4D Multimodalidade de imagens de<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecções em Ratos

Resumo

De imagem multi-modalidade é uma abordagem útil para estudar a colonização bacteriana em modelos de animais pequenos. Este protocolo descreve a infecção de camundongos com bioluminescente Citrobacter rodentium Eo acompanhamento longitudinal de colonização bacteriana usando luz difusa tomografia 3D composto com μCT imagens para criar um filme 4D de C. rodentium Infecção.

Resumo

Este protocolo descreve os passos necessários para monitorar longitudinalmente uma infecção bacteriana bioluminescente utilizando luz difusa tomografia composto 3D integrado com μCT (DLIT-μCT) ea posterior utilização dos dados para gerar um filme de quatro dimensional (4D) do ciclo de infecção. Para desenvolver os filmes de infecção 4D e para validar a imagem DLIT-μCT para estudos de infecção bacteriana utilizando um IVIS Spectrum CT, usamos a infecção com bioluminescente C. rodentium, o que faz com que a auto-limitante colite em ratos. Neste protocolo, descrevemos a infecção de camundongos com bioluminescente C. rodentium e monitoramento não-invasivo da colonização por diária de imagens DLIT-μCT e enumeração de bactérias das fezes para 8 dias.

O uso do IVIS Spectrum CT facilita perfeita co-registo de exames ópticos e μCT utilizando uma plataforma de imagem única. A baixa modalidade μCT doses permite a imagem dos camundongosem vários momentos durante a infecção, oferecendo localização anatômica detalhada dos focos de bactérias bioluminescentes em 3D sem causar artefatos da radiação cumulativa. É importante ressaltar que os filmes 4D de camundongos infectados fornecer uma poderosa ferramenta analítica para monitorar a dinâmica de colonização de bactérias in vivo.

Introdução

Modelos de pequenos animais, em especial os que utilizam ratos, são rotineiramente utilizados para investigar patogênese bacteriana ou para testar estratégias de intervenção para infecções, tais como antibióticos, probióticos, prebióticos e vacinas ^1-7. As principais leituras experimentais de infecções animais pequenos são carga de patógenos, localização espacial e temporal da infecção, e alterações na resposta imunológica do organismo infectado. Em imagiologia óptica in vivo é uma ferramenta valiosa para a pesquisa de doenças infecciosas e pode ser utilizado para monitorizar múltiplas Leituras experimentais, através da utilização de genes repórteres (proteínas fluorescentes, luciferase, beta-lactamase, etc), corantes fluorescentes, nanopartículas ou sondas quimioluminescentes apontado a um processo biológico da proteína, ou microrganismo ^6.

Imagem de bioluminescência (BLI) é uma modalidade de imagiologia óptica utilizado para monitorar a colonização de pequenos animais, tais como ratinhos e ratos, por bactericida patogénicaria ^3,6,8,9. Os ratinhos são infectados com as bactérias recombinantes que expressam uma luciferase, tal como o operão lux CDABE de Photorhabdus luminescens. Estas bactérias, em seguida, pode ser detectado através da sua produção de luz, utilizando um CCD com base no sistema de imagem in vivo ^3,6,9. É importante ressaltar que apenas micro-organismos metabolicamente ativas são bioluminescentes (BL), ou seja, somente as células bacterianas viáveis ​​são detectados por esta metodologia ^10,11. Usando 2D BLI, o local da fonte de BL é inferida a partir da superfície do animal, onde o sinal é emitido ^8. A localização anatómica exacta dos focos BL in vivo tem de ser determinada através da análise ex vivo de órgãos ^3,6,9 Em contraste, a luz difusa 3D tomografia composto (DLIT) pode ser usado para compilar uma reconstrução 3D quantitativa do BL fonte ^12. DLIT é realizada através da recolha de imagens BL tiradas com filtros ópticos passa-banda estreitos e definidosposteriormente, introduzindo-os em uma tomografia óptica reconstrução 3D algoritmo difuso ^1,7,12,13.

