Medição da tensão Lançamento Durante Laser Induced Axon lesão axonal Avaliar Adesão ao substrato em piconewton e resolução de milissegundos

Resumo

Medimos a libertação da tensão num axónio que foi parcialmente lesionada com um dissecador de laser através da medição simultânea de espectroscopia de força realizado em uma sonda opticamente preso aderida à membrana do axónio. O protocolo experimental desenvolvido avalia a aderência do axónio para o substrato de cultura.

Resumo

A formação de ligações funcionais em uma rede neuronal em desenvolvimento seja influenciado por sinais extrínsecos. O crescimento de neurite de neurônios em desenvolvimento está sujeita a sinais químicos e mecânicos, e os mecanismos pelos quais ele sente e responde a sinais mecânicos são mal compreendidos. A elucidação do papel das forças na maturação das células irá permitir a concepção de andaimes que pode promover a adesão celular e o acoplamento do citoesqueleto ao substrato, e, por conseguinte, melhorar a capacidade de diferentes tipos neuronais para regenerar após uma lesão.

Aqui, nós descrevemos um método para aplicar medidas de espectroscopia de força simultâneos durante a laser lesão celular induzida. Medimos liberar a tensão no axônio parcialmente lesada por rastreamento interferométrico simultânea de uma sonda ótica preso aderido à membrana do axônio. Nosso protocolo experimental detecta a liberar a tensão com a sensibilidade piconewton, ea dinâmica da liberação de tensão noresolução de tempo de milissegundos. Por isso, oferece um método de alta resolução para estudar como o acoplamento mecânico entre as células e os substratos podem ser moduladas por tratamento farmacológico e / ou propriedades mecânicas distintas do substracto.

Introdução

A microscopia óptica é um dos sistema de imagiologia menos invasivas disponíveis para observar as células vivas. Com a exploração de efeitos, tais como pressão de radiação (como pinças ópticas ^1), ou fluxo de fótons de alta energia (como a laser dissecador ^2), esta tecnologia foi estendida para nano-manipulação. O sistema de imageamento óptico fornece um controle preciso para visualizar e manipular alvos celulares sub ^3. Ao mesmo tempo, graças à calibração precisa da potência do laser emitido, instrumentos ópticos de realizar qualquer manipulação da amostra mole ou invasiva, com reprodutibilidade precedentes.

Vários laboratórios integrados, na mesma configuração experimental, pinças ópticas e dissecador laser para ablação organelas ^4, para se fundem células diferentes ^5, ou para estimular as células de cargas opticamente impulsionado ^6,7. Enquanto as pinças ópticas, depois da calibração da rigidez óptico, para permitiro controlo da força aplicada à célula numa escala piconewton, sistemas laser de dissecação pode modular manipulação óptica, que varia de membrana de formação de poros para foto-ablação de organelos individuais ou dissecação das estruturas sub-celulares. No entanto, a calibração de dissecção de laser baseia-se na avaliação qualitativa da entidade de manipulação óptica no que diz respeito à energia entregue à amostra, com base, principalmente, na análise de imagem que ilustra as alterações morfológicas causados ​​à amostra ^8. No método apresentado, é mostrado como para executar a medição de espectroscopia de força durante a dissecção axonal de laser de um neurónio em desenvolvimento, para quantificar, na escala piconewton, a força produzida por uma alteração do equilíbrio da estrutura de citoesqueleto um compartimento subcelular ^9. Neurónios cultivados aderir ao substrato e, durante o desenvolvimento polarizar. A fase de polarização ocorre durante os primeiros cinco dias in vitro. Na fase dois de polarização, um dos EXTRUDing neurites se torna mais longo, e que irá diferenciar para se tornar o axónio ^10. Alongamento axonal em resposta a uma força de tracção no cone de crescimento tem sido modelada pelo modelo de Dennerl ^11. Recentemente, este modelo tem sido alargado para ¹² incluem o papel da adesão de neurites para os substratos de matriz extracelular. Este modelo biofísico, proposto após as observações experimentais ^13, mostrou que as forças de puxar no cone de crescimento, propagação ao longo da neurite, são modulados por adesões focais ao substrato. Da mesma forma, a lesão axonal produz uma liberação local de tensão propagando em direção ao corpo celular. Assim, propôs que a medição tal tensão lançado em um local ao longo do axônio entre a lesão ea soma celular oferece a possibilidade de avaliar o resultado de amortecimento de adesões focais não afetadas.

