Alimentação dos Carrapatos em Animais de Transmissão e Xenodiagnóstico em Lyme Disease Research

Resumo

A doença de Lyme é a doença mais comumente relatados transmitidas por vetores na América do Norte. O agente causador, a Borrelia burgdorferi é uma bactéria espiroqueta transmitida por carrapatos ixodídeos. A transmissão e a detecção de infecção em modelos animais é optimizada pela utilização de alimentação de carraça, que aqui descrita.

Resumo

A transmissão do agente etiológico da doença de Lyme, Borrelia burgdorferi, ocorre pelo apego e alimentarem de sangue de espécies Ixodes carrapatos em hospedeiros mamíferos. Na natureza, este patógeno bacteriano zoonótica pode usar uma variedade de hospedeiros, mas o rato branco de pés (Peromyscus leucopus) é o reservatório primário para carrapatos larva e ninfa na América do Norte. Os seres humanos são hospedeiros acidentais mais frequentemente infectados com B. burgdorferi pela picada de carrapatos na fase de ninfa. B. burgdorferi se adapta a seus hospedeiros ao longo do ciclo enzoótica, portanto a capacidade de explorar as funções destes espiroquetas e seus efeitos em hospedeiros mamíferos requer o uso de alimentação do carrapato. Além disso, a técnica de xenodiagnóstico (utilizando o vector natural para a detecção e a recuperação de um agente infeccioso) tem sido útil em estudos de infecção críptica. Para a obtenção de ninfas carrapatos que porto B. burgdorferi,carrapatos são alimentados espiroquetas vivas em cultura por meio de tubos capilares. Dois modelos animais, ratos e primatas não-humanos, são mais comumente usados ​​para estudos de doença de Lyme que envolvem a alimentação do carrapato. Demonstramos os métodos pelos quais esses carrapatos podem ser alimentados em cima, e recuperados a partir de animais para ou infecção ou xenodiagnóstico.

Introdução

Em 2011, a doença de Lyme foi a doença mais comum Nacionalmente Notificável 6 na América do Norte ( http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi é um micróbio versátil, tanto geneticamente e antigenicamente (revisto em ^1). Sua constituição genética inclui um grande (> 900 kB) cromossomo e até 21 plasmídeos (12 lineares, 9 circulares), com conteúdo plasmídeo variando entre os isolados. Muito está a ser aprendido sobre este espiroquetas, como mais de 90% dos plasmídeos de leitura aberta quadros são alheios a quaisquer conhecidas seqüências bacterianas ^2,3. B. burgdorferi apresenta uma grande variedade de antigénios, como alvos potenciais de imunidade do hospedeiro. No entanto, a infecção não tratada muitas vezes persistir. A interação de espiroquetas com o meio ambiente e carrapato hospedeiro vertebrado exige uma adaptação por B. burgdorferi em todo o processo de infecção. Vários plasmídeo codificadogenes são conhecidos por serem expressos diferencialmente em resposta a mudanças de temperatura, pH, densidade celular e mesmo estágio do ciclo de vida do carrapato ^4-8.