Actualmente, imagiologia multimodalidade é o único método disponível para se verdadeira localização anatómica não-invasivo de focos bioluminescente in vivo, sem a necessidade de análise ex vivo. Recentemente, foi utilizada uma combinação de DLIT co-registradas com μCT de imagem para avaliar Citrobacter rodentium (C. rodentium) dinâmica de colonização após o tratamento profilático com uma bactéria probiótica ^7. C. rodentium é um patógeno entérico específico murino usado para infecção humana com modelo enteropatogênico e enterhemorrhagic Escherichia coli ^14. C. infecção rodentium provoca colite, normalmente associada com perda moderada de peso, diarréia, polarizada Th1 de resposta imune e alterações patológicas distintas, incluindo hiperplasia da cripta do cólon e anexando e discreto lesão formatiem ^14. Além disso, C. patogênese rodentium tem sido exaustivamente estudada usando BLI e sua dinâmica de colonização em camundongos C57BL/6J estão bem documentados, fazendo com que esta bactéria um microorganismo modelo ideal para uso com multi-modalidade de imagem ^3,4,7.

Este protocolo é o primeiro a descrever uma metodologia para imagiologia DLIT-μCT integrada de uma infecção bacteriana utilizando uma única plataforma multimodalidade imagiologia, o IVIS Espectro de CT, e a geração de um filme 4D mostra os verdadeiros dinâmica desta infecção não-invasiva.

Protocolo

1. Ratos Preparação

1. Comprar ou produzir o suficiente 18-20 g camundongos C57BL/6J necessários para o estudo.
2. Se os ratos são comprados de um fornecedor externo, seguindo o transporte para a instalação, habituar camundongos por 1 semana em comida autoclavado e água para estabilizar a microbiota intestinal.
3. Pesam-se, orelha de gama, e separar o número necessário de ratinhos por gaiola.
4. No dia anterior à infecção, antes de executar qualquer anestesia, verificar se existe isoflurano e oxigénio adequado para a duração do processo. Se necessário, adicione mais isofluorano ou substituir o cilindro de oxigênio. Em seguida, verifique o peso dos catadores anestésicos, se eles ganharam mais de 50 g desde a sua primeira utilização, descartá-las e substituir com catadores frescos.
5. Anestesiar ratos utilizando 3% isoflurano na XGI-8 Sistema de Anestesia e depilar usando Veet para 7 min.
6. Notas:
   • Depilação completa é essencial, especialmente emcamundongos negros como melanina na pele atenua significativamente o sinal bioluminescente ^3,15.
   • Depilação de ratos geralmente dura 8-10 dias antes da pele começa a regredir. Para realizar imagem multimodalidade 4D durante períodos mais longos, depilar ratinhos quando necessário de modo a que a área de interesse está nu para as sessões de imagem.
   • Ratos estão alojados em um Nível de Biossegurança 2 (NB-2) instalação de confinamento.

2. Preparação celular bacteriana

1. Prepara suficiente Burtani caldo Luria e placas de agar suplementadas com canamicina [50 ug ^mL-1] necessária para o estudo e armazenar a 4 ° C até ser necessário.
2. O dia antes da infecção descongelar um criotubo de C. rodentium estirpe ICC180 e imediatamente adicionar um cryobead para 15 ml de caldo LB suplementado com canamicina [50 ug ^mL-1] e cultura durante a noite a 220 rpm, 37 ° C. Como controle de contaminação médio, preparar um adicionalinocular 15 ml de caldo LB suplementado com canamicina [50 ug ^mL-1] e da cultura a 220 rpm, 37 ° C.
3. Na manhã seguinte (~ 16 horas), verifique o controlo do meio para turbidez como um sinal de crescimento bacteriano. Se o controle é clara, transferir a cultura ICC180 para um tubo falcon e centrifugar a 4.000 rpm. Subsequentemente, lavar o sedimento bacteriano em PBS. Em seguida, ressuspender em 1,5 mL de PBS (1/10 ^th do volume original de LB suplementado com canamicina) e misturar completamente para criar o inoculo bacteriano.
4. Para verificar se ICC180 foi cultivado de forma adequada e é bioluminescente antes da infecção dos camundongos, a imagem do inóculo no IVIS Spectrum CT usando BLI ea configuração automática do assistente Viver 4.3.1 Imagem como descrito anteriormente ^1.
   Nota:
   • Strain ICC180 é um derivado bioluminescente do tipo selvagem C. rodentium ICC169 ^2. Esta estirpe bacteriana tem o operão lux CDABE incluindo um Kgene de resistência anamycin inserido um pseudogene de xylE no cromossoma ^2.
   • Realizar todas cultura bacteriana utilizando técnicas assépticas standard e, se necessário ou comprar consumíveis / reagentes estéreis ou autoclave antes de usar.
   • No passo 2.4, a leitura de bioluminescência (p / s / cm ² / SR) pode ser utilizado para estimar o número de bactérias antes da infecção dos ratinhos.