Nós calibrar a energia necessária fotões fluxo do dissector laser para controlar a extensão da DAMAG axonal infligidae, a partir de transecção completa a lesão parcial. Após a calibração, repetiu-se a lesão parcial dos axónios de vários neurónios diferenciados e o protocolo desenvolvido para quantificar a libertação da tensão, e assim obtido um parâmetro quantitativo para estimar a aderência do axónio para o substrato ^14.

No presente trabalho, nós descrevemos em pormenor o protocolo desenvolvido, o que representa um procedimento experimental preciso para avaliar e comparar com sensibilidade piconewton axonal a adesão ao substrato, em condições experimentais diferentes, tais como o tratamento ^de substâncias químicas ^14, ou diferentes tipos de suporte de cultura celular.

Protocolo

1. Setup Optical

O sistema óptico inteiro foi anteriormente descrito ^15. Resumidamente, o sistema de pinças ópticas baseia-se numa onda contínua itérbio (CW), fibra de laser que opera a 1064 nm (IPG Laser GmbH). Um modulador de luz espacial (SLM) (LCOS-GSP, modelo X10468-07 - Hamamatsu) varia a fase do feixe de laser de entrada de IR para controlar a posição do foco pontual aprisionamento no prato de cultura por hologramas gerados por computador. As livremente disponíveis Blue-pinças de software (link da web na mesa do equipamento) hologramas gerados projetada no modulador de luz espacial. O interferômetro para medidas de espectroscopia de força foi baseado em um fotodiodo de quatro quadrantes (QPD, S5980 com C5460SPL 6041 bordo - Hamamatsu) e um fotodiodo (PD, PDA100A-CE - Thorlabs).

A fonte dissecção a laser pulsado foi um sub-nanossegundo UV Nd: YAG laser em 355 nm (PNV-001525-040, Powerchip nano-Pulse laser UV - Teem Photonics). Uma acusto-modulador óptico (MQ110-A3-UV, 355 nm de sílica fundida-AA-opto-electrónico), controlada a potência do laser UV entregue à amostra.

O holográfico pinças ópticas e a laser de micro-dissecção foram integrados num microscópio vertical modificado (BX51 - Olympus), equipado com um 60X, 0,9 NA água mergulhando fase objective.The do microscópio é composto por um motor DC de 3 eixos de posicionamento linear de micro- sistema (M-126.CG1, Física-Instruments) carregando um piezoelétrico fase de posicionamento nano 3 eixos separado (P-733.3DD, Física-Instruments) para combinar o movimento grosseiro da amostra com a resolução sub-nanométrica da piezo- fase. O sistema de estrado de microscópio foi equipado com duas malhas de controle agindo sinergicamente para manter o foco pontual aprisionamento na posição direita, dependendo do modo de funcionamento seleccionado (ou posição de fixação força, estático ou dinâmico) ^16. Em particular, um loop de feedback interno atua em um palco piezoelétrico, para manter a conta em um selected distancia do centro da armadilha. O outro loop externo, controla a posição da fase motorizada para explorar a região medido pela piezo actuador em uma área maior do que o seu curso disponível ^17. Quando a fase de piezo atinge o limite do curso disponível numa direcção, o laço externo move a fase de micro no sentido oposto, pelo que o piezo recupera para a sua posição central, porque ele está seguindo o talão prendido aderiu à amostra. Quando a fase de piezo atinge a posição central da sua gama de curso, a fase de micro interrompida. Outros detalhes do sistema estão apresentados na Guiggiani et ai ^16,17.

Um dispositivo de Peltier (QE1 aquecimento resistivo de aquecimento com controlador de canal duplo TC-344B - Warner Instruments) controla a temperatura da cultura de células ao microscópio (37 ° C). Na cultura, pH e humidade foram mantidas em condições fisiológicas, gaseificar um polidimetil costume concebidosiloxano (PDMS), manga (integrando a objetiva do microscópio) com carbogen umidificado (95% O _2, 5% CO _2).

2. Cultura celular Preparação

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano. As culturas primárias foram obtidos a partir de hipocampo de ratinhos (C57Bl6J, Charles River) no dia embrionário 18 (E18).

