Um método sensível para quantificar células senescentes Câncer

Resumo

Se senescência impede ou promove tumorigenesis permanece controverso. Desde agentes quimioterápicos podem induzir as células cancerosas senesce, estudando senescência é essencial para propor novas terapias. No entanto, o ensaio de β-galactosidase padrão e amplamente utilizado apresenta grandes inconvenientes. Propomos aqui um fluxo de ensaio baseado em citometria rápido e sensível para quantificar a senescência.

Resumo

As células humanas não proliferar indefinidamente. Após a estímulos externos e / ou intrínseco, as células podem morrer ou entrar em uma parada do ciclo celular estável chamado de senescência. Vários mecanismos celulares, tais como o encurtamento dos telómeros e a expressão anormal de oncogenes mitogénicos, têm sido mostrados para causar a senescência. A senescência não está restrita às células normais, as células cancerígenas têm também sido relatada a senescência.

Agentes quimioterápicos têm demonstrado induzir a senescência das células cancerosas. No entanto, permanece controverso se a senescência impede ou promove a carcinogênese. Como se pode, eventualmente, ser específico para cada paciente, um método rápido e sensível para avaliar a senescência celular no cancro logo será necessária.

Para este fim, o ensaio padrão β-galactosidase, o método utilizado correntemente, apresenta inconvenientes importantes: é demorado e não é sensível. Propomos aqui um fluxo de ensaio baseado em citometria de estudar senescência em live células. Este ensaio tem a vantagem de ser rápido, sensível e pode ser acoplada ao imunomarcação de vários marcadores celulares.

Introdução

Desde o início dos anos sessenta e sua descoberta por Hayflick e Moorhead, senescência ainda permanece uma curiosidade celular ^1. As células humanas não indefinidamente proliferar e, por senescência, Hayflick e Moorhead cunhou o processo de envelhecimento celular. A senescência é uma paragem do ciclo celular estável em que as células permanecem metabolicamente activa em oposição à morte celular. Até à data, quatro mecanismos celulares têm sido mostrados para induzir a senescência: encurtamento dos telómeros, danos no ADN, perturbação da cromatina e a expressão anormal de oncogenes mitogénicos ^2. Isto indica que não só as células normais, mas também as células cancerígenas são capazes de sofrer a senescência ^3. Por uma questão de facto, as células de cancro sujeitos a senescência foram mostradas para constituir uma barreira para a progressão do tumor ^4-5. No entanto, vários relatórios já apontou que, em determinadas circunstâncias, a senescência celular também pode promover malignidade ^6-7. Estudar senescência de câncer cells está prestes a tornar-se um impulso na pesquisa do câncer, como atualmente utilizado medicamentos quimioterápicos podem levar a senescência das células cancerosas não apenas in vitro, mas também in vivo ^8.

O ensaio principal para investigar quanto à presença de células senescentes, é o ensaio de β-galactosidase a um pH ácido. Este ensaio histoquímico reflecte o aumento na biogénese lisossómica ocorrendo na maioria das células senescentes. Resumidamente, exógena de X-gal, aplicada às células, é clivada pela β-galactosidase enriquecido em lisossomas de células senescentes, dando origem a uma cor azul ^9. As células senescentes azul podem então ser quantificado num microscópio de campo claro. Embora muito popular, o ensaio β-galactosidase apresenta grandes inconvenientes. Em primeiro lugar, este ensaio é efectuado em células fixadas. Em segundo lugar, é demorado porque implica para quantificar o grau de senescência por contagem de um número significativamente maior de células senescentes, sob um microscópio. Terceiro, este testeNão é tão sensível a discriminação entre as células senescentes e não senescentes inteiramente depende do observador.

Discute-se aqui, um ensaio baseado em citometria rápido e sensível para avaliar inexplorado para a presença de células senescentes vivos. Este ensaio baseia-se na hidrólise de uma molécula da membrana permeável, o 5-di-dodecanoylaminofluorescein β-D-galactopiranósido (C ₁₂ FDG), por β-galactosidase enriquecida em células senescentes. Depois da hidrólise e da excitação do laser, a ₁₂ C FDG emite fluorescência verde e pode, portanto, ser detectada por citometria de fluxo ^{10, 11.} A detecção de células senescentes através de citometria de fluxo tem a grande vantagem de ser rápida e sensível. Além disso, a detecção de células senescentes, por citometria de fluxo pode ser combinada com a detecção de outros marcadores celulares. Este ensaio pode ser usado para detectar células senescentes dentro de uma população de células cancerígenas tratadas com quimioterapia, e pode ser rotineiramente ajustadose em cortes de tecidos, após a dissociação celular, na clínica.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Preparação de C12FDG, bafilomicina A1 e Cultura de Células

1. Dissolve-se o pó C ₁₂ FDG em dimetil sulfóxido (DMSO) a uma concentração final de 20 mM. Alíquota e armazenar a -20 ° C. DMSO deve ser utilizado com condições de segurança apropriadas.
2. Dissolve-se o pó A1 bafilomicina em DMSO para uma concentração final de 0,1 mM. Alíquota e armazenar a - 20 ° C. Bafilomicina deve ser utilizado com condições de segurança apropriadas.
3. Cultivar a linha de células RPMI 8226, ou outras linhas de células aderentes ou não, em meios contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos, a 37 ° C, 5% de CO _2. Estimar o número de células necessárias para o experimento. A fim de registar um número suficiente de eventos durante a análise de citometria de fluxo, 5 x 10 ⁵ células são necessários. Para determinar a porcentagem de células senescentes, são necessárias três amostras de células: Amostra sem rótulo, as células não tratadas marcadas com C ₁₂ FDG, células tratadas corados comC ₁₂ FDG.
4. Sementes das células 24 h antes do experimento de realização de modo a que as células estão na fase de log da curva de proliferação celular.

