a 20%, misture 1,0 ml de amilose e amilopectina 4,0 ml de soluções.
   A amilose / amilopectina de 70% norma 30%, 1,5 ml de combinar amilose e 3,5 ml de soluções de amilopectina.
   A amilose / amilopectina de 60% norma 40%, 2,0 ml combinar amilose e 2,0 ml de soluções de amilopectina.
   O teor de amilose de 50%/ 50% de amilopectina padrão, combinar 2,5 ml de amilose e amilopectina com 2,5 ml de soluções.
   A amilose / amilopectina de 40% norma 60%, 3,0 ml combinar amilose e amilopectina de 2,0 ml, e assim por diante).
7. Transferir 40 uL de cada mistura de padrão para uma placa de microtitulação. Incluir um poço com 40 uL de 45% (w / v) de ácido perclórico como o branco.
8. Adicionar 50 ul de solução de iodo (2 g de KI e 1 g de I ₂ por 900 ml de água ultra-pura) e misturar cada amostra (incluindo a branco) por pipetagem.
9. Ler as absorvâncias a 550 nm e 620 nm imediatamente e calcular a proporção de amilose / amilopectina, para cada concentração.

Resultados

A curva padrão construída a partir de dados inibidas de soluções de concentração de amilose / amilopectina diferentes mostra proporções aproximadas de absorvância entre 0,7 e 1,6 (Tabela 1). Uma linha de tendência de regressão linear a partir destes dados é utilizada mais tarde para inferir o teor de amilose no liofilizadas amostras de batata (Figura 1).

O ambiente de produção da planta tem algum efeito sobre o teor de amilose do tubérculo

Discussão

Teor de amilose em tubérculos de batata geralmente varia de 20-35% ^7,8. Se a maioria dos valores estão do lado de fora deste intervalo, considerar estes erros possíveis: 1) Os dados brutos foram usados ​​em vez de dados inibidas para a construção da curva padrão de amilose / amilopectina, 2) Os dados brutos foram usados ​​em vez de dados inibidas para a determinação do teor de amilose / proporções de amilopectina das amostras de batata, ou 3) a água utilizada para a análise não foi sufici...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Amylose	Sigma	859656
Amylopectin	Sigma	A8515
Perchloric Acid 60%	Sigma	311413	Very hazardous to skin and eyes
Iodine	Sigma	23214TD
Potassium iodide	Sigma	08625JE
Equipment
Plate Reader	Bio Tek	ELx800