1. Os neurónios foram plaqueados a uma concentração de 25.000 células / ml em placas de Petri de vidro de fundo (P35G-0-14-C - matek Corporation). A baixa concentração de células de cultura é necessária para evitar a formação de uma rede densa já nos primeiros dias in vitro. Na concentração de células mencionado, a probabilidade de encontrar as células isoladas com um longo de neurites não ligado a outras células é muito maior.

3. Revestimento Bead

1. Polymer microesferas (Ø 4 mm, COOH-terminado-Bangs Laboratories, código de produto PC05N/6700) foram revestidas com poli-D-lisina seguindo o procedimento descrito no polyLink Protein Coupling Kit (Polysciences, código de produto 19539). Os grânulos são revestidos com a mesma molécula usada para cobrir o suporte de cultura e as células favor aderência.

4. Escolha neurônio isolado. Retire uma gota da cultura do substrato, Trap e movê-lo próximo ao neurônio

1. Coloque a cultura de Petri no palco microscópio. Depois de definir o foco na amostra pelo movimento palco, corrigir a posição do condensador objetivo esclarecedor para definir Kohler-iluminação. Alinhando a ótica de iluminação para definir a condição Kölher-iluminação é necessária para melhorar a qualidade de imagem brilhante campo. Utilizando essas condições de alinhamento, é também necessário para maximizar a eficiência de recolha do laser de IV (através do condensador objectivo), a partir da sonda presa espalhamento, para realizar o seu rastreamento interferométrico pelo QPD e DP.
2. Pipetar alguns mL da solução estoque em microesfera revestidapara o prato de cultura. Microesferas irá depositar e aderir ao substrato de cultura. O número de ul injectada na placa de cultura depende da concentração da solução de microesferas de estoque. A condição ideal é ter entre um e dois microesferas por campo de imagem de visão. Quando muitos microesferas são adicionados ao prato de cultura, eles podem já anexar aleatoriamente aos neurónios em cultura.
3. Movimente-se na placa de cultura, em busca de um neurônio isolado com uma neurite mais tempo (o axônio) e guardar a posição do palco microscópio.
4. Movimente-se e procurar um talão aderiu ao apoio da cultura.
5. Ligue o laser trapping IR. Nesta fase, os hologramas não são projectadas SLM, e a posição do ponto de laser IR coincide com a posição do feixe de laser de UV. Definir a posição axial do local IR 2-3 mM acima da superfície de suporte da cultura, pelo movimento platina do microscópio.
6. Definir a potência do laser UV entregue à amostra a menos de 1 μW. OLaser UV de dissecção foi previamente calibrado ^14:
   5-6 μW o apoio de vidro é ablated
   4 μW uma ligação neuronal é completamente dissecados
   2,5 μW um neurites está parcialmente lesionada
   <1 μW uma onda de choque é produzida na placa de cultura. A onda de choque óptico é suficientemente forte para separar o talão do suporte de vidro.
7. Ligue o laser UV, deixando o laser IR, e mover o ponto UV acima do cordão aderido pelo movimento estágio do microscópio. Os destaca talão da superfície, e é preso pelo laser IR. Em seguida, desligue o laser UV.
8. Mova os presos talão vários micrômetros acima do suporte de vidro (20-30 mm). Levantando o talão para esta posição vai impedi-lo de entrar em contato com outras células, enquanto ele está sendo transferido para o neurônio previamente escolhido. Traga o talão para a posição palco salvo anteriormente. Ajuste a velocidade de fase para um valor baixo (10 mM / seg), de modo a força de arrasto do fluido não excede a armadilha ópticaforça ping.

5. Mova a posição Armadilha com relação ao ponto Dissector Laser e Axon Posição holograma gerado por computador, e calibrar a rigidez pinças ópticas