3. Infecção de camundongos com Bioluminiscente C. rodentium e Avaliação da colonização bacteriana

1. Antes da infecção, verificar se existe isoflurano e oxigénio adequado para a duração do processo. Se necessário, adicione mais isofluorano ou substituir o cilindro de oxigênio. Em seguida, verifique o peso dos catadores anestésicos, se eles ganharam mais de 50 g desde a sua primeira utilização, descartá-las e substituir com catadores frescos.
2. Camundongos anestesiar com 3% isoflurano usando um XGI-8 AnaestheSistema sia para proporcionar retenção humano.
3. Misture o inoculo bacteriano e desenhar cuidadosamente 0,2 ml (aproximadamente 5 x 10 ⁹ ufc ICC180) para dentro da seringa.
4. Remover camundongos do sistema de anestesia um de cada vez e nuca deles, segurando firmemente a pele atrás do pescoço com o polegar eo indicador.
5. Empurrar a agulha de gavagem para o telhado da boca, sobre a lingueta, e para baixo do esófago e injectar o inoculo bacteriano para o estômago.
6. Após sonda oral dos ratos, acompanhar a sua marcha e respiração por sinais de sofrimento que pode ser um sinal de que o inóculo bacteriano foi entregue para os pulmões. Eutanásia quaisquer ratinhos que foram inoculados nos pulmões.
7. Ratinhos não infectados gavagem com 200 ul de PBS como um controle de veículos, tal como descrito nos passos de 3,1-3,6.
8. Para confirmar que a sonda oral foi realizada corretamente, imagem camundongos infectados infectados e simulada no IVIS Spectrum CT usando BLI ea configuração automática no the LivingAssistente 4.3.1 imagem como descrito anteriormente ^1.
9. Determinar os números de bactérias viáveis ​​no inoculo por diluição em série em PBS e manchas em triplicado em agar LB suplementado com canamicina [50 ug ^mL-1].
10. Calcular a quantidade de ICC180 ufc / mL, encontrando uma diluição onde existem aproximadamente 5-50 colónias e contar o número de colónias a partir de cada ponto de diluição em que a diluição e registar que as colónias foram contadas no. Subsequentemente, calcular o número médio de ufc (a partir de três pontos) e multiplicando este valor pelo factor de diluição de 50 (cada ponto é de 20 ul de 1 ml da amostra original) e à diluição das colónias foram contadas no, dando ufc / ml.
11. Monitorar a colonização dos ratinhos diariamente, recolhendo as fezes de cada ratinho, para um tubo de Eppendorf de pré-pesado (pesado num equilíbrio fino) e dilui-se de 1/10 em PBS com base no peso da amostra (0,1 g ml ^-1).
12. Determinar os números de bactérias viáveis ​​emas fezes por diluição em série em PBS e manchas em triplicado em placas de agar LB suplementado com canamicina [50 ug ^mL-1].
13. Calcular o número de bactérias viáveis ​​por grama de fezes seguindo o passo 3.9, em seguida, multiplicar o número de ufc / mL pelo factor de diluição fecal em PBS (passo 3.10) de 0,1 g ml ^-1 para dar ufc / g.
14. Para determinar se os ratinhos foram inoculados com uma cultura pura ICC180 e que todas as colónias são bioluminescente. Tome as placas de ágar da Etapa 3.8, avaliar a morfologia da colônia bacteriana ou por olho ou escolher uma colônia representante da chapa e analisar por microscopia de luz. Se necessário, a identificação de bactérias pode ser realizada pela tensão de colónias de PCR específico para avaliar a pureza da cultura. Subsequentemente, as placas de imagem no IVIS Espectro de CT utilizando BLI como descrito no passo 3.7 e verificar que 100% das colónias na placa são bioluminescente.
    Notas:
    • No passo 3.4, ao inserir a agulha gavage, Se você sentir resistência, não forçar a agulha gavage, pois isso faz com que o inóculo para ir para os pulmões. Em vez disso, volte a inserir a agulha e tente novamente suavemente.
    • Passo 3.1 é opcional e camundongos pode ser oral gavaged sem anestesia, dependendo da política de bem-estar animal institutos.
    • Fezes devem ser semeadas no dia em que eles são coletados. C. rodentium vai crescer até se deixado a 4 ° C durante a noite em PBS, e fará com que a quantificação de CFU / g de fezes de estar incorrecta.