2. A indução da senescência

1. Induzir a senescência das células cancerosas, adicionando um medicamento quimioterápico. Concentração da droga e da duração do tratamento deve ser adaptado ao tipo de célula testada. Comece com um tratamento de 48 horas com a concentração final de 50 nM para a doxorrubicina numa concentração de células de cerca de 10 ⁶ células / ml. Não se esqueça de incluir amostra não tratada (controle negativo).

3. Bafilomicina A1 Tratamento

1. Verificar a viabilidade celular em células de mistura com azul de tripano (v / v), com o medicamento quimioterápico utilizado no passo anterior pode levar à apoptose celular. Encher uma câmara de Malassez e contar o número de células azuis (células mortas) e de glóbulos brancos (células vivas). Se a percentagem de viabilidade for inferior a 70%, as células mortas pode ser removed usando um kit adequado para assegurar que as células mortas não influenciará a análise subsequente.
2. Remova os meios de cultura e substituir por novos meios de cultura pré-aquecido. Tratar as células com uma concentração final de 100 nM de bafilomicina A1. Bafilomicina A1 é utilizado para neutralizar o pH ácido dos lisossomos. Incubar 1 hora a 37 ° C, 5% de CO _2.

4. C ₁₂ FDG Coloração

1. Dissolve-se ₁₂ C FDG em meios de cultura fresco pré-aquecido, a uma concentração final de 2 mM.
2. Adicionar o composto às células na concentração final de 33 uM e incubar 2 h a 37 ° C, 5% de CO _2. Se utilizar as células não aderentes, centrifugar as células a 300 xg por 5 min a 4 ° C (a velocidade pode ter que ser ajustada para o tipo de célula utilizado), lavar 2x com PBS. Ressuspender o sedimento celular em 500 uL de PBS frio. Se estiver usando células aderentes, remova a mídia e lavar 2x com PBS. Colher as células aderentes utilizando uma solução de tripsina e centrifugaras células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C (a velocidade pode ter que ser ajustada para o tipo de célula utilizado). Ressuspender o sedimento celular em 500 uL de PBS frio. Em ambos os casos, a concentração de células deve ser de cerca de 10 ⁶ células / ml.
3. Realizar um co-imunomarcação para caracterizar ainda mais a população de células senescentes.

5. Análise de Citometria de Fluxo

1. Calibrar o citómetro de fluxo, utilizando os grânulos de controlo recomendadas pelo fabricante do citómetro de fluxo. Para todas as etapas de, pelo menos, 10 eventos de ⁴ têm de ser registadas.
2. Executar a primeira amostra contendo células não marcadas. Prepare a dois parâmetros gráfico exibindo Canal Forward Scatter (FSC) versus Side Canal Scatter (SSC). Defina os tubos fotomultiplicadores (PMT) e definir uma região de interesse excluindo as células mortas e restos celulares que poderiam ter aparecido durante a preparação da amostra. Portão esta região de interesse de um histograma de um parâmetro FL1 exibindo na escala de logdo eixo x e o número de eventos no eixo y. O número total de eventos representa o número de células analisadas. Definir a PMT de modo que as células não marcadas aparecem na primeira década na escala de log do eixo x. Determinar a autofluorescência das células, se necessário.
3. Executar a segunda amostra contendo células não tratadas. No histograma um parâmetro exibindo FL1 (fluorescência de C ₁₂ FDG), coloque o cursor após a população mal rotulados. Este limite vai permitir a discriminação entre células não senescentes (células mal rotulados) e células senescentes (células vivas rotulados).
4. Executar a terceira amostra contendo células tratadas. Brilhantemente células rotuladas, ou seja, células senescentes aparecem acima do limite determinado na etapa anterior. Avaliar a percentagem de células senescentes, dividindo-se o número de eventos brilhantes por o número total de eventos. Se necessário, a actividade de a-galactosidase β também pode ser estimada utilizando a média de fluorescênciaintensidade.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Mieloma múltiplo, uma malignidade hematológica, foi utilizado para avaliar a senescência induzida por um procedimento quimioterápico. Para fazê-lo numa linha de células MM comercialmente disponível (RPMI 8226) foi tratado durante 2 dias com doxorubicina, um fármaco quimioterápico. As células foram então submetidas a um tratamento bafilomicina A1 e ainda incubadas com ₁₂ C FDG. As células foram analisadas por citometria de fluxo. Figura 1 ilustra as diferentes etapas, e mostra que ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Apresentamos aqui um método baseado em citometria de fluxo para quantificar a senescência celular em células cancerosas vivas. Este método baseia-se na utilização do composto membrana permeável, a ₁₂ C FDG, e pode, portanto, ser utilizado em qualquer tipo de célula e depois de vários tratamentos, desde que o composto é absorvido pelas células. Após a absorção celular, a ₁₂ C FDG é hidrolisado pela β-galactosidase, enriquecido em lisossomas de células senescentes. Após excitação ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside	Invitrogen	D-2893
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Bafilomycin A1	Sigma	B1793
Doxorubicin	Sandoz
Trypan blue	Sigma	T8154
RPMI 1640 cell culture medium	Lonza	BE12-702
Fetal calf serum	PAA Laboratories GmBH	A15 101
Antibiotics	Gibco	5290-018
Gallios flow cytometer	Beckman Coulter	A94291