1. Mova o talão para o suporte de vidro para visualizar o axônio. O talão é mantida acima da célula a fim de evitar o contacto com ela (cerca de 5 um por cima do suporte de vidro).
2. Mover a fase de microscópio para mover o foco pontual UV no centro da largura do axónio. Salvar a posição atual estágio.
3. Mova a posição do ponto de foco IR por holograma gerado por computador. Neste passo, a fase é interrompida na posição escolhida na etapa anterior. Quando o computador holograma gerado é projectada no SLM, o talão prendido é movido com respeito ao axónio. Nós mover o ponto de laser de infravermelho para ter o talão prendido alinhado no centro da neurite, com o ponto de laser UV centrado no mesmo neurites também. A mancha de IR e, assim, o talão prendido estão posicionados ao longo do neurites5-10 mM de distância do local UV. Passamos a posição do IR em relação ao local de UV dependendo da geometria de neurites. No caso das pinças ópticas não estão equipados com um sistema SLM, a posição pode ser variada por espelhos basculantes, ou deflectores acústicos óptica, no percurso óptico de IR. O ponto de laser de IV pode ser posicionada de 5-10 mM de distância a partir do ponto de UV para evitar a interacção do feixe óptico de dissecação com a sonda presa, o que poderia influenciar o seu movimento Browniano e alterar os vestígios de espectroscopia de força.
4. Depois de definir a nova posição IV local no que diz respeito à posição do ponto de UV e axónio, mover a etapa de posicionar o talão prendido longe do axónio e evitar a colisão com ele. Mover a posição axial do rebordo preso a cerca de 2 m acima do vidro de cobertura.
5. Alinhe o QPD ao centro das franjas de interferência sobre ele: sinais diferenciais y QPD x e são zeros quando o QPD está centrada. Adquirir 5 seg do movimento browniano de o talão prendido pela interferometro, a 50 kHz taxa de amostragem. Obter a rigidez (pN / nm) e a sensibilidade (V / nm) da armadilha óptica pelo método de espectro de potência ^18.

6. Anexar o talão para o axônio. Realizar medição de força axotomia e simultânea

1. Elevar a posição cordão preso cerca de 4 mm acima da tampa de vidro, e movê-lo para a posição palco salvo anteriormente (veja o passo 3.2).
2. Mova a pérola presa em direção ao axônio até tocar no neurite. A colisão entre o talão prendido e do axónio é controlada pelo sinal de detecção de deslocamento z QPD do rebordo preso na direcção axial.
3. Espere 10 segundos com o talão prendido empurrado contra o axónio para favorecer a adesão do material para a membrana de neurites.
4. Mover a fase de micro para deslocar o rebordo preso a partir do axónio, e, portanto, verificar a sua adesão à membrana celular. Se o cordão aderido, ele escapa da armadilha óptica.
5. Afaste-se da armadilha de laser sobre o cordão aderidoe ligar o circuito força-clamp com a condição força igual a zero. Em tal forma, as fases de piezo reposiciona o grânulo, ligados à célula, no centro da armadilha óptica. Se o sistema não tiver um ciclo de realimentação de controlo, a posição da armadilha de laser pode ser movido por platina do microscópio para centrá-la sobre a sonda aderido. O centro da armadilha é alcançada quando os sinais QPD são os mesmos que quando o rebordo está preso e não aderiram à célula (sinais QPD y igual a zero e x, e o sinal QPD Z dá o mesmo valor de voltagem dos quatro quadrantes como quando o cordão é presa longe de qualquer superfície).
6. Definir um estado de força de fixação sobre o eixo z, posicionando o laser aprisionamento ligeiramente ao longo do centro do cordão (cerca de 100 nm), para gerar uma pretensão na sonda presa aderido. No caso de o sistema não está equipado com um controlo de força da braçadeira, a posição armadilha óptica pode ser levantado em passos de 25 nm, por a fase de microscópio. O sinal QPD z permite o monitoramento. Portanto, use this um sinal para ajustar a posição da armadilha de laser em relação à sonda aderido. Tal pré-tensão é necessária para detectar a tensão sobre a membrana após a lesão axonal e a consequente diminuição do movimento browniano de sonda aderido. Uma abordagem semelhante tem sido proposto para medir a libertação da tensão na membrana através de um tirante de vídeo de imagem ^19.
7. Switch-off o force feedback-clamp para medir a força na sonda aderido na condição posição-clamp (a fase piezo é bloqueado).
8. Iniciar a gravação simultânea das posições de sonda presos através do interferômetro (20 frequência de amostragem KHz), e as células durante axotomia lapso de tempo de imagem de campo claro do laser (20 Hz taxa de quadros).
9. Ligue o laser UV para entregar pulsos de laser até que uma lesão se torna visível na imagem do axônio (geralmente 200-400 pulsos ópticos são necessários energia por pulso: 25. NJ), em seguida, desligue o laser UV.
10. Continuar a gravação do interferômetro para cerca de 3 kmN, até que a x, y e z QPD vestígios atingir um patamar.

