Síntese, Entrega Celular e<em&gt; In vivo</em&gt; Aplicação de sensores de pH à base de Dendrímero

Resumo

Sensores de fluorescência são ferramentas poderosas nas ciências da vida. Aqui, descrevemos um método para sintetizar e utilizar os sensores fluorescentes baseados em dendrímero para medir o pH em células vivas e in vivo. O andaime dendríticas aumenta as propriedades de corantes fluorescentes conjugados levando a melhores propriedades de detecção.

Resumo

O desenvolvimento de indicadores fluorescentes representado uma revolução para as ciências da vida. Geneticamente codificados e fluoróforos sintéticos com capacidade de sensoriamento permitiu a visualização de espécies biologicamente relevantes com alta resolução espacial e temporal. Os corantes sintéticos são de particular interesse, graças à sua alta tunability e da ampla gama de analitos mensuráveis. No entanto, estas moléculas sofrem várias limitações relacionadas com a pequena molécula de comportamento (baixa solubilidade, as dificuldades de segmentação, muitas vezes não há imagem raciométrica permitido). Neste trabalho, introduzir o desenvolvimento de sensores baseados em dendrímero e apresentar um processo para a medição do pH in vitro, em células vivas e in vivo. Nós escolhemos dendrímeros como plataforma ideal para os nossos sensores para suas muitas propriedades desejáveis ​​(monodispersity, propriedades ajustáveis, multivalência) que lhes um andaime amplamente utilizado por vários dispositivos biomédicos feitas. A conjugação de pH fluorescenteindicadores para o cadafalso dendrimer levou a um aprimoramento de suas performances de detecção. Em particular dendrímeros exposição reduzido vazamento celular, melhor direcionamento intracelular e permitir medições raciométrica. Estes novos sensores foram utilizados com sucesso para medir o pH em células HeLa vivo e in vivo em cérebro de ratinho.

Introdução

O uso de moléculas fluorescentes para identificar moléculas biologicamente relevantes específicos mudou completamente a nossa forma de estudar sistemas biológicos. Widefield e microscopia confocal permitiu uma visualização em tempo real de alta resolução de processos biológicos e hoje estão entre as técnicas mais populares para estudar eventos biológicos in vitro, em células e in vivo. ¹ Uma melhora significativa foi representado pelo desenvolvimento de indicadores de fluorescência , ou seja, corantes cuja fluorescência é dependente da concentração de uma entidade molecular específico. indicadores de pH e cálcio, em particular, teve um impacto dramático sobre o estudo da fisiologia da célula devido à enorme relevância de ^{2 +} íons H ⁺ em biologia e Ca. ^2,3

Entretanto, a maioria dos corantes sensíveis apresentam várias limitações intrínsecas relacionadas com a sua pequena molécula comportamento, tais como: i) dificuldades em targeti subcelularng; ii) pouca solubilidade em água e, consequentemente, pobre biocompatibilidade;. e iii) o vazamento de células e, assim, falta de capacidade de imagem de lapso de tempo longo ⁴ Por outro lado, o sinal de muitas sondas não pode ser corrigido para a dependência da concentração de corante (não- imagiologia raciométrica) e, por conseguinte, uma medição absoluta nas células ou in vivo, não é possível.

Recentemente, descreveu um método simples e eficaz para ultrapassar estas limitações, com base na conjugação de corantes de detecção sobre um andaime de dendrímero. ^Cinco dendrímeros são polímeros hiper monodispersas com propriedades muito atraentes para aplicações biológicas. ⁶ Em particular, várias arquitecturas dendríticas têm sido desenvolvidos e utilizados para a droga ⁷ e entrega do gene. ⁸ Só muito recentemente vários grupos começaram a explorar o potencial dessas moléculas como suporte para dispositivos de detecção. ^9,10,11

Anteriormentedescrita uma via de síntese simples para a funcionalização de poliamidoamina (PAMAM) diferentes suportes com base em ésteres de NHS-activada. Conjugados ¹² pode ser obtido num único passo, por meio de diálise como a purificação. Curiosamente, este método pode ser facilmente aplicado a uma variedade de suportes poliméricos ou dendríticas. ^13,14

Para alcançar os dendrímeros de imagem raciométrica foram duplamente marcado com dois conjuntos de corantes: i) um indicador de pH (ou seja, a fluoresceína) e ii) uma porção fluorescente independente do pH (ou seja, a rodamina). Isto permitiu-nos realizar imagem pH preciso como o rácio entre a fluoresceína e rodamina é só dependente do pH e não mais sobre a concentração da sonda. Outra abordagem interessante para esta questão é representado pelo uso de sondas à base de toda a vida ^15. À medida que a vida não depende de concentração da sonda essas medidas não precisam de uma correção radiométrica. No entanto, lifmedições Etime requerem uma configuração instrumental mais complicado e sua resolução temporal é sub-ótima para processos fisiológicos rápidos, o que limita as suas aplicações potenciais.

A fim de executar imagiologia intracelular, a sonda tem de ser entregue através da membrana plasmática para o citoplasma. Como os dendrímeros não são membrana permeável devido ao seu tamanho e hidrofilicidade, a entrega intracelular pode ser conseguida por meio de electroporação. Por meio desta técnica, amplamente utilizados em biologia, para a transfecção, as macromoléculas marcadas podem ser eficazmente entregues nas células para realizar imagem de alta qualidade. Além disso, com a electroporação as complicações relacionadas com a dendrímero endocitose pode ser evitado que as macromoléculas são entregues directamente para o citoplasma. Curiosamente após eletroporação diferentes dendrímeros mostra localizações distintas no interior das células, mesmo em ausência de qualquer seqüência de alvos específicos. ⁵ Este passive direccionamento, apenas devido às propriedades físico-químicas do dendrímero, pode ser explorado para atingir o pH de imagem específicos de organelos.

Imagiologia Raciometrico pode ser realizado utilizando microscopia confocal. A fluoresceína e rodamina, covalentemente conjugado com o andaime dendrítica, foram separadamente trabalhada e um pixel-a-pixel proporção mapa foi criado. Vários procedimentos para controlar o pH intracelular em células vivas por meio de ionóforos foram relatados. Os ionóforos são pequenas moléculas hidrófobas capazes de transportar iões através da membrana plasmática; ionóforos de iões H ^+, tais como nigericina, estão disponíveis e podem ser utilizadas para calibrar os sensores baseados em dendrímero ¹⁶ Estas medições revelaram uma resposta linear ao pH de forma semelhante ao que foi descrito. in vitro. Na base do pH intracelular de calibração pode ser medido com precisão. Estas medições demonstraram que o sensor baseado em dendrímero pode ser uma ferramenta valiosa no estudo H ⁺ homeostasis em células vivas e processos patológicos que envolvem falhas de regulação de pH.

Recentemente, demonstrou que os sensores de pH à base de dendrímero também pode ser aplicada, in vivo, a realização de imagens de pH no cérebro de ratos anestesiados. ¹⁷ Devido ao ambiente complexo de tecidos vivos de elevada qualidade na detecção in vivo é tecnicamente exigente. Aqui nós mostramos uma descrição detalhada do procedimento experimental para a imagem in vivo pH com ênfase das questões cruciais a serem abordados para realizar uma imagem pH precisas no cérebro. Microscopia de dois fótons tem sido empregada por duas razões principais: i) o uso de luz infravermelha permite superar a falta de penetração nos tecidos da microscopia confocal padrão; ii) a ampla absorção de dois fótons de fluoresceína e rodamina permitir a sua excitação simultânea evitando a complicações relacionadas com o uso de dois comprimentos de onda para excitação. medições de pH no cérebro de camundongos foramrealizado com sucesso; sensores prontamente responder à hipóxia induzir mudança de pH no espaço extracelular cerebral. Estas medições demonstram que os indicadores baseados dendrímero pode ser utilizado com êxito para destacar as alterações fisiológicas e patológicas do pH in vivo num modelo animal.

Protocolo

1. Síntese dos Sensores

1. Na seção seguinte, nós fornecemos um procedimento para a conjugação de indicadores de pH de dendrímeros PAMAM. O mesmo protocolo pode ser aplicado com modificações mínimas para dendrímeros de amina alternativas de rolamento. ^5,17,13,14 dendrímeros e corantes comercialmente disponíveis pode ser usada sem mais purificações.
2. Dissolve-se o dendrímero, em DMSO anidro (50 uM de concentração final). Prepare as soluções de 10 mM de fluoresceína-NHS e tetrametil-rodamina-NHS (TMR) em DMSO anidro.
3. Adicionar à solução de dendrímero a quantidade desejada de fluoresceína e TMR. A relação molar na mistura irá reflectir a quantidade de corantes carregados no dendrímero. Tipicamente, 1 mL de solução de dendrímero PAMAM G4 num tubo de microcentrífuga é feito reagir com 8 eq (40 ul) de fluoresceína e 8 eq (40 ul) de TMR. Agita-se a solução à temperatura ambiente durante 12 horas.
4. Dilui-se a 1:10 com água desionizada e carregar a reacçãomistura em um saco de diálise (MWCO = 10 kDa). Dializar durante 24 horas contra água desionizada substituindo frequentemente a água no reservatório.
5. Transferir a solução para um frasco e seca por congelação durante 24 horas. Um pó de cor purpúrea deve ser obtida. Peso do sólido obtido e dissolvê-lo em água MilliQ a uma concentração final de 10 uM. Alíquota da solução e armazenar a -20 ° C.

2. In Vitro medições de pH

1. Para in vitro calibração preparar uma solução 500 nM de dendrímero em PBS (fosfato de 2 mM) numa cuvete de quartzo. Recomenda-se o uso de um tampão PBS muito diluídas (2 mM), para evitar alterações bruscas de pH durante a titulação.
2. Medir o espectro de emissão da fluoresceína (488 nm, exc) e TMR (iva de 550 nm) e optimizar as configurações ópticas do fluorímetro para conseguir uma boa relação de sinal-para-ruído.
3. Realizar uma titulação de pH pela adição de pequenas quantidades de NaOH 0,1 N e HCl 0,1 N. Após cada adição agitar a cubapara misturar, esperar um minuto para o equilíbrio e medir o pH, por meio de um microeléctrodo de pH. Espectros de emissão de fluoresceína e TMR devem ser registradas para cada etapa, sem qualquer alteração nas configurações ópticas.
4. Traça-se a intensidade de fluorescência vs pH para a titulação. O sinal de rodamina não deve ser afectada pelo pH (<10%). O sinal de fluoresceína deve ser uma curva sigmoidal e deve ser equipado com um modelo de ligação único com pK = 6,4.

3. Cultura Celular e Eletroporação

1. Cultivar as células HeLa em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 100 U / ml de penicilina, e 100 mg / mL de estreptomicina (Invitrogen). Manter a cultura das células a 37 ° C em atmosfera húmida 5% de _CO2.
2. Para dendrimer eletroporação, quando as células são confluentes, remova a mídia e lavar as células usando DPBS (fosfato de Dulbecco-Buffered Saline). Remover o DPBS e adicionar tripsina-EDTA. Neutralizar o Tryppecar pela adição de meio contendo soro, mas não antibióticos. Centrifugar a 900-1,200 rpm durante 2 minutos à temperatura ambiente. Remova a mídia e lavar as bolinhas usando DPBS.
3. Contar as células e levar 4 * 10 ⁶ células. Centrifugar a 1.200-1.500 rpm durante 2 minutos à temperatura ambiente.
4. Ressuspender o sedimento celular em 200 ul de tampão de formação de microporos (fornecido pelo fabricante de microporos) e transferência de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
5. Adicionar solução aquosa de dendrímero em células ressuspensas. A quantidade de dendrímero é necessária por exemplo dependente do tipo de PAMAM (tipicamente de 250 nM para o catiónico e 2 uM de dendrímeros neutros).
6. Adicionar tampão de electroporação (fornecido pelo fabricante de microporos) em um tubo de formação de microporos. Pipeta as células e os dendrímeros misturas com ponta eletroporação de volume de 100 mL de tamanho. Inserir a pipeta de microporos na estação pipeta. Defina a condição de pulso para formação de microporos: Tensão de pulso = 1.005 V; wid pulsoº = 35 ms; número pulso = 2.
7. Após as células de transferência de impulsos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de centrífuga e as células durante 5 min a 1200 rpm para remover o excesso de dendrímero no meio. Placa 10 ml de células eletroporados Onto 35 milímetros pratos com fundo de vidro (Willco-prato GWSt-3522) com meio fresco w / o antibióticos.