O estudo da B. burgdorferi adaptação durante todo o seu ciclo de enzoótica, e as respostas do hospedeiro após a infecção por via natural, baseia-se na capacidade de alimentar carrapatos em modelos animais apropriados. Tais estudos estão satisfeitos com os desafios técnicos de geração de carrapatos que abrigam B. burgdorferi, e garantir a transmissão eficiente e / ou alimentação de carrapatos no host modelo. Além disso, a retenção e a recuperação de carraças infectadas é essencial. Entre os modelos utilizados são ratos e primatas não-humanos, cada um dos quais serve como uma ferramenta valiosa para a pesquisa da doença de Lyme. Tal como acontece com o rato branco de pés, o que é um hospedeiro natural para B. burgdorferi, o rato de laboratório é uma série altamente suscetíveis que suporta a infecção persistente por B. burgdorferi ^9. Folguinte a infecção de ratinhos susceptíveis a doenças, tais como a estirpe C3H, os espiroquetas difundir para vários tecidos, incluindo a pele, bexiga, músculos, articulações e coração. As respostas inflamatórias à infecção levar a coração doente e articulações. Enquanto as espiroquetas persistir nesse hospedeiro e permanecem infecciosos, lesões inflamatórias, pode tornar-se intermitente, ao contrário do processo em seres humanos. O modelo do rato tem, assim, fornecido muita informação sobre B. patologia induzida por burgdorferi, incluindo artrite e cardite e resposta imune do hospedeiro ^10-12. Do ponto de vista do agente patogénico, certos genes diferencialmente expressos durante a infecção de mamíferos têm sido caracterizados, como ter algum necessário para a transmissão a partir do vector carrapato ^13-21.

Apesar de várias espécies animais têm sido utilizados para estudar a doença de Lyme ²² macacos rhesus imitar mais de perto o caráter multi-órgão da doença humana ^23. Ao contrário de outrosmodelos animais, a amplitude das manifestações de doença, tais como eritema migrans, cardite, artrite e neuropatias dos sistemas nervosos periférico e central, observada em macacos. Em camundongos, o anfitrião reservatório para B. burgdorferi, a doença varia de acordo com a tensão do mouse e ²⁴ anos, enquanto que as manifestações precoces e tardias-divulgados são incomuns ^9. Além disso, outros roedores, lagomorfos, e caninos tudo não exibem doença neurológica de B. infecção burgdorferi ^25. É importante ressaltar que os macacos apresentam sinais que são característicos de todas as três fases da borreliose de Lyme, ou seja, no início localizada, early-divulgada, e fase final de doença de Lyme ^26-28. Eritema migrans (EM), pensa-se que ocorre em 70-80% dos casos humanos ^29, e é também observada em macacos rhesus ^28,30. Após a infecção, as espiroquetas difundir a partir do local de inoculação de vários órgãos. ADN Espiroquetal foi detectada em mu esqueléticoscles, coração, bexiga, sistema nervoso periférico e do plexo, bem como no sistema nervoso central (cérebro, tronco cerebral e cerebelo, espinal medula, e dura-máter) ^31.

Assinale alimentando-se de ratos tem sido utilizada por nós e por outros grupos de pesquisa para a propagação de colônias de carrapatos, em competência reservatório estuda ^32-36 e em estudos de B. burgdorferi patogênese ^37-40. Esta técnica também foi usada para xenodiagnóstico e testes de eficácia da vacina em ratinhos ^41-44. Temos alimentado Ixodes carrapatos em primatas não-humanos para o desenvolvimento de modelo de ²⁸ anos, um estudo sobre a eficácia da vacina ^{de 45 anos,} e por xenodiagnóstico na avaliação da persistência do tratamento pós-antibiótico ^46. Carrapatos que porto B. burgdorferi podem ser mantidos em um ciclo natural, por enzoótica alimentando larvas em ratinhos infectados e usando as ninfas de estudos, como as espiroquetas são transmitidos através das etapas da vida. Neste relatório, Instruímos sobre como gerar os carrapatos infectados com o tipo selvagem ou mutante B. burgdorferi, usando capilar tubo de alimentação. Isto também pode ser realizada por micro-injecção ⁴⁷ e por imersão ^48. A finalidade da introdução artificial de B. burgdorferi em carraças podem ser estudar estirpes mutantes cuja transmissibilidade é desconhecido, para gerar um grupo de carraças com uma alta taxa de infecção, e para reduzir a possibilidade de erros através da manutenção de uma colónia carrapato limpo e de outra forma não infectado. Além disso, demonstramos alimentação carrapato em ratos e primatas não-humanos, de modo a assegurar a contenção e recuperação de carrapatos repletos. O uso de alimentação carrapato é essencial para futuros estudos de respostas imunes a B. infecção burgdorferi, o potencial de eficácia da vacina Lyme, e xenodiagnóstico para detecção de infecções ocultas.