7. Quantificar a liberação total Tension

1. Converter os vestígios QPD gravados (em volts) pela sensibilidade calibrada da armadilha óptica, para se obter os respectivos vestígios em nanómetros.
2. Filtrar a x, y, z e vestígios de deslocamento por um filtro passa alto com corte de 10 Hz.
3. Calcule a variância total dos traços filtrados representando o movimento browniano do cordão preso. Calcular a variância em 25 mseg passos para as janelas de tempo de 500 ms (10.000 pontos de dados) ²⁰ sobrepostos. A filtragem passa-alto de vestígios exclui as variações de movimento Browniano, devido à flutuação ou movimento da membrana cortical actina. O movimento Browniano do cordão é reduzida pelas forças ópticas e as forças de aderência sobre a membrana celular. Quando a membrana é esticada devido à libertação de tensões a sua viscosidade aumenta, e, assim, o movimento browniano dos grânulo, detectado imediatamentediatamente após axotomia, começa a diminuir.
4. Definir t0: o início de diminuição da variação do movimento Browniano, depois do fornecimento de energia laser de UV. O instante de tempo t0 indica o início da deformação da membrana.
5. Definir t1: o fim da redução da variação do movimento Browniano (quando se atinge um planalto). O instante de tempo t1 indica o fim da estirpe membrana.
6. Realizar monitoramento de vídeo de detritos ou um arranhão com o apoio tampa de vidro, para medir qualquer desvio da amostra durante a medição de força. Para acompanhar a partícula com o apoio de vidro, nós aplicamos primeiro limiares para as imagens de campo claro, para obter uma pilha de imagens binárias com a partícula em branco sobre um fundo preto. Então, vamos acompanhar o centro de massa da partícula com precisão sub-pixel (utilizando o software ImageJ freeware).
7. Subtrair o desvio medido a partir de vestígios QPD deslocamento. Multiplique os traços QPD deriva corrigidos pela respectiva rigidez óptica calibrado (k _x, k _{y, z k) para obter os Fx, Fy, Fz traços em piconewtons.}
8. Calcule o traço força total, como F _tot = √ (Fx ^​​2 + ² + Fy Fz ^2).
9. Calcule a liberação total da força entre T0 e T1 como F _liberado = F _tot (t1) - F _tot (t0). A força medida em t0 tem que ser subtraídos, porque é devido ao deslocamento da sonda a partir o centro da armadilha, quando adere ao grânulo de neurites.
10. Calcule a área de contato entre a neurite cordão preso ea posição UV ponto de laser: na medida imagem de campo claro as longas (L) e curto eixos (D) da neurite entre o talão preso ea posição UV local laser. A área de contato do axônio é um _axônio = L x D.
11. Normalizar o total liberado força F _lançado pela área de contato do axônio A _axônio.

Resultados

A célula gera forças de tração sobre o substrato por suas adesões focais. Força gerada pelos elementos do citoesqueleto estão em equilíbrio com a força contrária do substrato de cultura. Após a lesão do laser de neurites induzido, alguns dos cabos do citoesqueleto tensos são rompidas e sua tensão equilibrada é libertado porque a força contrária do substrato de adesão é eliminada. A tensão libertado é parcialmente distribuído nas adesões focais não afectadas, e o cordão ligado à membrana celular...

Discussão

Apresentamos neste trabalho um método quantitativo para comparar a adesão neurite ao substrato da cultura, através da realização de medidas de espectroscopia de força simultânea durante a laser lesão celular induzida. A libertação da tensão medida está relacionada com o grau de adesão das células ao substrato: as células com maior número de adesões focais devem libertar menos tensão. Medição da libertação da tensão em termos de piconewtons fornece uma grandeza física pelo qual se avalia a aderên...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated	Bangs laboratories	PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit	Polyscience	19539
EQUIPMENT
IR laser	IPG Laser GmbH	YLM-5-SC-LP	ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator	Hamamatsu	LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software	Optics group, University of Glasgow	Free downloadable software	http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ	Hamamatsu	Free downloadable software	http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD	Thorlabs	S5980 with C5460SPL 6041 board	Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD	Teem Photonics	PDA100A-EC	Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser	AA-optoelctronics	PNV-001525-040	Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator	Olympus	MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope	Andor	BX51	Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD	Warner Instruments	V887ECSUVB EMCCD
Peltier device	Physic Instruments	QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage	National Instruments	Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq		NI PCI-6229	Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine			Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop