O<em&gt; Em ovo</em&gt; CAM-ensaio como um Xenograftmodel para o Sarcoma

Resumo

O In ovo Membrana corioalantóica (CAM) está enxertado com sarcoma de tecidos frescos derivadas de tumor, as suas suspensões de células individuais, e marcados com fluorescência de linhas de células de sarcoma estabelecidas permanentes e transientes. O modelo é usado para estudar enxerto (viabilidade, Ki67 índice de proliferação, necrose, infiltração) e host (infiltração de fibroblastos, neoformação vascular) comportamento.

Resumo

Sarcoma é uma doença muito rara, que é de natureza heterogénea, toda a impedir o desenvolvimento de novas terapias. Pacientes com sarcoma são candidatos ideais para a medicina personalizada após estratificação, explicando o interesse atual no desenvolvimento de um modelo de xenotransplante reprodutível e de baixo custo para esta doença. A membrana corioalantóide garota é uma série imunodeficientes natural, capaz de sustentar os tecidos enxertados e células sem restrições específicas de cada espécie. Além disso, é facilmente acedido, manipulados e fotografada usando estereomicroscopia óptica e fluorescência. Histologia permite análise mais detalhada das interações celulares heterotípicos.

Este protocolo descreve em pormenor o enxerto in ovo da membrana corioalantóica com sarcoma derivados de tecidos frescos de tumor, as suas suspensões de células individuais, e marcados com fluorescência de linhas de células de sarcoma estabelecidas permanentes e transientes (Saos-2 e SW1353). O rato sobrevivência garotaes são de até 75%. O modelo é usado para estudar enxerto (viabilidade, Ki67 índice de proliferação, necrose, infiltração) e host (infiltração de fibroblastos, neoformação vascular) comportamento. Para localizada enxertia de suspensões de células individuais, de ECM de gel proporciona vantagens significativas em relação aos materiais de contenção inertes. O índice de proliferação Ki67 está relacionada com a distância entre as células da superfície da CAM e a duração da aplicação no CAM, este último determina um período de tempo para a adição de produtos terapêuticos.

Introdução

Sarcoma é um tumor raro do tecido conjuntivo com uma elevada mortalidade devido à resistência à terapia ^1,2. O progresso na sobrevida do paciente é dificultada pela sua baixa incidência anual, sua ampla diversidade, eo fato de que as células do sarcoma são relatados para ser difícil de cultura in vitro ^3,4.

A utilização de células de cultura para a avaliação pré-clínica terapêutica revelou que novas moléculas, aparentemente activos in vitro nem sempre reflectem os resultados na prática clínica. Além disso, as aberrações genoma reveladas por matrizes de expressão de genes nem sempre são correlacionados às características do comportamento do tumor no doente ^5-7. A fim de tentar resolver estes problemas, a medicina personalizada ganhou em importância, o que se reflete no aumento da procura de modelos de xenoenxerto ^8-12.

Um ensaio in vivo tem a vantagem de refletir a complexa interação entre cAncer células e para o ambiente de tecido do hospedeiro em tumores sólidos, necessários para a proliferação e invasão de ¹³ cancro. Atualmente, estudar o uso do ensaio de membrana cório-alantóide (CAM-ensaio) como um modelo de xenoenxerto reprodutível para sarcoma ^14,15. Este teste é amplamente usado para o estudo da angiogénese tumoral ^16,17. Na literatura, no entanto, encontrámos protocolos diferentes para este ensaio, enquanto que outros estudos observada uma marcada diferença no crescimento ou angiogénese de acordo com diferentes protocolos de ^18,19.

Neste artigo, foi investigado o efeito da variação das condições do ensaio de CAM, no comportamento de células de tumor, utilizando enxertos de suspensões de células únicas derivadas de tumor e culturas de células de sarcoma estabelecidos.

Protocolo

Veja a Figura 1 para uma visão geral

Material tumoral

1. Obtenção e preparação de amostras de tumor

Para a utilização do material do paciente, é necessária a aprovação do Comité de Ética e consentimento informado tem de ser obtida a partir do paciente.

1. Colheita de material representativo (mínimo de 1 cm ^3), no momento da intervenção, ou de uma biópsia ou uma ressecção de um sarcoma. O próprio site da biópsia é definida usando dinâmico de contraste MRI.
2. Colocar imediatamente o material num frasco estéril contendo meio DMEM suplementado com 1,000 U de penicilina e 1 mg / ml de estreptomicina.
3. Transportar o frasco imediatamente (30 - 90 min), para o laboratório.

Todos os seguintes procedimentos são realizados sob fluxo laminar.

4. Verter o conteúdo do frasco para uma placa de Petri esterilizada.
5. Coloque a amostra de tumor em pequenas partes do máximo 1 m³ m utilizando um bisturi esterilizado. Remover todas as partes calcificadas pois tendem a diminuir ainda mais o processamento do tecido.
6. Aleatoriamente levar 10 enxertos tumorais para aplicação no CAM.

2. Preparação de suspensões de células derivadas de tumor individuais

Duração aproximada: 3 horas

1. Pesa-se o tecido remanescente da amostra.
2. Colocar 2-4 gramas de tecido num tubo dissociador, mais do que um tubo pode ser necessária para digerir todo o tecido do tumor remanescente.
3. Para a digestão de 2-4 g de tecido, adicionar 2,5 ml de solução de colagenase 2 (500 U / ml de meio RPMI 1640) e uma solução de 2,5 ml de ADNase (22 KU / ml de RPMI 1640).
4. Processar o tecido de acordo com o protocolo h_tumor dissociador. Isto envolve dois ciclos de incubação a 37 ° C na incubadora de CO _2, enquanto o tubo é suavemente agitada durante 30 min.
5. Filtrar a suspensão restante através de um filtro de células 150 mM.
6. Centrifuga-se o ligado a 1000 rpm, durante 5 min.
7. Remover o sobrenadante.
8. Ressuspender o sedimento em 10 ml de tampão de lise de eritrócitos (BLI), permitindo que os 10 minutos de incubação com a suspensão regular.

Nota: tampão de lise dos eritrócitos é fabricada como se segue: Adicionar 0,037 g de EDTA, 0,99 g de K ₂ HPO _4, 8,29 g _de NH ₄ Cl a 1.000 ml de água, o uso de NaOH 10 N para ajustar o pH para 7,3, filtro sob pressão através de um 0,22 filtrar. Armazenar a 4 ° C.

9. Adicionar 25 ml de meio de cultura (DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina) para parar a reacção.
10. Centrifugar a suspensão a 1000 rpm durante 5 min. A cor da pastilha deve ser branco agora.
11. Remover o sobrenadante.
12. Adicionam-se 5 ml de meio ao sedimento. Filtrar a suspensão através de um filtro de 70 | iM de células.
13. Conte o número de células vivas / ml por meio de um contador de células automático.

3. CLinhas Celulares Ancer

SAOS2 células de osteosarcoma (número ATCC: HTB-85) que expressam a proteína fluorescente verde melhorada foram electroporadas com vector pEGFP-C1 usando a linha celular Kit Nucleofector V de acordo com o protocolo do fabricante. Para estabelecer linhas celulares estáveis, as células transfectadas foram seleccionadas em G418 (1 mg / ml), durante 4 semanas, em conformidade com o protocolo estabelecido anterior ^20. Além disso, a triagem foi realizada por triagem de células activadas por fluorescência (FACS) de acordo com as instruções do fabricante.

Células da linha de células de condrossarcoma de SW1353 (número ATCC: HTB-94) ou de tumores recentemente preparadas suspensões de células únicas são rotulados usando uma membrana lipofílico fluorescente mancha vermelha.

1. Remover as células do frasco de cultura de um modo clássico utilizando tripsina (0,5% p / v) de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 0,2% p / vol) de solução.
2. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 1000 rpm.
3. Remover o supernatant.
4. Adicionar 1 ml de meio isento de soro, e 5 ul de DII (Vybrant vermelho) / 10 ⁶ células.
5. Embrulhe o frasco em papel alumínio e coloque-o na incubadora de CO ₂ por 10 min a 37 ° C.
6. Centrifugar novamente durante 5 min a 1000 rpm e remover o sobrenadante.

