Digital em linha Holographic Microscopy (Dihm) de Assuntos Fracamente de dispersão

Resumo

As localizações tridimensionais dos objectos fracamente espalhamento pode ser identificada exclusivamente com linha digital de microscopia holográfica (Dihm), que envolve uma modificação menor para um microscópio padrão. Nosso software utiliza uma heurística de imagens simples juntamente com Rayleigh-Sommerfeld back-propagação para ceder a posição tridimensional e geometria de um objeto fase microscópica.

Resumo

Objetos fracamente dispersão, tais como pequenas partículas coloidais ea maioria das células biológicas, são encontrados com freqüência em microscopia. Na verdade, uma série de técnicas têm sido desenvolvidas para melhor visualizar esses objetos de fase; contraste de fase e DIC estão entre os métodos mais populares para melhorar o contraste. No entanto, a posição de gravação e forma na direção out-of-imaging-plano continua sendo um desafio. Este relatório apresenta um método experimental simples para determinar com precisão a localização e geometria dos objetos em três dimensões, utilizando linha digitais microscopia holográfica (Dihm). De um modo geral, o volume da amostra é definido acessíveis por o tamanho do sensor de câmara na direcção lateral, e a coerência de iluminação na direcção axial. Volumes de amostras típicas variam de 200 um x 200 um x 200 fim usando iluminação por LED, para5 mm x 5 mm x 5 mm ou maior usando iluminação por laser. Esta luz de iluminação está configurado de tal modo que as ondas planas são incidente sobre a amostra. Objetos no volume da amostra, em seguida, dispersam a luz, o que interfere com a luz unscattered para formar padrões de interferência perpendicular à direção de iluminação. Esta imagem (holograma) contém a informação de profundidade necessária para a reconstrução tridimensional, e pode ser capturada num dispositivo de imagem padrão tais como CMOS ou CCD. O Rayleigh-Sommerfeld método propagação de volta é empregada para reorientar numericamente imagens de microscópio, e uma heurística de imagens simples, baseada na fase Gouy anomalia é utilizado para identificar espalhando objetos dentro do volume reconstruído. Este método simples, mas robusto resulta em uma medida inequívoca, sem modelo de localização e forma dos objetos em amostras microscópicas.

Introdução

Linha Digital microscopia holográfica (Dihm) permite rápido imagens tridimensionais de amostras microscópicas, tais como microorganismos natação ^1,2 e sistemas de matéria mole ^3,4, com modificações mínimas para uma configuração de microscópio padrão. Neste trabalho uma demonstração pedagógica da Dihm é fornecido, centrada em torno de um software desenvolvido em nosso laboratório. Este trabalho inclui uma descrição de como configurar o microscópio, otimizar a aquisição de dados e processar as imagens gravadas para reconstruir dados tridimensionais. O software (baseado em parte no software desenvolvido pela DG Grier e outros ⁵⁾ e imagens de exemplo estão disponíveis gratuitamente em nosso site. A descrição é fornecida dos passos necessários para configurar o microscópio, reconstruir volumes tridimensionais a partir de hologramas e tornam os volumes resultantes de interesse usando um raio livre rastreamento pacote de software. O artigo conclui com uma discussão sobre os fatores que afetam a qualidade da reconstrução, E uma comparação com os métodos de Dihm concorrentes.

Embora Dihm foi descrito há algum tempo (para uma revisão geral de seus princípios e de desenvolvimento, ver Kim ^6), o poder de computação necessário e imagem perícia processamento até então muito restrito o seu uso para grupos de pesquisa especializados com foco no desenvolvimento de instrumentos. Esta situação está mudando à luz dos recentes avanços na computação e tecnologia de câmera. Computadores modernos podem facilmente lidar com o processamento e os requisitos de armazenamento de dados; CCD ou CMOS câmeras estão presentes na maioria dos laboratórios de microscopia, eo software necessário está sendo disponibilizado gratuitamente na internet por grupos que investiram tempo no desenvolvimento da técnica.

