Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Resumo

Adenoviral de transferência do gene em células T CD4 naive com a expressão transgénica do receptor de adenovirus Coxsackie possibilita a análise molecular da diferenciação de células T reguladoras In vitro.

Resumo

As células T reguladoras (Tregs) são essenciais para proporcionar a auto-tolerância imunológica, bem como para certos antigénios estranhos. Tregs podem ser gerados a partir de células T CD4 + naive in vitro com TCR-e co-estimulação na presença de TGF-p e IL-2. Isso tem um enorme potencial para futuras terapias, no entanto, as moléculas e vias de sinalização que a diferenciação de controle são em grande parte desconhecidos.

As células T primárias podem ser manipulados através da expressão ectópica de genes, mas os métodos comuns não conseguem atingir a mais importante do estado ingénuo da célula T antes do reconhecimento do antigénio primário. Aqui, nós fornecemos um protocolo para expressar genes ectópicas nas células T CD4 ingênuas in vitro antes de induzir a diferenciação Treg. Aplica-se a transdução com o adenovírus deficiente em replicação e explica a sua geração e produção. O adenovirus pode demorar até inserções grandes (até 7 kb), e podem ser equipadas com os promotores para alcançar alta e transitória OVEREXPression nas células T. Ele efetivamente transduz células T rato ingênuos se expressar um receptor adenovírus Coxsackie transgênicos (CAR). Importante, após a infecção, as células T permanecem ingénuo (CD44 ^{baixa, alta} CD62L) e de repouso (CD25 ^-, CD69 ^-), e podem ser activadas e diferenciadas em Tregs semelhante a células não infectadas. Assim, este método permite a manipulação de diferenciação de células T CD4 desde o seu início. Ele garante que a expressão gênica ectópica já está em vigor quando os eventos de sinalização início da estimulação inicial TCR induz alterações celulares que, eventualmente, levar em Treg diferenciação.

Introdução

Tregs são cruciais para manter a tolerância imunológica e diminuir as respostas imunes overshooting. Tregs suprimem a ativação de células T espectador. Por conseguinte, a ablação de Tregs conduz à autoimunidade fatal e auto-destruição dirigida por células T activadas ^1. Tregs desenvolvem-se no timo durante a selecção negativa de células T CD4-positivos precursores única, mas também podem diferenciar na periferia das células T CD4 + naive com a estimulação de antigénio de baixa dose com ^1,2 subóptima de co-estimulação. Tímico Tregs parecem suprimir a auto-imunidade de tecidos, contra auto-antigénios, enquanto periférica Tregs têm sido implicadas no fornecimento de tolerância no intestino ou do pulmão. Estes induzida Tregs potencialmente prevenir a ativação de células T após o reconhecimento de antígenos estranhos na mucosa, incluindo antígenos ambientais dos alimentos e do ar, bactérias comensais, e alérgenos ^3,4. Além disso, as Tregs são cruciais para estabelecer a tolerância aos péptidos materna e fetal ⁵ préventilação doença do enxerto-versus-hospedeiro ^6. Ao mesmo tempo, também Tregs mediar efeitos indesejados por meio da atenuação de vigilância imunitária de células tumorais ^7,8. O recurso marca de Tregs é a expressão do subconjunto-especificar o fator de transcrição Foxp3, um fator de transcrição contendo domínio fork-cabeça que é necessário e suficiente para conferir função Treg ^9,10. Algumas vias de sinalização que podem induzir a expressão de Foxp3 é conhecido. No entanto, os processos moleculares que controlam, regulam, modulam ou Treg diferenciação em resposta ao receptor de células T desencadeamento forem menos bem compreendidas.

Tregs pode muito eficazmente ser induzida in vitro através da estimulação das células T CD4 + naive com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 na presença de TGF-p e IL-2 ^11. Como o Tregs emergentes são funcionais in vivo, a manipulação de moléculas que promovem a diferenciação de Treg tem um enorme potencial para futuro therapies, por exemplo, o tratamento de asma, doença de Crohn, e transplante de ^11,12. Por outro lado, a modulação terapêutica de moléculas para bloquear a diferenciação Treg podem proporcionar benefícios em futuras abordagens de tratamento combinado dos pacientes com tumor.