4. Sensing pH em Viver Células HeLa

1. Células de imagem com um microscópio confocal 12 horas após a eletroporação.
2. Conjunto de filtros padrão para fluoresceína e rodamina podem ser usados. Se os filtros são ajustáveis ​​conjunto disponível um canal verde 500-550 nm e um canal vermelho de 580 nm a 650 nm. Excitação a 488 nm é óptimo para a fluoresceína, enquanto rodamina pode ser trabalhada, quer com a 543nm ou a linha de laser 561.
3. Concentre-se na amostra e ajustar lasers e detectores de poder ganhar a maximizar a relação sinal-ruído. Se a electroporação foi células bem sucedidos devem ser fluorescentes brilhantes em ambos os canais. Olocalização depende do tamanho e da carga do dendrímero utilizado. Muitas vezes, algumas localizações lisossômico (pequenas vesículas perinuclear) está presente devido a endocitose ou compartimentalização. Se a localização lisossomal é predominante, isto é, a maior parte da fluorescência está localizada dentro de vesículas e sinal fraco é observado no citossol, isto significa toxicidade e medição deve ser descartado. Adquirir sequencialmente os dois canais, se necessário adquirir vários imagens e calcular a média das imagens para melhorar a qualidade da imagem.
4. Para braçadeira de calibração de pH celular utilizando tampões com ionóforos a pH diferente e adquirir pelo menos 20 células por pH tal como descrito acima. Para uma descrição detalhada do procedimento e da composição dos buffers consulte Bizzarri e colegas de trabalho ^16. Sugerimos para medir pelo menos 5 pontos de pH = 5,5 a pH = 7,5. pH inferior a 6 são tóxicos para as células, mas tolerada para curto espaço de tempo, sugerimos a aquisição das imagens o mais rápido possível. Se as célulasdemonstrar sinais de apoptose, descartar as pilhas e reinicie.
5. Use ImageJ ou software similar para análise de dados. Importe as imagens do canal verde e vermelho, subtrair fundo e criar um pixel por pixel proporção de imagens com a ferramenta "calculadora de Imagem".
6. Desenhe uma região de interesse (ROI) selecionar a célula desejada e medir a taxa de verde a vermelho-intracelular. Analisar todas as imagens adquiridas e, em seguida, traçar a proporção em relação ao pH. Na gama de 5,5-7,5 a tendência deve ser linear. O ajuste linear dos pontos obtidos dará a curva de calibração, que serão utilizados para converter proporção verde para vermelho para pH.
7. Quanto mais controle adquirir várias células não tratadas (não ionóforos) e tentar calcular o pH com a curva de calibração obtida. Um valor entre 7.2 e 7.4 devem ser obtido.