Vários esquemas têm sido propostos para a imagem da configuração de objectos microscópicos em um volume de amostra tridimensional. Muitos destes são digitalizando técnicas ^7,8, em que uma pilha de imagens é gravada por mechanically traduzindo o plano de imagem através da amostra. Microscopia de fluorescência confocal é talvez o exemplo mais conhecido. Tipicamente, um corante fluorescente é adicionado a um objecto de fase, a fim de alcançar um nível aceitável de contraste da amostra, e a disposição confocal utilizados para localizar espacialmente emissão fluorescente. Este método tem levado a avanços significativos, como por exemplo na ciência coloidal onde tem permissão para acessar a dinâmica tridimensional de sistemas lotados ^9-11. O uso de rotulagem é uma importante diferença entre a microscopia de fluorescência confocal e Dihm, mas outras características das duas técnicas podem ser comparados. Dihm tem uma vantagem significante na velocidade em que o aparelho não tem partes móveis. Os espelhos de varredura mecânica em sistemas confocal colocar um limite superior para a taxa de aquisição de dados - geralmente cerca de 30 frames / seg a imagem de pixel 512 x 512 para. Uma pilha de tais imagens em diferentes planos focais pode ser obtido por fisicamente translAting o estágio da amostra ou lente objetiva entre os quadros, o que leva a uma taxa de captura final de cerca de um volume por segundo para um quadro de pilha 30. Em comparação, um sistema holográfico com base em uma câmara moderna CMOS pode capturar 2000 quadros / seg para o mesmo tamanho e a resolução da imagem, cada imagem é processada `off-line" para dar um instantâneo independente do volume de amostra. Para reiterar: amostras fluorescentes não são necessários para Dihm, embora o sistema foi desenvolvido que executa a reconstrução holográfica de um objecto fluorescente ^12. , Bem como informações sobre o volume tridimensional, Dihm também pode ser utilizado para obter imagens de contraste de fase quantitativos ^13, mas que está fora do âmbito da discussão aqui.

Imagens de dados Raw Dihm são bidimensionais e, em alguns aspectos parecido com imagens de microscópio padrão, ainda que fora de foco. A principal diferença entre Dihm e microscopia de campo claro padrão encontra-se em anéis de difração que cercam objetos in o campo de visão, que são devido à natureza da iluminação. Dihm requer uma fonte mais coerente do campo claro - geralmente um LED ou laser. Os anéis de difração do holograma contém a informação necessária para reconstruir uma imagem tridimensional. Existem duas abordagens principais para interpretar os dados Dihm; reorientar montagem e numérica direta. A primeira abordagem é aplicável nos casos em que a forma matemática do padrão de difração é conhecido com antecedência ^3,4; esta condição é satisfeita por um pequeno punhado de objetos simples, como esferas, cilindros e obstáculos semi-plano. Montagem direta também é aplicável nos casos em que posição axial do objeto é conhecido, ea imagem pode ser equipado com uma tabela look-up de modelos de imagem ^14.

A segunda abordagem (reorientação numérico) é um pouco mais geral e se baseia na utilização dos anéis de difracção na imagem de holograma bidimensional para numericamente reconstruir o campo óptico deum número de (arbitrariamente) espaçados planos focais ao longo do volume da amostra. Existem vários métodos relacionados para fazer isto ^6, o trabalho utiliza o Rayleigh-Sommerfeld para trás técnica de propagação, como descrito por Lee e Grier ^5. O resultado deste procedimento é uma pilha de imagens que reproduzem o efeito de mudar manualmente o plano focal microscópio (daí o nome `reorientação numérica"). Depois de uma pilha de imagens tiver sido gerada, a posição do objecto do volume focal deve ser obtida. Uma série de heurísticas de análise de imagem, como a variação da intensidade local ou conteúdo de freqüência espacial, foram apresentados para quantificar a nitidez de foco em diferentes pontos na amostra ^15. Em cada caso, quando uma determinada imagem métrica é maximizada (ou minimizado), o objecto é considerado como estando em foco.

