Transplante para a câmara anterior do olho para longitudinal, não-invasivo<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging com uma única célula de resolução em tempo real

Resumo

Uma nova abordagem combinando transplantação intra-ocular e microscopia confocal permite longitudinal, não-invasivo de imagem em tempo real, com uma única célula de resolução dentro dos tecidos enxertados In vivo. Demonstramos como transplantar ilhéus pancreáticos para dentro da câmara anterior do olho do rato.

Resumo

Intravital imagem surgiu como uma ferramenta indispensável na pesquisa biológica. No processo, muitas técnicas de imagiologia têm sido desenvolvidos para estudar diferentes processos biológicos em animais não-invasiva. No entanto, uma das principais limitações na técnica existentes modalidades de imagens intravital é a incapacidade de combinar não-invasivos de imagem, com as capacidades longitudinal de uma única célula de resolução. Mostramos aqui como o transplante para a câmara anterior do olho contorna limitação significativa tal que oferece uma plataforma versátil experimental que permite a não-invasivos de imagem, com a resolução longitudinal celular in vivo. Demonstramos o procedimento de transplante em ratinhos e proporcionam resultados representativos utilizando um modelo com relevância clínica, nomeadamente o transplante de ilhéus pancreáticos. Além de permitir a visualização directa de uma variedade de tecidos transplantados para a câmara anterior do olho, esta abordagem fornece uma plataforma para Screedrogas n realizando acompanhamento a longo prazo eo acompanhamento em tecidos-alvo. Devido à sua versatilidade o transplante, o tecido / célula para dentro da câmara anterior do olho, não só as terapias de transplante benefícios, estende-se a outras aplicações in vivo para o estudo de processos fisiológicos e patológicos tais como o cancro e a transdução do sinal ou o desenvolvimento da doença auto-imune.

Introdução

Os avanços na microscopia intravital revelaram fenómenos fisiológicos não preditos por estudos in vitro ^1. Isto realça o desafio na tradução resultados obtidos por métodos in vitro convencional para o animal vivo. Na última década, a visualização de tecidos em animais vivos foi consideravelmente melhorada por avanços tecnológicos em modalidades de imagem ^{2, 3, 4, 5, 6.} Isto estimulou a necessidade de abordagens de imagiologia in vivo, com aplicação possível em modelos animais experimentais, para permitir a visualização de tecidos-alvo longitudinal de forma não invasiva.

Técnicas de imagem, como ressonância magnética e tomografia por emissão de pósitrons ou bioluminescência permitiram não-invasivas de órgãos / tecidos profundos dentro do corpo ^{7-8, 9.} Mas estas técnicas não podem atingir única célula de resolução devido aos sinais de fundo elevados e de resolução espacial baixa, a despeito do uso of materiais de elevado contraste ou tecido específico ⁴ luminescência. Esta foi tratada com o advento de dois fotões microscopia de fluorescência confocal ^10. Dois fótons de microscopia intravital habilitado estudos de imagem para visualizar e quantificar eventos celulares com detalhes sem precedentes ^{11, 12.} Isto conduziu à caracterização dos principais processos biológicos na saúde e na doença de ^{13, 14, 15, 16.} Embora os estudos de imagem pioneiras intravital têm essencialmente "imitada" em condições in vivo em tecido excisado (por exemplo, nódulos linfáticos), outros estudos usaram abordagens invasivas em tecidos-alvo de imagem expostos in situ ^{17, 18, ​​19, 20, 21.} Outros estudos também têm utilizado "modelos de janelas de câmara" para contornar limitações associadas a abordagens invasivas e resolução de imagem limitada in vivo ^{22, 23, 24, 25.} No modelo de câmara de janela, uma câmara com uma janela transparente é implantado cirurgicamente na pele em difelocais de rendas (pele dorsal ou na orelha, almofada de gordura mamaria, no fígado, etc) no animal (por exemplo, rato, rato, coelho). Enquanto esta abordagem é claramente facilitador de alta resolução em imagiologia in vivo, requer uma cirurgia invasiva para implante da câmara e pode não ser capaz de acomodar os estudos de imagem longitudinais ao longo de semanas ou meses ^22.