Protocolo

Um esboço experimental de inoculação carrapato e alimentação aos animais para a pesquisa da doença de Lyme é mostrada na Figura 1.

1. Inoculando ninfas Ixodes Carrapatos com B. burgdorferi Usando Tubo Capilar-feeding

Ao realizar manipulações com carrapatos, jaleco branco com mangas elásticas, luvas e bonés bouffant descartáveis ​​são usados.

1. A nossa técnica é uma versão modificada do que relatado por Broadwater et al. ^49. Prepare tubos capilares através do aquecimento e puxando pipetas Pasteur de quebrar magreza usando um extrator pipeta. Utilizando uma pinça e dissecando escopo, quebrar as dicas para o diâmetro ideal (cerca de 0,2 mm). Um tubo normalizado para o tamanho carrapato mouthpart é utilizado como um guia de dimensionamento. A viseira deve ser usado na preparação das pipetas.
2. Crescer B. burgdorferi para entre 2-8 x 10 ⁷ / ml (fase mid-log) em meio BSK-H (Sigma) conFORMAÇÃO 6% de soro de coelho.
3. Use carrapatos ninfa que foram armazenados a 23 ° C durante 4-6 semanas de muda pós-larval. Local carrapatos para um pequeno 60 x 15 mm placa de Petri com fita dupla-face na superfície inferior externa do prato. Coloque o ticks do lado ventral para cima.
4. Mergulhe a ponta do tubo capilar para a B. tubo de cultura burgdorferi após a mistura. Coloque o tubo capilar sobre o hypostome das partes da boca carrapato usando um escopo de dissecação. Use argila moldagem para fixar o tubo no lugar, como mostrado na Figura 2A.
5. Coloque as placas de Petri com carrapatos afixadas no interior uma grande banheira de plástico transparente para um nível adicional de contenção. Toalhas de papel molhadas são adicionados para fornecer umidade. Coloque as carraças em um incubador térmico de 37 ° C durante 30 min-2 h, até a defecação é aparente. Isso indica que a mídia que contém espiroquetas passou pelo carrapato.
6. Descanse os carrapatos para 2-4 semanas a 23 ° C para permitir a adaptação ao ambiente carrapato antes da alimentaçãolos em animais.