4. Diário Composite luz difusa tomografia 3D com μCT Imagem (DLIT-μCT) de camundongos infectados

Considerações de bem-estar animal: DLIT-μCT envolve imageamento óptico DLIT integrado com um rápido, de baixo dose de radiação μCT digitalização (~ 23 mGy para uma varredura duas mouse, ~ 53 mGy para uma única varredura mouse) de um animal imobilizado. Esta dose acumula com cada sessão de imagem, de modo que o objectivo é manter a dose como low quanto possível (e sempre bem abaixo da DL _50/30) enquanto ainda a realização do estudo. Em alguns casos, se não houver nenhum sinal de infecção num BLI analise convencional de ratos, a verificação μCT pode ser evitada para minimizar ainda mais a dose. Embora a dose é mantida tão baixa quanto possível, de prolongados estudos se houver alguma preocupação com a exposição à radiação, os ratos serão sacrificados ao primeiro sinal de sintomas prejudiciais ou no final do período de imagiologia μCT.

1. Antes de imagem, inicializar o IVIS Spectrum CT e verifique se as travas de segurança de raios-X estão funcionando e que o estágio é aquecida na temperatura correta (37 ° C) para a imagem latente. Posteriormente, a verificar o nível de isoflourane no sistema de anestesia e o peso dos captadores anestésicos. Se necessário, adicione mais isofluorano e se os catadores ganharam mais de 50 g desde a sua primeira utilização, descartá-las e substituir com catadores frescos.
2. Configure o Spectrum CT para que os parâmetros de imagem queexecutar o recurso de exposição automática na Vida 4.3.1 Imagem são otimizados para luciferase bacteriana imagem. Selecione Editar> Preferências> Aquisição e janela de exposição automática. Em seguida, selecione> Faixa de Valores> Exp. Tempo (em segundos) e definir a> Max. para 300s. Por fim, selecione> Alvo Count (mínimo)> luminescente e definido para 10.000 pontos.
3. Insira a uma plataforma de imagem mouse na Spectrum CT e prumo lo na anestesia.
4. Ligue o raio-X de segurança de bloqueio e inicializar os IVIS.
5. Uma vez que o IVIS Spectrum CT foi inicializado, anestesiar os ratos com 3% de isofluorano usando um XGI-8 Anestesia sistema para proporcionar retenção humano.
6. Para determinar se é necessário realizar uma varredura DLIT-μCT, pré-imagem dos camundongos usando BLI como descrito anteriormente ^1, em uma plataforma de imagem mouse. Se um sinal robusto é obtido o mouse é adequado para imagens DLIT. Deixe o rato anestesiado em um rato imagem plataform após a verificação BLI pronto para DLIT-μCT.
7. Use o Assistente de Imagem na imagem viva 4.3.1 software para configurar a digitalização DLIT-μCT. O Assistente de Imagem determina automaticamente o FOV, tempo de exposição, F-stop e binning para o DLIT eo FOV, tempo de exposição, conjuntos de filtros e binning para a imagem μCT para dar a melhor relação sinal-ruído. Quando solicitado pelo Assistente Imaging, incluir apenas a 560, 580, 600 e 620 nm filtros de emissão e selecionar o rato varredura μCT. Em seguida, clique> Adquirir para iniciar a imagem.
8. Retorne o rato anestesiado para sua jaula depois de imagem, remover o plataforma de imagem do rato do Spectrum CT e desinfectar com 1% Tri-gene. Se necessário, substituir a almofada de espuma que o rato é posicionado sobre a minimizar o risco de contaminação cruzada entre os ratos.
9. Imagem de ratinhos diariamente até ao dia 8 pós-infecção (PI) utilizando DLIT-μCT, como descrito nos passos 4,1-4,8, para gerar os dados de imagem longitudinais necessárias para fazer uma 4D movie de infecção.
   Nota:
   • No passo 4.7, recomendamos o uso dos filtros de emissão de 560-620 nm para a bioluminescência bacteriana imagem. Embora o pico de bioluminescência é de cerca de 485 nm, devido à óptica de tecidos (a atenuação significativa do azul / verde fótons por tecidos de murino), que é importante para usar os fotões de laranja / vermelho para reconstruções 3D como facilitar o cálculo do sinal de profundidade .
   • As configurações de 'auto' exposição em Viver 4.3.1 imagem para DLIT precisa ser ajustado para otimizar a quantidade de fótons capturados eo tempo máximo de imagem usado para cada conjunto de filtros.
   • É apenas necessário para realizar a pré-BLI imagiologia descrito no passo 4.6, quando o pesquisador não é certo se existe um sinal detectável bioluminescente, por exemplo, quando se utiliza um novo modelo de infecção.