Em ensaios de diferenciação in vitro têm sido fundamentais para a descrição de alterações moleculares que estão associados com a diferenciação subconjunto de células T. No momento, as tentativas experimentais para pesquisa ou na tela para produtos de genes que controlam a diferenciação de células T são dificultados pelo facto de que os métodos mais comuns de expressão do gene ectópico falhar em células T naive. Por exemplo, a transdução retroviral, electroporação e só são eficazes em células T activadas. Em contraste com as expectativas iniciais, transdução lentiviral, que é tipicamente eficaz em células em repouso, requer pre-activação de células T naive por citocinas ^13. Além disso, a transferência de cDNA ou mRNA durante electroporaçãoenvolve a despolarização da membrana plasmática, que se confere características de activação das células T e pode mesmo mobilização de ^{Ca2 +} sinalização e ativar proteínas NFAT (observação e ref inédito. ^14). Da mesma forma, para a transdução retroviral, as células T virgens tem que ser ativado para 18 - 40 hr. Durante este tempo, a ruptura da membrana nuclear durante a divisão celular ocorrer e permite a subsequente integração do genoma do vector retroviral ^15. Estes métodos não são, portanto, capazes de dirigir a regulação molecular inicial do encontro de células T inicial com o antigénio, que é a etapa determinante de diferenciação da célula T helper.

Transdução adenoviral é conhecido para conferir a expressão do gene ectópico transitória em um número de tipos de células humanas que expressam o receptor para o adenovírus humano de Coxsackie (CAR). Procede sem necessidade de activação celular ou na progressão do ciclo celular. A expressão de superfície de CRA é essencial para a ligação e internalização do vírus eficiente, e a expressão transgénica da versão truncada CARΔ1 sob um promotor específico de células-T foi encontrada para processar timócitos de ratinho e as células T sensíveis a infecção adenoviral ^16. Mais importante, o transgene não se alterar o desenvolvimento de timócitos ou a diferenciação in vitro de células T CD4 + naive em subconjuntos diferentes (dados não mostrados; Ref. ^17.). Adenovírus mediada transdução de células T foi usado anteriormente para superexpressão ^17,18 e knock-down abordagens ^19,20. As células T transgénicas podem ser purificados a partir comercialmente disponível DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. e ref ^17.). Importante, a transdução adenoviral permite uma elevada expressão de um gene de interesse em células T virgens sem induzir sinais óbvios de activação. As células T permanecer ingênuo (CD44 ^baixo, CD62L ^high) e de repouso (CD25 ^-, CD69 ^-) após infectiem e podem ser activadas e diferenciadas em Treg semelhante a células não infectadas.

Produção de adenovírus recombinantes pode ser conseguida após a transfecção de células com plasmídeos HEK293A adenovirais (Figura 1). Estes plasmídeos contêm, tipicamente, o adenovírus tipo 5 do genoma humano com os genes E1 e E3 eliminados para processar os adenovírus recombinantes de replicação incompetente ^21. Células HEK293A complementar a deficiência de replicação como eles foram imortalizados através da integração estável de adenovírus cortado ^22. Como vectores adenovirais são grandes (~ 40 kb) e, consequentemente, não é adequado para a clonagem da enzima de restrição mediada tradicional, utilizou-se o sistema Gateway. O gene de interesse é, inicialmente, clonado num vector de entrada mais pequena, a partir da qual ele pode ser facilmente transferido para o vector adenoviral de destino por via da reacção de recombinação lambda (LR) ^23. Construímos o pCAGAdDu vectorcombinando o promotor CAG (promotor de actina de galinha e intensificador de CMV), com uma cassete de expressão contendo LR locais flanqueando o marcador procariota selecção ccdB ^24. Esta cassete de expressão está fundido com um local de entrada interno do ribossoma (IRES), elemento que permite a co-expressão do marcador de infecção melhorada proteína fluorescente verde eucariota (eGFP), que está fundido com uma sequência que contém a hormona de crescimento bovina poli (A) do sinal. Escolhemos as sequências de cis-reguladoras CAG, uma vez que o promotor de CMV prototípico foi encontrado para ser altamente dependente da activação e, portanto, desfavorável para a expressão de genes em células T naive.