2. Infectar ratos com B. burgdorferi por Tick

1. Diluir estoque cetamina 1:10 em água estéril. Anestesiar cada rato com 100 mg / kg de cetamina por via intraperitoneal com uma seringa de tuberculina
2. Uma vez que o mouse é totalmente anestesiado, raspar o rato das orelhas para o meio de volta usando uma multa (Remington suavizar e sedoso) aparador elétrico.
3. Em uma panela branco com nenhum outro objeto próximo, transferir os carrapatos de ninfa (que porto B. burgdorferi) por um pincel umedecido para a área calva do mouse. Alternativamente, carraças infectadas pode ser colocado em ratinhos para xenodiagnóstico de ratinhos com infecção suspeito. A utilização de uma superfície limpa e branca para a colocação carrapato ajuda a assegurar que qualquer carrapatos acopladas será prontamente visto.
4. Posicione o mouse em encarceramento especializado (Allentown Jaula, Allentown, PA). O encarceramento é constituído por uma grelha de aço inoxidável de elevada desde o fundo da gaiola. Tele topo de gaiola foi modificado pela nossa in-house oficina mecânica para elevar o suporte da garrafa de água o suficiente para permitir a livre circulação do mouse por baixo. O pan é preenchido com cerca de ½ polegada de água para prender qualquer carrapatos que caem camundongos (Figura 3A). Para minimizar o risco de hipotermia, almofadas de aquecimento reutilizáveis, microondas antes do uso, são colocados debaixo das gaiolas até ratos acordar completamente da anestesia. Os animais são muitas vezes ataxic como eles se recuperar da anestesia e esfregar contra alimentos e bandejas de água, pelo que estes devem ser removidos. O nível da água está baixo o suficiente para impedir que os membros de ratos de submersão.
5. Coloque a gaiola dentro de uma bandeja que foi forrado com emaranhado armadilha colar (Contech, Victoria, BC, Canadá) e fita adesiva para garantir o aprisionamento de artrópodes. Os ratos são enjaulados individualmente e observados continuamente durante o período da anestesia.
6. Dentro de 2 horas, quando os ratos são completamente acordado da anestesia, a bandeja de comida e garrafa de água são substituídos para a jaula. Após 24 horas, o enriquecimento habitacional composto por uma cabana de plástico e Nylabone é substituído.
7. Depois de 3, 4 e 5 dias, verifique o rato, gaiola e água gaiola para carrapatos alimentados. A água gaiola é peneirado através de uma panela de metal branco (ou seja, "a extração de ouro"). Enxágüe alimentados carrapatos em água limpa e armazenar em frascos de plástico (Figura 3B). Nos dias 3 e 4, substituir a água na gaiola com água limpa. No dia 5, verificar não só a gaiola, mas o mouse completamente para carrapatos. Normalmente, neste ponto todos os carrapatos foram alimentados e os ratinhos podem ser devolvidos ao encarceramento regular.
8. Coloque todos os resíduos das gaiolas do rato, incluindo líquidos, em recipientes de Biohazard por autoclavagem e disposição. Manter um registo do número de carraças e colocadas em ratinhos aqueles recuperados em todos os momentos.

3. Alimentando Carrapatos em Primatas não humanos para infecção por B. burgdorferi ou xenodiagnóstico

1. Prepare o dispositivo de contenção carrapato: Corte um círculo de diâmetro de 1 ¾ polegadas no 3 polegadas x3 polegadas LeFlap (aba) utilizando um bisturi limpa e o guia de medição. Use o recorte como um modelo para cortar círculos de tamanho idêntico na espuma Biatane e Duoderm. A espuma é utilizado para elevar a aba sobre a superfície da pele e prevenir a possível esmagamento do carrapato. O Duoderm adiciona outra camada de amortecimento e cobre as bordas do dispositivo de contenção para aumentar a segurança da carraça fuga. Um diagrama do dispositivo de contenção está representado na Figura 4.
2. Pessoal veterinário vai anestesiar o animal com 5-8 mg / kg Telazol por injecção intramuscular.
3. Corte o pêlo do animal com aparador elétrico (Oster), equipado com tamanho de 40 lâminas. Todas as áreas que serão cobertas pelo paletó são cortados: costas, frente, braços. Usando o creme de barbear e lâminas de barbear descartáveis ​​de dupla lâmina, fazer a barba de perto uma área de aproximadamente 25 centímetros verticais x 20 cm horizontal. Limpe com papel toalha úmido e seque com fogo baixo para secar a pele.
4. Coloque a aba na tele animais do dorso, logo abaixo da escápula, em ambos os lados da coluna vertebral. Use um marcador para traçar o círculo em que local. Prepare a área da pele ao redor do círculo, limpando-a com SkinPrep. Isso remove óleo em pele que podem afetar a adesão de dispositivos de cola e de contenção. Deixando sobre uma circunferência de 1 cm de espaço ao redor do círculo, aplique uma camada de cola de pele (SkinBond) com uma largura de a 4 cm.
5. Retire o adesivo da espuma Biatane e apor na pele no local apropriado. Os animais são novamente anestesiados pela equipe veterinária com 5 mg / kg Telazol. Selar as bordas com cola a pele e fita Hypafix. Retire o adesivo da tampa e fixe no topo da Biatane. Colocar fita Hypafix em torno das bordas do LeFlap, em seguida, para baixo a aba de fita de malha de a aba e colocar o revestimento sobre o animal. Tape e emaranhado Armadilha pasta é aplicada para o chão em um perímetro em torno do encarceramento primata não-humano para maior segurança.
6. Para minimizar os efeitos da chemicalals utilizados no Passo 3.4 sobre alimentação carrapato, os carrapatos são adicionados 24 horas após o dispositivo de contenção está no lugar. Neste ponto, a segurança do dispositivo é também inspeccionados e reforçado, se necessário. Tipicamente, 20 ninfas não alimentadas (molt 4-8 semanas pós-larvar) são adicionados para a pele dentro do dispositivo utilizando um pincel.
7. Retire o adesivo da malha do retalho e selá-lo no lugar. Por último, remover o suporte Duoderm para expor adesivo, e colocar na parte superior do dispositivo de contenção. Adicionar um pedaço de fita Hypafix através do círculo de malha aberta, e substitua o casaco. O dispositivo de contenção completo é mostrado na Figura 5A.
8. Após 5 dias, anestesiar os animais como descrito acima e os revestimentos são retirados. Retire a fita primeiro a inspecionar alimentação carrapato através da malha (Figura 5B). Retire cuidadosamente o Duoderm longe da aba.
9. Puxe a parte de malha nas bordas para fornecer acesso aos carrapatos. Carrapatos Fed são frequentemente encontrados perto ou sobo circulo de espuma (Figura 5C) e são removidos e colocados em água limpa com um pincel. Remova o dispositivo de uma vez todos os carrapatos alimentados visíveis são coletados (Figura 5D).