5. Reconstrução 3D de DLIT-μCT de imagem de dados

1. Estar aberta 4.3.1 software de imagem e selecione>, Navegar e abra a pasta que contém os arquivos DLIT-μCT.
2. Abra o arquivo DLIT-μCT em the Living Image Browser, por exemplo C. rodentium Dia 1 PI clicando em Load.
3. Na paleta de ferramentas selecione> Superfície Topografia> rato Nude, ajustar o limite, e, em seguida, clique em> Gerar Superfície. Se a reconstrução da superfície é bem sucedido, um contorno da superfície será exibido na janela de visualização em 3D.
4. Para ver o scan μCT prestados na janela de visualização em 3D, esconder o contorno da superfície (Clique> Ferramentas de óptica 3D e desmarque> Tela objeto de superfície), ou diminuir a opacidade da superfície (Clique> Ferramentas de óptica 3D e ajustar a> opacidade barra deslizante).
5. Para fornecer a localização anatómica detalhada do DLIT reconstrução 3D, é necessário alterar os dados volumétricos μCT 3D (scan) de modo que apenas o esqueleto do rato é visível e que tem o contraste óptimo. Clique> Ferramentas de multimodalidade 3D eo histograma select> logarítmica, Gradient Iluminação, Qualidade e Denoise. Finalmente, ajuste o controle deslizante de Histograma para a direita e ver o 3D volumétrica de dados de alteração de contraste. Continue ajustando os dados até que apenas os ossos são claramente visíveis. Se desejar, altere a cor para os pontos de função de transferência no histograma.
6. Em seguida, selecione> DLIT Reconstrução 3D na paleta de ferramentas e certifique-se de que apenas o 560, 580, 600 e 620 nm conjuntos de filtros, que são necessários para a luciferase bacteriana imagem in vivo, foram selecionados. Clique em> Iniciar. O menu Janela de visualização de dados irá aparecer mostrando os sinais BL espectralmente filtrada a partir do rato que foi fotografada em 2D. Estes sinais são limiarizados automaticamente pelo software, mas pode ser ajustado manualmente, se necessário, utilizando guias na parte inferior do menu. O limiar para determinar a intensidade mínima de dados (representada como uma percentagem do sinal máximo na imagem) que irá ser incluído como dados na reconstrução.
7. Em seguida, selecione> DLIT Reconstrução 3D na paleta de ferramentas e verifique se as propriedades ópticas utilizadas para a reconstrução DLIT estão corretas. Selecione> guia Propriedades e certifique-se de que as configurações de propriedades do tecido é definido para o tecido mouse, Spectrum Origem está definida para bactérias.
8. Clique> Reconstruir para executar a reconstrução DLIT.
9. Para gerar o DLIT-μCT 3D clique filme> Ferramentas> Animação 3D e selecione Opções> preset Animações> CCW eixo Y e> Duração Total> 10 segundos (25 quadros por segundo). Uma vez que as definições para a animação em 3D são imprensa correto> Gravar e salvar as reconstruções 3D DLIT-μCT como. Avi marcados com experiência, grupo e tempo ponto em uma pasta separada.
   Nota:
   • É importante ao realizar reconstruções em 3D de dados DLIT-μCT usar um PC com a vida 4.3.1 Imagem e um pacote de serviços instalados e que o PC tem uma placa de vídeo adequado para executar o software de imagem multi-modalidade. Thé um software pode ser baixado, e as especificações da GPU estão contidos nas notas de lançamento ( http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ).
   • Se as reconstruções 3D DLIT-μCT aparecer para trás depois de ter sido salvo, o seu computador está executando uma versão antiga do seu driver de gráficos e isso pode ser corrigido baixando uma atualização do site dos fabricantes.
   • Na etapa 5, apresentamos as nossas definições preferidas para gerar reconstruções 3D DLIT-μCT. No entanto, existem vários pontos durante as reconstruções em 3D, onde os parâmetros que não são discutidos neste protocolo podem ser modificados. Para um guia completo para reconstruções em 3D usando o 4.3.1 imagem viva por favor consulte o manual de instruções dos fabricantes.
   • É importante criar as reconstruções em 3D usando as configurações idênticas na ferramenta de imagem multi-modalidade para que eles sejam comparáveis. Além deisso, ao criar as reconstruções 3D DLIT-μCT, é importante para fazer os vídeos usando o mesmo número de quadros por segundo e duração total (comprimento), caso contrário, o calendário do vídeo 4D não é homogênea.