Aqui, nós fornecemos um protocolo eficiente para a diferenciação Treg vitro e um método para a transdução de células T CD4 naive sem activação (Figura 2). O método permite a expressão gênica ectópica ou derrubar CD4 anteriores diferenciação de células T no estado ingênuo. Ele permite testar o efeito de uma overexpressed gene de interesse durante os eventos de sinalização início após a estimulação inicial até TCR compromisso subconjunto de células T. Nossos experimentos de validação também fornecem a base para estabelecer a aplicação adenovírus semelhante na diferenciação de outros subgrupos de células T, como Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, ou células TFH.

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Protocolo

1. A clonagem de um gene de interesse num vector de entrada

1. Clonar o gene de interesse num vector de entrada. A amplificação por PCR do gene seguido por ligação blunt-end num vector de topoisomerase acoplado (por exemplo, pENTR / D-TOPO) ou enzima de restrição mediada clonagem pode ser utilizado para este procedimento.

2. Transferir o gene de interesse para o pCAGAdDu Destino Vector

1. Transferência do gene de interesse a partir do vector de entrada no vector de destino por LR recombinação (por exemplo, mistura de Gateway LR Clonase Enzima II). Isto irá criar o vector de expressão de adenovírus (Figura 1).
2. Linearizar 10 ug do vector de expressão de adenovírus numa digestão de restrição PacI, precipitar o ADN e ressuspender em água a uma concentração de 3 ug por 100 ul. A linearização liberta as repetições invertidas virais (ITRs), que são necessários para a replicação e encapsidação do vADN Iral em partículas de vírus.

3. A geração do vírus lisado Primária

1. Semente de 1 x 10 ⁵ células HEK293A em 2 ml de meio de cultura celular (DMEM, 10% FBS, 5% de PenStrep) em um poço de uma placa de 6 poços e incubar as células durante 6-14 horas a 37 ° C num 10% incubadora de CO ₂ para permitir que adiram. As células devem ser, em seguida, a cerca de 50% de confluência.
2. A lipofecção: Transferência 6 ul de reagente jetPEI em 94 ul de 50 mM de NaCl, de forma breve vórtice. Adicionar a solução da mistura de 100 ul vector de adenovírus linearizado enquanto vórtex e incubar essa mistura de transfecção durante 15 - 30 min à temperatura ambiente.

Executar todas as etapas nas condições de biossegurança adequadas para infecção adenovírus!

3. Dispensar a solução gota a gota sobre a célula contendo HEK293A bem e incubar as células a 37 ° C e 10% de CO _2. Quando se utiliza um marcador de fluorescência, avaliar a transfeeficiência cção visualmente após 12-36 horas usando um microscópio de fluorescência invertido. Adicionar 0,5 ml de meio fresco a cada 3 dias.
4. Verifique a cada 2 - 3 dias com um microscópio de luz ou de fluorescência para efeitos citopáticos (CPE), que são áreas com células ampliadas e arredondadas que começam a destacar. Isto é indicativo de geração de vírus eficiente. Após a ocorrência de zonas mais amplas de CPE (Figura 3), vai demorar 24-72 horas antes de todas as células são infectadas.
5. Quando todas as células apresentam sinais de CPE, mas antes de uma separação total das células ocorre, separar as células por pipetagem suave e transferência de células com o sobrenadante (SN, 3-5 mL) para um tubo de poliestireno de 15 ml.
6. Congelar as células no SN em gelo seco durante 15 - 20 min e descongelar-los rapidamente a 37 ° C depois da ruptura das células. Repetir este-e-ciclo congelação-descongelação (F / CT) mais duas vezes. Manter o lisado de vírus primário em gelo para o uso dentro de um dia ou de congelar a -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Qualquer F adicional/ TC irá reduzir o título de vírus por 30 - 50%.