Nota: Muitas vezes, o dispositivo de contenção pode simplesmente ser retirado da pele. Se a aderência for forte e pode causar danos à pele, o solvente Unisolve é aplicado à superfície para remoção suave. A pele é limpa com isopropanol e carrapatos são armazenadas a 23 ° C. Se usado para a infecção, os carrapatos podem ser esmagadas para confirmar o número que continha B. burgdorferi. Se for usado para xenodiagnóstico, os carrapatos são mantidos por 1-3 semanas antes da análise do conteúdo do intestino médio.

Resultados

Após a conclusão da alimentação capilar, as carraças são normalmente repousou a 23 ° C durante 2-3 semanas, antes de serem alimentados com animais para a transmissão. Usando a técnica capilar-alimentação, descobrimos que mais de 90% de que o Fed carrapatos porto B. burgdorferi. A percentagem de carrapatos positivas é determinada por lavagem carrapatos em peróxido e de etanol, em seguida, esmagando-as em PBS estéril com um pilão em forma de tubo de microcentrífuga. O conteúdo do intestino médio...

Discussão

A fim de obter as carraças que porto B. burgdorferi para estudos a jusante, os carrapatos podem ser: (1) alimentados em camundongos infectados na fase de larva, (2) imersa em B. culturas burgdorferi, quer no estágio larval ou ninfal ^48; (3) microinjeção com B. burgdorferi ^47, ou (4) do tubo capilar alimentados B. burgdorferi ^49. Enquanto cada um destes métodos tem a sua finalidade, para garantir que uma grande parte dos carrapatos a ser u...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
BSK-H	Sigma	B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste	Ladd research	T-131
SkinPrep	Allegro Medical Supplies	177364
LeFlap, 3" x 3"	Monarch Labs
Hypafix tape	Allegro Medical Supplies	191523
SkinBond	Allegro Medical Supplies	554536
UniSolve	Allegro Medical Supplies	176640
Biatane Foam, adhesive 4"x4"	Coloplast	3420
DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border	Convatec	187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom	Lomir Biomedical Inc.
EQUIPMENT
Pipet puller	David Kopf Instruments	Model 700C
Dark field microscope	Leitz Wetzlar	Dialux
Dissecting microscope	Leica	Zoom 2000
Mouse caging	Allentown caging