6. Geração de um filme 4D de C. Infecção rodentium

1. Claramente rotular todas as reconstruções 3D DLIT-μCT com a experiência correta, ponto de tempo e de grupo em uma pasta de fácil acesso.
2. Crie um novo arquivo no Windows Live Movie fabricante e inserir as reconstruções DLIT-μCT em ordem cronológica, desde o dia 1 PI utilizando a guia ferramentas da pasta preparada no passo 6.1.
3. Adicionar legendas para o início de cada vídeo que descreve o ponto de tempo, por exemplo Dia 1 PI, selecionando o vídeo DLIT-μCT apropriado e, em seguida, selecione Home> Adicionar legenda. Uma caixa de texto aparecerá na tela, onde a legenda apropriada é adicionado. Ajuste o tamanho da fonte, estilo, cor e justificação como desired usando guias idênticas para o Microsoft Word na barra de ferramentas do software. Finalmente, mover a legenda para o canto superior esquerdo do vídeo.
4. Repita o passo 7.3 para todos os vídeos DLIT-μCT.
5. Adicionar uma página de título, por exemplo C. rodentium dias após a infecção 1-8 clicando Início> título. Uma caixa de texto aparecerá na tela onde o título apropriado é adicionado a um slide em branco. Ajuste o tamanho da fonte, estilo, cor e justificação como desejado usando abas idênticas para o Microsoft Word na barra de ferramentas do software.
6. Salve o projeto como um projeto movie maker * MMP em uma pasta apropriada com o título do filme. Este passo é essencial se você quiser alterar o filme.
7. Salve o filme como um arquivo WMV.. Clique no menu Movie Maker> Salvar filme> para computador.
8. Converter o arquivo movie maker usando um conversor de arquivo. Avi ou outro tipo de arquivo adequado compatível com o computador.
   Notas:
   • Recomenda-se que os filmes 4Dsão gerados em um PC com o Windows Live Movie Maker instalado ( http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker ) e um bom programa de multi-mídia capaz de reproduzir. wmv ou. avi tipos de arquivos.

Resultados

A infecção de camundongos C57BL/6J com 5 x 10 ⁹ ufc C. rodentium é um modelo de infecção bacteriana e bem descritas resulta numa infecção gastrointestinal auto-limitante e que os picos entre 6-8 dias após a infecção e dura entre 3 a 4 semanas ^2,14. A infecção está confinada ao lúmen intestinal pelo sistema imunitário dos murinos e, como consequência, as bactérias são continuamente eliminados nas fezes. Colonização de ratos por C. rodentium pode ser monitorado de forma não invasiva por enumeração bacteriana direta das fezes, ou imagem de bioluminescência ^2,3.

Este manuscrito descreve um protocolo otimizado para executar 3D e 4D multimodalidade de imagem de C. rodentium dentro ratos para monitorizar a carga bacteriana e localização durante a infecção. Os resultados apresentados na Figura 1 demonstram os controlos que são necessários para imagiologia 4D bem sucedido. Antes da infecção de ratinhos é essencial para dissuadirmina que o inoculo bacteriano utilizado é bioluminescente (Figura 1A) e que, após a administração por sonda oral de um rato com bioluminescente C. rodentium, que o sinal pode ser observado no estômago do animal, e não nos pulmões (Figura 1B) ^16.

Além de controlar a colonização bacteriana utilizando imagiologia bioluminescente, é boa prática para quantificar o número de bactérias nas fezes, que é usado como uma medida indirecta da colonização bacteriana da mucosa gastrointestinal Figura 2 demonstra a carga bacteriana típica nas fezes feita a partir de 8 C57BL6 / J. os ratos que foram infectadas com aproximadamente 5 x 10 ⁹ ufc ICC180 e monitorizada durante 8 dias PI Colonização aumenta a partir do dia 2 até o dia PI 6-7, onde os picos de infecção a ~ 5 x ¹⁰ 10 ufc / g; que está em consonância com os relatórios anteriores ^2,3,17.