4. Amplification vírus

1. Sementes e crescer as células HEK293A a 90% de confluência num prato de 14 cm de tecido de cultura.
2. Infectar as células com metade do lisado de vírus principal (1.5 - 2,5 ml) e incubar as células durante pelo menos 36 horas. Quase todas as células infectadas devem ser, em seguida, o que pode ser determinado por microscopia de fluorescência. Para a re-amplificação de um stock de virus já amplificado (ou seja, mais concentrado), infectar HEK293A a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 50 (ver 6.3).
3. As células devem ser colhidas quando todos eles mostram CPE, mas antes de desapego. Com a produção de vírus eficiente este estado é alcançado dentro de 48 horas após a infecção. (Se demorar até uma semana, considerar uma outra rodada de amplificação, aumentando a quantidade de estoque adenovírus usado para a infecção descrito no ponto 4.2.)
4. Retire as células por pipetagem suave e células de transferência e SN para um tubo de poliestireno de 50 ml. Girar células para baixo a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
5. Remover o SN e ressuspender o sedimento em um volume apropriado de meio ou SN (ca. 1 mL).
6. Realizar 3 F / CT perturbar as células e centrifugar a 800 xg durante 15 min a 4 ° C. Retire a SN que contém as partículas virais (isto é, o lisado de vírus concentrado), e do lisado de vírus aliquota para armazená-lo a -80 ° C.

5. Vírus Titer Determinação

1. Semente 10 ⁵ células A549 por cavidade em cinco poços de uma placa de 12 poços em 1 ml de meio e deixar as células aderir durante 6 horas.
2. Use 1 ul de adenovírus concentrado (descongeladas em gelo) para realizar uma diluição em série em meio (1:5.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) e adicionam-se 10 ul por poço. Deixar um poço não infectado para ajustar o gating em citometria de fluxo.
3. Após 36 horas, retire a SN, lave com células PBS e detach (por exemplo, por tripsinização). Para precauções de risco biológico, é recomendado para corrigir cells em 100 uL de paraformaldeído 4% em PBS durante 10 min à temperatura ambiente e lavagem com PBS uma vez.
4. Faça uma análise FACS de expressão do marcador da infecção. Plot 'ul de lisado viral aplicado »contra o número absoluto de células infectadas (Figura 4). Determinar o intervalo linear da infecção e calcular o título de vírus por ml não diluído a partir da curva padrão no intervalo linear utilizando x = 1.000 ul.

6. Infecção celular T

1. Isolar células T CD4 naive / descanso de DO11.10 tg; camundongos tg CARΔ1 usando MACS (Naive CD4 + T Cell Isolation Kit II) ou FACS classificação (CD4 + CD25-CD62L-CD44 +).
2. Para as experiências de pequena escala, pipetar um volume adequado de lisado viral para obter um MOI de 50 para um poço de uma placa de 96 poços de fundo redondo.
3. Adicionar até 4 x 10 ⁵ células T num volume final de infecção de 50 ul, em meio de células T (RPMI 1640, 10% de FBS, 5% de PenStrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Essencialvitamina, 1x L-glutamina, 1:250.000 mercaptoetanol, HEPES 10 mM).
   Exemplo:
   Uma MOI de 50 será utilizado para infectar 3 x 10 ⁵ células T; o título viral é de 3 x 10 ^{9 mL1}
   Vírus de volume = MOI x número de células T / título viral = 50 x (3 x 10 ⁵⁾ / (3 x 10 ⁹ ml ^-1) = 0.005 ml

Nota: para a infecção do número de células maiores, ampliar usando um MOI de 50 em um volume de infecção de 165 mL por 10 ⁶ células T virgens em um tubo de poliestireno com o copo solta (até tp 3 ml por tubo).