5. In Vivo Preparação da Amostra

1. Os experimentos foram realizados em C57Bl/6J (machos e fêmeas), entre pós-natal day 28 e 70. Anestesiados o rato com uma injecção intraperitoneal de uretano (isto é, acetato de carbamato) (20% w / v em solução salina fisiológica, 20 mg / kg de uretano). Os animais foram sacrificados após a experiência com uma dose excessiva de uretano seguido por uma injecção intracardíaca do mesmo anestésico.
2. Realizar uma injecção intramuscular de fosfato sódico de dexametasona (2 mg / kg de peso corporal) para reduzir a resposta de stress cortical e edema cerebral durante a cirurgia.
3. Raspar a cabeça do animal e aplicar gel de lidocaína 2,5% para o couro cabeludo.
4. Use a tesoura para cortar o retalho de pele cobrindo o crânio de ambos os hemisférios
5. Lave o osso exposto com soro fisiológico e retire cuidadosamente o periósteo com a pinça. Isto irá fornecer uma base melhor para cola e cimento dental para aderir com.
6. Aplique uma cabeça poste de aço feitos sob medida com uma câmara de imagem central e cola-lo com cianoacrilato em um plano aproximadamente paralelo com o crânio sobre a região cortical de interest e corrigi-lo no lugar com cimento dental branco (Paladur).
7. Fixe a cabeça do mouse, a fim de realizar uma craniotomia de 2-3 mm de diâmetro perfurado sobre a região de interesse.
8. Tente minimizar o aquecimento do córtex durante a cirurgia, as lágrimas da dura-máter, ou sangramento.
9. Manter o córtex superfundidas com ACSF estéril (NaCl 126 mM, KCl a 3 mM, 1,2 mM, KH ₂ PO _4, 1,3 mM _MgSO4, 26 mM de NaHCO _3, 2,4 mM de _CaCl2, 15 mM de glicose, HEPES 1,2 mM em _H2O destilada , pH = 7,4).

6. imaging pH no cérebro do rato

1. Durante o experimento ajuda animais respiração fornecendo O ar _{2-enriquecido.} O oxigénio é enriquecido até 80%. O ₂ pressão parcial eo fluxo é frequentemente ajustado para obter uma ajuda de respiração adequada. Manter constante a temperatura do corpo a 37 ° C com um cobertor de aquecimento controlado de feedback.
2. Corrigir o animal através do poste de aço no âmbito do objectivo de um dois-fotoconfiguração de n imagens.
3. A fim de injectar o sensor no córtex cerebral carregar uma pipeta de vidro contendo um AgCl (ponta de 4 mm de diâmetro) com a solução de dendrímero (1 uM). O eléctrodo permitirá a gravar os potenciais de campo extracelulares.
4. Com uma configuração de microinjecção inserir a pipeta no córtex de aproximadamente 150 microns de dimensão. Injectar de 1-2 min a uma pressão de 0,5 psi.
5. Otimizar a configuração óptica para imagens. Poder do laser deve ser ajustado para minimizar a fotodegradação e fotoenvelhecimento. Normalmente potência do laser empregado é de cerca de 20 mW e ganho PMT foi mantida constante em 667 V desde calibrações anteriores mostraram que esta tensão dá a melhor relação S / N.
6. Para excitar o sensor de imagem a 820 nm e detectar simultaneamente a fluoresceína e rodamina fluorescência através de filtros FITC e TRITC normais.
7. Para o tempo de medições resolvidos adquirir séries lapso de tempo entre 2 Hz.
8. Para a correção de fundo adquirir um quadro escuro com a laser obturador fechado para medir o ruído térmico média resultante nas PMT eo pedestal geralmente adicionados pela eletrônica.
9. Para análise dos dados seguem o mesmo procedimento relatado na seção 4.

Resultados

A Figura 1 mostra uma representação esquemática da conjugação de corantes para detectar diferentes andaimes dendríticas. Os indicadores resultantes podem ser obtidos num passo sintético fácil a partir de produtos disponíveis comercialmente. Os dendrímeros de rolamento-amina reagem com corantes NHS-activada em DMSO e purificada por meio de diálise. Este procedimento geral já foi usado com sucesso para a rotulagem de vários dendrímeros: i) geração dendrímero PAMAM 2, 4 e 6; ¹² ...

Discussão

Os passos críticos para imagiologia de pH bem sucedido com sensores à base de dendrímero são: i) a selecção do andaime dendrítica correcta e o número de indicadores conjugados com ele e ii) a optimização de um protocolo de entrega do sensor nas células ou in vivo.

O procedimento de síntese é relativamente fácil e pode ser aplicado virtualmente a qualquer polímero hiper-rolamento amina. Os sensores podem ser obtidos a partir de dendrímeros disponíveis comercialmente ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500