Ensaio membrana Corioalantóide

1. Incubação dos ovos

1. Ovos fertilizados de uma incubadora comercial local, garantindo 95% de fertilização dos ovos são obrigatórios.
2. Os ovos fertilizados podem ser armazenadas à temperatura ambiente até 10 dias.

Nota: antes de iniciar a incubação, sujidade, penas e excrementos são cuidadosamente removidos das cascas mecanicamente por limpeza a seco com toalhas de papel, que possuem uma áspera ao invés de uma estrutura de superfície macia. Limpar os ovos com 70% de etanol desnaturado ou de qualquer outro reagente de limpeza reduz significativamente a taxa de sobrevivência dos embriões de galinha.

3. Coloque os ovos na incubador de um lado, a marcação da superfície superior. O dia em que os ovos são colocados na incubadora é designado 0 dias do desenvolvimento embrionário.
4. Ajustar a temperatura de incubação a 37,8 ° C e a humidade de 47%. Certifique-se que a opção de rotação automática está desligado.

2. Abertura dos Ovos

Duração: 60 min ± 25 para ovos

No desenvolvimento dia 3, os ovos estão abertos com fluxo de ar laminar. Abrindo os ovos em um desenvolvimento mais resultados do estágio em danos para o CAM, como a membrana tende a ficar com o shell. Uma lâmpada de infravermelhos é usado para manter os ovos quentes durante o procedimento. Para melhorar a esterilidade, recomendamos o uso de luvas de mão.

1. Coloque o ovo na eggcup, com o lado virado para cima acentuado.
2. Diminuir o nível da CAM removendo dois ml de albumina através de uma agulha G 18 inserido na extremidade do ovo. Se a agulha estiver fechado após perfurar várioscascas de ovos, substitua a agulha. Se não, muita força tem de ser exercida, o que resulta em danos para a gema de ovo ou fractura do reservatório. Por vezes, a agulha é bloqueada pelo chalazae, uma das duas bandas em espiral para a suspensão da gema de albúmen. Isto pode ser resolvido empurrando suavemente o êmbolo para baixo até que o bloco seja resolvido. Se a gema de ovo é aspirado para dentro da seringa, substituir a agulha, bem como a seringa. Por vezes, o embrião morre após este evento. Se uma quantidade insuficiente de albúmen é removido, o CAM será danificado quando o invólucro é retirado.
3. Aplicar uma camada adesiva semi-permeável, no lado superior do reservatório marcada, a fim de evitar o derramamento de partículas de casca sobre a CAM durante o corte da janela.
4. Fazer um buraco com a introdução de um pequeno furador na superfície do ovo.
5. Corte uma janela de 1 cm ² no shell, usando um par de tesouras cirúrgicas estéreis pontiagudo.
6. Pulsante coração do embrião e vasos adjacentes podem ser observados no the superfície da gema de ovo. Retire os ovos não fertilizados ou embriões mortos. Um aspecto interrompido dos vasos sanguíneos caracteriza embriões mortos.
7. Selar a janela com uma película adesiva semipermeável. Não é necessário para cobrir o local da punção, a menos que a casca rachou durante a inserção da agulha.

3. Procedimento de Inoculação

Duração: ± 1 hora por linha celular

Em garota desenvolvimento embrionário dia 9, os ovos são inoculados sob fluxo de ar laminar.

Avaliação da célula cancerosa espalhando pela CAM requer confinamento das células para uma superfície limitada durante a inoculação. Matrigel é uma matriz de (ECM) em gel extracelular do sarcoma de rato Engelbreth-Holm-Swarm frequentemente utilizados em condições de cultura de células experimentais. É um líquido, quando arrefecida, mas irão sofrer polimerização activado termicamente, quando trazida a 20 - 40 ° C, formando, assim, um gel estável. Duranteos experimentos, Matrigel é mantido em uma caixa contendo o derretimento do gelo.