Para enfatizar a importância da avating a propagação da infecção em um único rato, Figuras 1B e 3, bem como um vídeo ter sido gerados a partir do mesmo rato após C. rodentium infecção, tal como descrito acima. Diariamente DLIT-μCT foi utilizado para avaliar a distribuição espacial das bactérias bioluminescentes dentro deste rato, usando o esqueleto como uma referência anatómica. Figura 3 demonstra a reconstrução DLIT-μCT de um rato infectado com C57BL/6J ICC180 em três pontos chave hora PI Em dia 3 PI pequenos focos bioluminescente pode ser observada no cólon, que exibem um aumento moderado na intensidade de bioluminescência durante o dia 5 PI com pouca alteração na distribuição espacial. No dia 7 de PI observou-se um aumento significativo na bioluminescência ea bioluminescente focos espalhados por todo o cólon.

Video 1 é uma compilação de reconstruções DLIT-μCT 3D a partir de 1-8 dias PI com ICC180 e ilustra C.rodentium dentro do trato gastrointestinal proximal entre os dias PI 1-2 que se espalha para o cólon no dia 3 PI De 4-6 dias PI os números de bactérias no cólon expandir até um pico no dia 7 PI, onde os focos de bactérias cobre todo o cólon. No dia 8 PI apenas dois focos distintos de bactérias estão presentes no cólon proximal e distal. A capacidade de visualizar a reconstrução 3D completa em cada momento, em ordem cronológica, representa uma poderosa ferramenta para analisar as interações patógeno hospedeiro e é mais fácil de interpretar do que um 3D ainda do mesmo conjunto de dados.

Figura 1. Imagem de bioluminescência 2D A) Bioluminiscente C. rodentium ICC180 inoculo e B) de um rato após administração por sonda oral com 200 mL de inoculo. Arrowhead (>) ilustra bioluminescente C. rodentium em> no estômago.

Figura 2. C. dinâmica de colonização rodentium. Quantificação C. rodentium unidades formadoras de colônia de fezes por 8 dias PI

Figura 3. Luz difusa imagem tomografia μCT varredura de bioluminescente C. infecção rodentium de um rato monitorados no dia 3, 5 e 7 PI Arrowhead (>) ilustra a colonização do cólon. Clique aqui para ver a figura maior .

Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv "target =" _blank "> Clique aqui para ver o vídeo. 4D filme de infecção por C. rodentium de um rato monitorado a partir de 1-8 dias PI

Discussão

O filme 4D de infecção bacteriana fornece uma ferramenta útil para visualizar e interpretar grandes quantidades de dados de imagem multi-modalidade com rapidez e facilidade. Esta técnica facilita a análise pormenorizada de como uma infecção se espalha por meio de um rato individual e pode ser utilizado para investigar a forma como a eliminação de hospedeiro ou de genes bacterianos ou estratégias de intervenção particular, efeito da carga bacteriana, distribuição e localização durante um estudo longitudinal ^7. Estes vídeos também fornecem materiais didáticos úteis e um meio de divulgação de informações ao público.

Existem vários passos críticos neste protocolo que poderiam afectar a qualidade dos dados obtidos a partir de DLIT-μCT imagem e a capacidade para elaborar um vídeo 4D da infecção. A parte mais importante deste protocolo é a infecção bem sucedida e homogênea de ratos com C. rodentium. É essencial que os ratinhos usados ​​para o estudo são entre 18-20 g e que o bactericidariais inóculos são preparados e cerca de 5 x 10 ⁹ ufc, como descrito anteriormente ^2,3. Antes da infecção dos ratos, é importante verificar que o inoculo é bioluminescente utilizando o Espectro de CT e uma vez que o inóculo foi preparado, tem de ser continuamente homogeneizada antes de cada rato é gavaged para assegurar que os ratos recebem doses infecciosas semelhantes. A imagem DLIT-μCT de camundongos foi otimizado para que a função de exposição automática no software 4.3.1 imagem viva determina automaticamente os parâmetros de imagem otimizado para o sinal de estar bem acima do ruído. No entanto, a função de auto-exposição depende de configurações definidas pelo utilizador e os parâmetros que devem ser modificados tal como descrito no procedimento. Não fazer isso irá resultar em imagens de baixa com um baixo número de fótons coletados que não resultar em uma progressão evidente na infecção, como as configurações de fábrica do Spectrum CT para auto-exposição estão programados para os tumores de imagem expressandofirefly luciferase. Reconstruções realizadas utilizando 560-620 nm dar o melhor acordo entre os dados medidos e simulados e, portanto, são os dados mais confiáveis ​​para incluir na reconstrução.