Ao contrário de outros sistemas que procuram identificar um plano focal especial quando um objeto está "em foco", o método neste trabalho escolhe pontos que se encontram no interior do objeto de interesse, que podem se estender através de uma ampla gama de planos focais. Esta abordagem é aplicável a uma ampla gama de sujeitos e é particularmente adequado para a estendida, amostras fracamente espalhamento (objectos de fase), tais como coloides de forma cilíndrica, as cadeias de bactérias ou flagelos eucariótica. Nestas amostras o contraste de imagem muda quando o objecto passa através do plano focal, uma imagem desfocada tem um centro de luz, se o objecto é, por um lado do plano focal e um centro escuro, se for por outro. Objetos puros têm pouco ou nenhum contraste quando mentem exatamente no plano focal. Este fenômeno de inversão de contraste tem sido discutido por outros autores ^16,17 e é em última análise, devido à fase de Gouy anomalia ^18. Este foi colocado em uma posição mais rigorosa no contexto da holografia em outros lugares, onde os limites da técnica são avaliados, a incerteza típica posição é da ordem de 150 nm (cerca de um pixel) em each Direcção ^19. O método anomalia fase Gouy é um dos poucos sistemas Dihm bem definidos para determinar a estrutura de objetos estendidos em três dimensões, mas, no entanto, alguns objetos são problemáticas para reconstruir. Objetos que estão diretamente ao longo do eixo óptico (apontando para a câmera) são difíceis de reconstruir com precisão; incertezas no comprimento e posição do objeto se tornam grandes. Essa limitação é, em parte, devido à profundidade pouco restrito dos pixels de gravação do holograma (o número de níveis de cinza distintos que a câmera pode gravar). Outra configuração problemática ocorre quando o objeto de interesse é muito próximo do plano focal. Neste caso, as imagens reais e virtuais do objecto são reconstruídos em grande proximidade, dando origem a campos ópticos complicadas que são difíceis de interpretar. Uma segunda preocupação ligeiramente menos importante aqui é que as franjas de difracção resultantes ocupam menos do sensor de imagem, e deste inf granulação mais grossaormação conduz a uma reconstrução de pior qualidade.

Na prática, um filtro simples gradiente é aplicado a volumes tridimensionais reconstruídos para detectar fortes inversões de intensidade ao longo da direcção de iluminação. Regiões onde a intensidade muda rapidamente do claro ao escuro, ou vice-versa, são, então, associada a regiões de dispersão. Objetos fracamente espalhamento são bem descrito como uma coleção de tais elementos não interagem ^20; estes soma as contribuições individuais para dar ao campo espalhado total que pode ser facilmente invertida com o Rayleigh-Sommerfeld volta método de propagação. Neste papel, a intensidade da técnica de gradiente axial é aplicada a uma cadeia de células de Streptococcus. Os corpos celulares são objectos de fase (a espécie de E. coli tem um índice de refracção medido ²¹ a ser 1,384 a um comprimento de onda λ = 589 nm, a estirpe de Streptococcus é provável que seja semelhante) e aparecem como uma corrente de alta intensidade de bolhas ligados entre si em ºvolume da amostra e depois do filtro de gradiente de ter sido aplicada. Limiar e da característica de métodos padrão de extracção aplicados a este volume filtrado permitir a extracção de pixels volumétricos (voxels) que correspondem à região no interior das células. Uma vantagem particular deste método é que ele permite a reconstrução não ambígua da posição de um objecto, na direcção axial. Métodos similares (pelo menos, os que registram hologramas perto do objeto, fotografada através de uma objetiva de microscópio) sofrem de ser incapaz de determinar o sinal deste deslocamento. Embora o método de reconstrução de Rayleigh-Sommerfeld é também independente de sinal neste sentido, a operação de gradiente permite discriminar entre fracas objectos de fase acima e abaixo do plano focal.