Nota: Nós insistimos em não usar lamelas perfuradas. Observou-se ligação e crescimento de células cancerosas enxertadas sobre o disco plástico, assim, o potencial de polarização das células na própria membrana crescimento.

1. Ressuspender a pelota de células em gel de ECM arrefecido a uma concentração de 10 ⁶ células/100 ul de gel de ECM. Manter esta solução em gelo derretido.
2. Impostos parte da membrana semi-permeável com um par de cirurgia estéril sob fluxo laminar. Se a película de adesivo é removido completamente, isto irá resultar em uma proporção maior de morte do embrião devido à contaminação.
3. Toque a direita CAM abaixo da janela do escudo levemente com uma vareta de vidro esterilizada, para remover a camada de células epiteliais. Tocando a CAM com uma vareta de vidro esterilizada prova ser menos traumático do que usando um bisturi n ° 11, o que requer mais maneabilidade e experiência. Podem ocorrer pequenas hemorragias.
4. Adding material tumoral.
5. Para enxertos tumorais: abaixe um pedaço de tecido sobre a CAM com um par de pinças estéreis, sem apertar.
6. Para o procedimento de gel de ECM: 4x Adicionar 25 ul da suspensão de gel de célula-ECM para o CAM, em cima umas das outras, permitindo que o gel de ECM para polimerizar entre as aplicações. Desta forma, uma placa aderente contendo as células do cancro é criado.
7. Selar a janela do shell novamente com uma película adesiva semipermeável.

4. Imagem e colheita do CAM

Duração: 2 horas para 25 ovos

Em garota desenvolvimento embrionário dia 16, os CAMs são colhidas. Trabalhando sob fluxo de ar laminar não é necessário.

1. Ampliar a janela com um par de tesouras cirúrgicas. Certifique-se de não cortar muito baixo, caso contrário, o CAM será danificado, resultando em sangramento dos vasos lesados.
2. Adicionar 300-500 mL de PBS ^D com uma pipeta na seita CAMiões contendo o material inoculado. Se não forem utilizadas sondas fluorescentes, tamponado pode ser utilizado como o que torna a membrana mais rígida, o que facilita o corte da membrana.
3. Adicione uma fotografia da CAM no ovo através de um microscópio de fluorescência estéreo, equipado com uma câmara de cor digital, usando tanto o GFP ou o filtro de DSR e nenhum filtro. Para os enxertos tumorais, todas as fotografias são feitas sem filtros. Iluminação de cima por luzes LED é fortemente recomendado durante a fotografar (Figura 2).
4. Migração de células tumorais recorde de células marcadas. As bordas dos tumores pode ser irregular e desgastado. Células dispersas podem estar presentes perto das fronteiras do tumor. Em alguns casos, contudo as linhas de células de tumor pode ser observado (Figura 3).
5. Cortar a membrana com um par de tesouras estéreis na fronteira deitado contra a casca.
6. Coloque a CAM colhidas numa placa de Petri estéril cheio com PBS ^D ou tamponada paraformaldeído.
7. Adicione uma fotografia de tanto do lado superior e do lado inferior da CAM, ambos com e sem o filtro.
8. Colocar a membrana em um recipiente rotulado com formol tamponado durante pelo menos 72 horas.
9. Incorporar os CAMs em parafina e prepará-los para exame histológico. Ter o cuidado de cortar os enxertos de tumor no centro do nódulo, certificando-se a superfície de corte é paralela à parte inferior da cassete. Se não, a interacção entre o CAM e o enxerto do tumor não será visível. A mesma estratégia aplica-se às placas de gel de ECM: a superfície voltada para a lâmina de corte deve ser perpendicular à placa.

5. A avaliação histológica

Hematoxilina-Eosina e Ki-67 imuno-histoquímica foram realizados para maiores esclarecimentos, se necessário. A imuno-histoquímica foi realizada em secções de tecido embebidas em parafina fixados com formaldeído 3,5 um de espessura, utilizando um corante corrediça automatizado de acordocom as instruções do fabricante. Foi utilizado um anticorpo monoclonal de ratinho primário para o Ki-67 (clone MIB-1, diluição de 1/100). Induzida pelo calor epitopo recuperação foi realizado utilizando células Condicionamento 1, ea visualização foi realizada com o Kit de Detecção de DAB universal, de acordo com as instruções do fabricante. Desidratação de as secções de tecido foi realizada utilizando um coverslipper automatizado.