Recentemente, foi demonstrado que a combinação de alta resolução de microscopia confocal com um procedimento minimamente invasivo, isto é, o transplante para a câmara anterior do olho (ACE) fornece uma "janela de corpo natural", como um. Poderosa e versátil in vivo plataforma de imagem ^{26, 27} O transplante para o ACE tem sido utilizado nas últimas décadas para estudar aspectos biológicos de uma variedade de tecidos ^{28, 29, 30,} e sua combinação recente com alta resolução de imagem permitiu o estudo da fisiologia das ilhotas pancreáticas, com uma única célula de resolução não- invasiva e longitudinalmente ^{26, 27. Esta abordagem foi utilizada para estudar as respostas auto-imunes, durante o desenvolvimento de diabetes do tipo 1 em modelos animais (dados não publicados). Também foi usado para estudar o desenvolvimento do pâncreas, bem como, em estudos de função renal através do transplante de pâncreas em papilas ECA ou individuais nos glomérulos renais, respectivamente (dados não publicados). Um relatório recente usando essa abordagem demonstrou ainda a sua aplicação para estudar as respostas imunes após transplante de ilhotas de pâncreas 31. Importante, este estudo mostrou que o transplante para a câmara anterior do olho fornece uma janela natural do corpo para realizar: (1) longitudinal, de imagem não invasiva de tecidos transplantados in vivo, (2) in vivo cytolabeling para avaliar o fenótipo celular e da viabilidade em situ, (3) acompanhamento em tempo real do infiltrado de células imunitárias no tecido alvo, e (4) a intervenção local por aplicação tópica ou por injecção intraocular.}

Aqui, nós demonstrate como realizar o transplante para a câmara anterior do olho utilizando ilhotas pancreáticas.

Protocolo

O procedimento seguinte é realizado sob a estereoscópio em 2 passos, o primeiro passo envolve o carregamento das ilhotas para dentro da cânula e a segunda etapa é o transplante de real no ACE. Todos os procedimentos realizados em animais foram aprovados pelo cuidado com os animais institucional e comissão de uso (IACUC), da Universidade de Miami.

1. Ilhotas de carga em cânula para Transplante

1. Centro das ilhotas no prato de cultura girando o prato em círculos mais estreitos.
2. Desligar a cânula da "reservatório" e colocar a cânula eo tubo de ligação sobre uma superfície limpa. O reservatório pode ser feito de uma ponta de pipeta de plástico descartável 300 ul sem filtro (Figura 1a).
3. Lave as bolhas de ar para fora do reservatório para assegurar fluxo contínuo de ilhotas quando a aspiração no reservatório. A lavagem do reservatório é feito por impulsionar o mãos-livres motorizada seringa motorista usando o pedal(Figura 1b, c). Isto também irá criar espaço dentro da seringa para permitir que a aspiração das ilhotas para o reservatório (pré-carregado com uma solução estéril tal como a media salina, PBS ou cultura).
4. Aspirar cuidadosamente quantidade desejada de ilhotas para o reservatório. Ilhotas tenderá a rodar à medida que entram no reservatório e permanecerá em conjunto em direcção ao fundo. A aspiração é feita por condução motorizada para trás a seringa motorista usando o pedal.
5. Reconecte a cânula para o reservatório através da tubagem de ligação.
6. Colocar a ponta da cânula para trás na placa de cultura e lavar as ilhotas para fora do reservatório para dentro do tubo, em seguida, para dentro da cânula. Certifique-se de que as ilhotas permanecer juntos como de volta a encher o tubo / cânula suavemente "sacudir" (derivação) do tubo (Figura 1d). Parar, antes ou depois de todas as bolhas de ar antes de as ilhotas são lavadas para fora da cânula. Se não for claro, parar como ilhotas entrar na parte de trás da cânula enquanto o ar restantebolhas antes de ilhotas pode ajudar a prevenir o refluxo (retorno) de ilhotas fora da ACE. Dissipará durante a noite.
7. Nesta fase, você está pronto para injetar as ilhotas na ACE (por favor, consulte os passos seguintes).