Protocolo

1. Configuração e Aquisição de Dados

1. Crescer uma cultura de Streptococcus tensão V4051-197 (natação liso) células em meio KTY do estoque congelado ^22. Incubar em um agitador rotativo, durante a noite a 35 ° C e 150 rpm, até à saturação.
2. Inocular 10 ml de meio fresco com KTY 500 ul de cultura saturada. Incubar durante mais 3,5 horas a 35 ° C e 150 rpm até as células atingirem uma densidade óptica de cerca de 1,0 a λ = 600 nm (aproximadamente 5 x 10 ⁸ células / ml).
3. Dilui-se 1:400 em meio fresco para obter a concentração final de células móveis.
4. Em uma lâmina de microscópio, fazer um anel de lubrificação (por exemplo, a partir de uma seringa cheia de vaselina) a cerca de 1 mm de altura e de colocar uma gota da solução de amostra no centro. Coloque uma tampa de vidro em cima e pressione levemente nas bordas para selar, garantindo que o líquido está em contato com os dois slides e tampa de vidro. A câmara da amostra resultante deve ser arouª 100-200 mM em profundidade.
5. Coloque a câmara de amostras no microscópio com a tampa de vidro virada para baixo, e com cuidado, para evitar a formação de bolhas de ar no óleo entre o vidro e lente.
6. Concentre-se ao microscópio sobre a superfície inferior da câmara da amostra, e trazer o condensador para o foco.
7. Desligue a iluminação padrão e colocar a cabeça do LED por trás da abertura do condensador do microscópio. Definir a fonte de alimentação do diodo emissor de potência máxima.
8. Feche a abertura do condensador ao máximo e, se necessário, deslocar o LED em sua montagem até a iluminação é centrado na abertura da lente objetiva.
9. Ligue o computador e câmera, e redirecionar toda a luz de porta da câmera do microscópio. Ajustar a taxa de quadros eo tamanho da imagem no software de aquisição de imagem.
10. Faça o tempo de exposição quadro tão curto quanto possível, mantendo um bom contraste. Verificar uma imagem do histograma da intensidade de assegurar que a imagem não é saturaçãoted ou subexposta.
11. Se for necessário, reorientar o microscópio a fim de que objeto de interesse é ligeiramente desfocado (normalmente por 10-30 mm). O objecto e o plano focal deve estar no mesmo meio (isto é, o plano focal deve situar-se dentro da câmara de amostras).

2. Reconstrução

A primeira etapa do processamento de dados é de reorientar numericamente um quadro de vídeo em uma série de diferentes profundidades, produzindo uma pilha de imagens. Software de fácil utilização para fazer isso podem ser encontradas aqui: http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html juntamente com exemplos de imagens (adquiridos usando um microscópio invertido, e uma imersão em óleo lente objetiva 60X) e um arquivo de cena para ray rastreada renderização.