4. Incubar as células durante 90 min a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO ₂ incubadora.
5. Gire as células a 300 xg por 5 min à temperatura ambiente, tire SN, ressuspender em 200 mL PBS. Centrifugar novamente e tirar SN.

(Opcional: as células podem ser lavadas outra vez para remover o vírus de forma mais eficiente)

6. Ressuspender as célulasem 200 ul de meio de células T sem os anticorpos estimulantes e sem IL-2 ou outras citocinas e descanse por 40 horas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO ₂ incubadora para permitir a expressão do gene de interesse antes da activação.

7. Ativação de células T e Polarização

1. Pipetar um volume de anti-CD3 e anti-CD28 contas acoplados que é igual ao número de células (por exemplo, 4 x 10 ⁵⁾ em um copo pequeno de reagente, adicionar o volume 10 vezes maior de PBS e colocá-los em um ímã para 2 min . Retire o sobrenadante e ressuspender as esferas em 200 ul de meio de polarização (Tregs: meio de células T + 1 ng / ml de TGF-p, com 100 U / ml de IL-2).

Nota: As células também pode ser activado usando pratos de cultura de tecidos revestidas com anticorpos anti-CD28 e anti-CD3, ou de uma forma específica do receptor de células T usando DO11.10 irradiados BALB / c esplenócitos pulsadas com o péptido de ovalbumina 323-339 antigénio.

2. Centrifuge descansou a células de antes, tirar o SN e Ressuspender as células em 200 mL meio de polarização contendo anti-CD3 e anti-CD28-anticorpo acoplado contas. Incubar durante 72 horas a 37 ° C numa incubadora de 5% de CO _2, sem alterar médio.

8. T fixação das células e coloração para Citometria de Fluxo

1. Lave as células: Gire as células a 300 xg por 5 min à temperatura ambiente, tire SN, ressuspender em 200 mL PBS. Centrifugar novamente e tirar SN. Executar todas as etapas de lavagem em conformidade.
2. Ressuspender as células em 100 ul de solução de coloração de células fixável mortos e incubar durante 30 min a 4 ° C.
3. Lavar as células, ressuspender em 100 ul de PBS, adicionar 100 uL de paraformaldeído 4% em PBS, incubar 15 min a RT.
4. Lavar as células, ressuspender em 200 ul deles gelada metanol a 70% em PBS, e incubar durante 30 min em gelo.

Nota: As células podem ser tratadas a partir de agora, sem precauções de risco biológico!

5. Preparar 60 ul mestre de mistura de 60 ul de PBS + 10 ug / ml de Fc-bloco (anti-FCR3 para bloquear a ligação inespecífica). Lavar as células, ressuspender-los em 40 ul de PBS + anti-FCR3 e incubar 15 min a RT.
6. Adicionar 20 ul de PBS + anti-FCR3 contendo 1 ug de PE-anti-anticorpo acoplado Foxp3, misturar bem e incubar a 4 ° C durante a noite.
7. Lave as células duas vezes em PBS e analisar as células de um citómetro de fluxo.

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Resultados

A produção de vírus

Para a geração de títulos elevados de vírus, o período de colheita de células HEK293A na produção de vírus ou de amplificação de primário de vírus é crucial. Representativos fluorescentes e as imagens de contraste de fase com os sinais visuais de produção de vírus estão apresentados na Figura 3. O CPE, foram observadas 10 dias após a transfecção de células com um HEK293A pCAGAdDu vector de controlo sem inserção. CPE são caracteriz...

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Discussão

Geração de vírus e Titulação

Para obter resultados de transfecção ideais, a qualidade ea quantidade de linear vetor aparecem mais importante. Não foram observados efeitos negativos sobre a produção primária a partir de um lisado supercrescimento inicial da cultura, desde a infecção prosseguir rapidamente uma vez que a produção de vírus eficiente ocorre. No entanto, a produção de vírus por células HEK293A pode ser afectada por inserções longas que reduzem a eficiência. Alg...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596