2. Islet Transplantation dentro da câmara anterior do olho

1. Posicione o mouse anestesiados em uma almofada quente sob estereoscópio.
2. Coloque o focinho do mouse em "máscara" anestesia ligado ao oxigênio / máquina de anestesia isoflurano. A máscara é feita de uma ponta de plástico descartável 1 ml pipeta (sem filtro), e ligada ao tubo da anestesia através da parte mais estreita (Figura 2a, b).
3. Gentilmente retrair as pálpebras do olho a ser transplantado utilizando o dedo indicador eo polegar de sua mão livre e "pop" do olho para fora para melhor exposição e fácil acesso (Figura 2c). Isso vai exigir um pouco de prática para aperfeiçoar sem impedindo a respiração do mouse por uma pressão excessiva sobre opescoço ou bloqueando o fluxo de sangue para a cabeça.
4. Utilizando uma seringa descartável de insulina (29 - 31G) como bisturi, com cuidado apenas a ponta penetrar na córnea e fazer uma única incisão lateral. Fazer a incisão no ponto médio entre o vértice da córnea e limbo para minimizar o refluxo dos ilhéus durante a injecção para fora do ACE (figura 2d).
5. Cuidadosamente inserir a cânula (pré-carregado com ilhotas) através da incisão.
6. Lentamente ejectar ilhotas para fora da cânula e depositá-los sobre a íris. Para evitar o refluxo de ilhotas devido à acumulação de pressão excessiva no ACE, ejectar as ilhotas de impulsos breves como pequeno volume (s) possível no quadrante oposto ao da incisão. Isto pode ser ainda assegurada por compactação ilhotas na tubagem durante o carregamento da cânula (por favor ver passo 1.6).
7. Lentamente retrair a cânula para fora da ACE. Este é um passo crítico, especialmente, se um grande volume de ilhotas foi injectado como refluxo islet devido à presse construir dentro da ACE pode ser inevitável. Para eliminar / minimizar refluxo ilhota, gire gentilmente a cânula enquanto dentro da ACE para liberar o excesso de pressão através da incisão ao redor da cânula. Verifique se há sinais de refluxo como você tentar retirar a cânula e, se necessário, aguarde até que desapareça completamente a pressão antes de retração da cânula para fora da ACE.
8. Lavar o olho transplantado com PBS estéril ou soro fisiológico.
9. Injectar buprenorfina para analgesia pós-operatória (0,05-0,1 mg / kg, por via subcutânea) a 48 h em primeiro lugar.
10. Aplicar pomada oftálmica antibiótico eritromicina ao olho transplantado imediatamente após o transplante.
11. Colocar o animal numa gaiola de volta aquecido para permitir a recuperação da anestesia.

Resultados

Existem alguns parâmetros que definem um transplante "bom". Um transplante é um bom que prossegue sem hemorragia ao fazer a incisão, como pode ser visto no vídeo. Sangramento é impedido / minimizada por penetrar apenas a ponta do bisturi (agulha) para dentro do ACE (figura 3a). Isso também irá ajudar a evitar o contato e punção da íris. Ele também irá garantir uma pequena incisão que vai curar muito bem sem causar nebulosidade da córnea ao longo do tempo (Figura 3c, d).

Discussão

Ilhéus pancreáticos de murino foram isolados usando a digestão com colagenase seguido por purificação em gradiente de densidade, tal como descrito previamente ^33. Ilhotas isoladas foram cultivadas durante a noite antes do transplante. Embora isto possa não ser necessário, é recomendado para permitir que as ilhotas para recuperar do procedimento de isolamento. Isto é crítico, quando é realizado o transplante em receptores diabéticos uma vez que irá assegurar o transplante de ilhéus sobreviventes ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Descrição / Comentários
IsoTHESIA (isoflurano)	Buttler Abastecimento Saúde Animal	11695-6775-2	99,9% de isoflurano / ml
Ketaset (ketamina HCL)	Fort Dodge Animal Health	0856-2013-01	Anestesia injetável alternativa
Beprenex (buprenorfina HCL)	Reckitt Benckiser Saúde (UK) Ltd.	12496-075-7-1	0,3 mg / ml
Eritromicina pomada oftálmica USP, 0,5%	Akron	17478-070-35	Aplicada profilaticamente a olho transplantado
Cloreto de Sódio a 0,9% (Solução salina)	Hospira Inc.	0409-7983-03	Para injecção iv. Estéril
PBS	Gibco	10010-023	1X. Estéril
CMRL médio 1066	Cellgro	98-304 CV-	Complementada, modificação CIT. Meios preferidos para ilhotas