1. Insira o quadro de interesse e seu respectivo fundo como arquivos de imagem separados, nas caixas relevantes sobre a interface. A imagem de fundo é um quadro que fairly representa o fundo do vídeo, na ausência do holograma, e irá ser utilizado para suprimir o ruído de padrão fixo que poderia interferir com o holograma de localização e análise.
2. Digite os valores para as configurações globais caixas do lado esquerdo da tela antes de executar o programa. Os três primeiros são parâmetros pilha de saída: posição axial do primeiro enquadramento ('Start foco'); número de fatias na pilha reconstruído ('Número de passos'); distância axial entre cada fatia na pilha ("Tamanho do passo ') .
3. A fim de reconstituir os objectos com as proporções correctas, o tamanho do passo deve ser do mesmo tamanho que o espaçamento do pixel lateral. Digite frequência de amostragem laterais da câmara (espaçamento 1/pixel) na caixa 'Pixel / mícron ", o comprimento de onda de iluminação e índice de refração médio nos últimos dois caixas. Valores padrão do programa são adequados para reconstruir os dados de exemplo.
4. Pressione o botão 'Flip Z-gradiente' se o centro do object é escuro no holograma (ver exemplo quadro de 2005 ea seção de discussão para mais detalhes).
5. Verifique o filtro de banda em estado / off (o padrão é ativado). Este filtro de banda opcional, localizado em uma caixa abaixo do interruptor gradiente-flip, é responsável pela supressão da contribuição a partir de pixels ruidosos. O filtro passa-banda é aplicado a cada fatia de imagem imediatamente após geração.
6. Verifique o interruptor de saída intermediária on / off estados (padrão é ligado). Etapas de análise Intermediate são escritos em dois vídeos de saída, como descompactado avi:. A primeira é a pilha reorientada (nome do arquivo que termina em '_stack.avi'), o segundo é a pilha após a operação inclinação axial (nome do arquivo que termina em ' _gradient.avi '). Idealmente, esta segunda pilha conterá o objeto de interesse destacado como um objeto brilhante contra um fundo escuro.
7. Depois de definir todos os parâmetros, pressione 'Run' na janela principal. O quadro selecionado irá aparecer na caixa principal do software.
8. Use oampliação ferramenta de vidro encontrado na barra de ferramentas à esquerda da imagem para aumentar o zoom (botão esquerdo) e zoom out (shift + clique esquerdo). Use a ferramenta retângulo na barra de ferramentas para selecionar uma região de interesse (ROI). Capturar o maior número de franjas do holograma possível dentro do retângulo, pois isso irá otimizar a reconstrução.
9. Pressione o botão "processo" para gerar as duas pilhas de imagens. Inspecione as pilhas resultantes usando ImageJ (que pode ser obtido gratuitamente no http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Se o objeto de interesse pode ser visto claramente na pilha de gradiente, siga para o passo seguinte para extrair as coordenadas de objetos.

3. Representação

1. Além quadro reorientação, este programa pode localizar as coordenadas x, y, z para cada voxel no objeto de interesse. Pressione o botão 'Feature Extraction "para activar esta função.
2. Digite um caminho, incluindo a extensão (por exemplo: c: home output.inc), para asaída coordena arquivo. Selecione "estilo POV-Ray 'na caixa' saída coordenar estilo '. Isso faz com que o programa para gravar um arquivo de objeto que pode ser visualizada usando o pacote de software livre raytracing POV-Ray (que pode ser obtido a partir de http://www.povray.org/ ).
3. Reprocessar as imagens como na seção 2 acima. O programa irá fornecer uma série de (x, y, z) coordena no ROI selecionado, escrito para o nome do arquivo no 'Output coordenar' caixa. Extração de coordenadas de objetos leva muito mais tempo do que a geração de pilha.
4. Certifique-se de que o arquivo POV-Ray amostra (fornecido com o código de reconstrução) está na mesma pasta que as coordenadas do arquivo apenas gerado. Edite o arquivo pov amostra. E substituir o nome do arquivo entre aspas na linha
   # Include "MYFILE.inc"
   com o nome do ficheiro de dados gerados pelo código de reconstrução.
5. Clique no botão "Executar" no POV-Ray para renderizar uma imagem bitmap. Tele a posição da câmera, iluminação e opções de textura são apenas algumas das personalizações possíveis no POV-Ray, consulte a documentação on-line para obter mais informações.

Resultados

Para demonstrar as capacidades do Dihm, os experimentos foram realizados em uma cadeia de bactéria Streptococcus. A cadeia em si medido 10,5 milímetros de comprimento, e era composto por 6-7 células esférico-cilíndrica (duas das células na cadeia estão perto dividindo), com diâmetros na gama de 0,6-1 um. Figuras 1a e 1b mostram a interface principal da reconstrução e software de renderização. Exemplos do procedimento numérico reorientação são vistos na F...

Discussão

O passo mais importante neste protocolo experimental é a captação precisa das imagens de uma instalação experimental estável. Com pobres dados de fundo, alta fidelidade de reconstrução é quase impossível. Também é importante para evitar as lentes objectivas com um elemento interno de contraste de fase (visíveis como um anel escuro quando se olha através da parte de trás do objectivo), como este pode degradar a imagem reconstruída. O objeto de interesse deve ser longe o suficiente do plano focal que algun...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362