Uma limitação para a utilização de DLIT-μCT é que a radiação ionizante a partir da analise μCT provoca danos de radiação sub-letais, que é cumulativa ao longo de um estudo longitudinal ^18. Exposição de radiação sub-letal pode enfraquecer a resposta imune, causar danos no ADN e apoptose em órgãos internos ^19. Em última análise, os danos da radiação sub-letal cumulativo pode causar a morte, se o LD _50/30 para a radiação ionizante é ultrapassado, o que se situa entre 5 e 7 Gy, dependendo da estirpe de ratinho e da idade dos ratos utilizados ^18,20,21. Embora alguns dos danos molecular das radiações ionizantes podem curar, desde o princípio primordial é estimar a dose de forma conservadora, este não é normalmente contabilizados no planejamento do estudo. Em vez disso, o objetivo é ficar o mais below esses limites quanto possível, enquanto ainda realizar os objetivos do estudo. Isto é particularmente importante no presente estudo, devido à resposta imunitária normal à infecção, a frequência de imagem, e o facto transgénicas, imuno-formado, ou fortemente os animais infectados podem ser mais sensíveis à radiação ionizante.

Ao planear a experiência para gerar um filme 4D da infecção, é importante ter em conta a duração da experiência, o número de μCT verifica necessário durante este período e o LD _50/30 para a radiação ionizante para a estirpe de ratinho a ser utilizado. Outra limitação potencial ao DLIT-μCT é a força de expressão do repórter no interior da estirpe bacteriana a ser utilizada, pois isso irá afectar os limites de detecção de bactérias e tempos de imagem. É altamente recomendável que os pesquisadores usam validado cepas bacterianas que são totalmente virulenta, mas otimizado para máxima lux operon expressão, como demonstrado anteriormente para BLI2,3.

Uma ressalva ao projeto atual da imagem 4D é que cada filme é composto de exames individuais DLIT-μCT que têm diferente escala fóton. Isto pode tornar as imagens difíceis de interpretar se as alterações para a localização de focos BL, ou a sua intensidade ser subtil, ou se houver uma atenção intensa BL rodeado por focos fraco múltipla. Portanto, para a visualização longitudinais, é importante para manter as barras de cor consistentes entre os pontos de tempo.

O conceito de um filme 4D da infecção pode ser aplicado a qualquer agente patogénico bacteriano adequadamente rotulado. Desenvolvimento futuro desta técnica terá como objetivo usar a fluorescência tomografia (FLIT), bem como DLIT para facilitar a investigação da resposta do hospedeiro à infecção usando uma combinação de patógenos bacterianos bioluminescentes e injetáveis ​​fluorescentes perto sondas infravermelhas para investigar respostas do hospedeiro à infecção. Em adição a isso, neste protocolo, sódescrevem a utilização de bactérias bioluminescentes para criar 4D filmes de infecção. No entanto, em alguns casos, pode ser necessário o uso de bactérias marcadas fluorescentes, por exemplo marcados com IRFP, de modo que o repórter bioluminescente pode ser utilizado para a investigação genética hospedeiro durante a infecção. Mais importante, o uso de imagens multi-modalidade combinando DLIT / FLIT-μCT permitirá investigar de forma não invasiva vários parâmetros durante uma infecção bacteriana, o que vai contribuir significativamente para a redução, refinamento e substituição do uso de animais em pesquisa científica conforme descrito na iniciativa da NC3R ( http://www.nc3rs.org.uk/ ).

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescent C. rodentium	Frankel lab	ICC180	Wiles et al., 2004
Veet	Boots		Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.
Isofluorane (100% v/v)	Abbott	B506
Medical Oxygen	BOC Medical		Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.
Luria Bertani broth	Merck	1.10285.0500	25 g in 1L Demineralised water.
Luria Bertani agar	Merck	1.10283.0500	37 g in 1L Demineralised water.
Kanamycin sulphate	Sigma (Fluka)	60615
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes	BD (Falcon)	352070
Universals	Corning (Gosselin)	E5633-063
1 ml syringe	BD (Plastipak)	300013
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved	Vet Tech	DE005
Microbanks (Cryovial)	Pro-Lab Diagnostics	PL.170/Y
IVIS Spectrum CT	Caliper- a PerkinElmer Company	133577 Rev A/ Spectrum CT
6kVA UPS	Caliper- a PerkinElmer Company
XGI-8 anesthesia system	Caliper- a PerkinElmer Company	118918
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal	Caliper- a PerkinElmer Company	118999/00
Living Image v4.3.1 SP1	Caliper- a PerkinElmer Company
Benchtop shaking incubator	New Brunswick Scientific	Innova 44