Para o SAOS2 e as linhas de células SW1353, o número de células Ki67-positivas e-negativas Ki67 nuclei/100 mM ² foram contadas em três zonas: uma perto da fronteira do CAM, uma perto da superfície e um no centro do a placa de gel de ECM. Este procedimento foi repetido para cada lâmina 6x Ki-67 coradas. O índice de proliferação foi determinada para cada lâmina, dividindo o número de células Ki67-positivas pelo número total de células contadas.

A necrose é definida por uma perda de dispersão fina da cromatina no núcleo da célula, acompanhado por fading de margens das células distintas. Para xenotransplantes, a necrose é pontuado como completa, parcial (muitas vezes à superfície), ou está ausente. A infiltração de células de tumor na CAM é definida pela observação de células tumorais dentro da mesoderme da CAM, e é marcado como estando presente ou ausente.

Três itens são marcados para o comportamento host. Infiltração de fibroblastos é definido como células alongadas deixando a CAM e invadir o enxerto / placa do tumor, e é marcado como estando presente ou ausente. Crescimento interno vascular pode ser observado como o crescimento interno de proliferação de vasos pintainho, caracterizados pela presença de eritrócitos nucleados do pintainho.

Resultados

Avaliação da CAM

Enxertos de tumor se tornar aderente à CAM (Figura 2A). As suspensões de células únicas de material paciente frequentemente exibir uma seco, a placa ligeiramente levantada (Figura 2D). Após a excisão da CAM, marcado enrugamento da membrana ocorre (figuras 2E e 2F).

Para as linhas celulares comerciais da placa torna-se mais opaca com o tempo, indicando a proliferação de cé...

Discussão

Momento da inoculação e da colheita

Temporizando no dia da inoculação foi realizada utilizando gel de SAOS2 em ECM (CAMs 36) e variou entre o dia de desenvolvimento embrionário 5 e 10.

Antes da incubação dia 9, o CAM não foi consistentemente grande o suficiente para suportar o gel ECM foi aplicado. Na colheita, as células tumorais, por vezes, tinha de ser recuperado do CAM mais profunda, e algumas amostras de gel ECM estavam mentindo solta no albúmen ou no...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line Nucleofector Kit V	Amaxa	VCA-1003
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)	Sigma Aldrich	C6885
DMEM	Invitrogen	41965-039
DMSO	Sigma	D8418
Dnase solution	Sigma Aldrich	DN25
G418	Invitrogen	11811031
Matrigel	Sigma-Aldrich	E1270
mouse primary monoclonal antibody Ki67	Dako Denmark	MIB-1
Paraformaldehyde	Fluka	D76240
PBS	Invitrogen	20012019
PBSD	Invitrogen	14040083
peGFP-C1 vector	Clontech	632470
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15140163
RPMI	Invitrogen	22409-015
Trypsin-EDTA solution	Invitrogen	25300054
Vybrant cell-labeling DiI	Lifetechnologies	22885
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
digital color camera	Leica	DFC 340 FX
Digital Egg Incubator	Auto Elex Co	R-COM 50
FACS	BD Biosciences	FACSAriaIII
Gentlemacs C-Tube	Miltenyi Biotech	130-093-237
Gentlemacs Dissociator	Miltenyi Biotech	130-093-235
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol	Miltenyi Biotech
[header]
semipermeable adhesive film (Suprasorb F)	Lohmann&Rauscher	20468
stereo fluorescence microscope	Leica	M205 FA
Tissue-Tek Film automated Coverslipper	Sakura	6400
ultraView Universal DAB Detection Kit	Ventana Medical Systems Inc	760-500
Ventana Automated Slide Stainer	Ventana Medical Systems	Benchmark XT