Um Método para o cultivo embrionário<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

Resumo

Descrevemos aqui um protocolo revisto para a cultura em grande escala de embrionário C. elegans células. Embryonic C. elegans células cultivadas in vitro utilizando este método, parece diferenciar e recapitular a expressão de genes de uma forma específica de célula. As técnicas que necessitem de acesso directo para as células ou o isolamento de tipos específicos de células a partir de outros tecidos podem ser aplicadas em C. elegans células cultivadas.

Resumo

C. elegans é um poderoso sistema de modelo, em que as técnicas genéticas e moleculares são facilmente aplicáveis. Até há pouco tempo, porém, as técnicas que requerem o acesso directo às células e o isolamento de tipos de células específicos, não pôde ser aplicada em C. elegans. Esta limitação foi devido ao facto de que os tecidos estão confinados dentro de uma cutícula pressurizado que não é facilmente digerida por tratamento com enzimas e / ou detergentes. Baseado no trabalho pioneiro por Laird Bloom, Christensen e seus colegas desenvolveram ^um método robusto para a cultura C. elegans células embrionárias em larga escala. Os ovos são isolados a partir de adultos grávidas por tratamento com lixívia / NaOH e subsequentemente tratado com quitinase para remover as cascas. As células embrionárias são, em seguida, dissociados por pipetagem manual e plaqueadas sobre substrato de vidro coberto, em meio enriquecido com soro. Dentro de 24 horas de celas de isolamento começam a diferenciar alterando a morfologia e expressando marke específico de célulars. C. elegans células cultivadas usando este método para sobreviver até duas semanas in vitro, e foram utilizados para electrofisiológico, imunoquímicos e de imagem, bem como as análises terem sido escolhidas e utilizadas para microsséries de perfilamento.

Introdução

Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um poderoso organismo modelo para investigar as bases moleculares da função celular, diferenciação e comportamento. Embora o seu genoma, metabólica e vias biossintéticas são semelhantes aos vertebrados ', a sua tratabilidade genética e molecular são muito maiores ^2. Entre as suas vantagens são o seu tamanho e a anatomia simples, o seu ciclo de vida rápida (3 dias a 25 ° C), tempo de vida curto (2 semanas) e um grande número de descendentes (> 200). Devido à sua natureza hermafrodita e ciclo de vida curto, manipulações moleculares e genéticos são simples em C. elegans, incluindo a geração de animais transgênicos ^3,4 ea aplicação de técnicas genéticas knock-down, como interferência de RNA ^5. C. elegans corpo e casca de ovo são transparentes. Portanto, as células podem ser facilmente visualizadas tanto no adulto e o embrião usando microscopia padrão. Nos últimos 40 anos, a C. elegans comunidade criou recursos inestimáveis ​​para C. pesquisa elegans incluindo uma grande coleção de mutantes, nocautes e transgênicos, uma descrição detalhada da anatomia e desenvolvimento ^6,7, incluindo a reconstrução completa do sistema nervoso ^8, e um genoma completamente seqüenciado, que é bem anotado e disponível para toda a comunidade ( www.wormbase.com ).

Apesar das inúmeras vantagens, algumas abordagens experimentais têm sido um desafio em C. elegans. Estes incluem os que exigem a acessibilidade à membrana plasmática das células e isolamento de tecidos ou tipos celulares. Na verdade C. tecidos elegans estão confinados dentro do seu esqueleto hidrostática pressurizado, o qual não é facilmente digerida por tratamento enzimático ou detergentes. No final da década de 1990 Miriam Goodman e Janet Richmond pioneira métodos para registros eletrofisiológicos de C. elegansneurônios e células musculares em situ ^9,10. Embora estes métodos nos deu importantes insights sobre neuronal e na função muscular in vivo, eles são um desafio e baixo rendimento. Métodos alternativos para estudar a função das células in vivo foram desenvolvidos, principalmente nomeadamente imagiologia cálcio vivo utilizando sensores de cálcio geneticamente codificado como GCamP e cameleon ^11-13. Estes métodos, porém, não permite a utilização de ferramentas farmacológicas, porque eles são aplicados em animais vivos intactos.

A primeira tentativa de cultivo C. elegans células in vitro em larga escala foi feita por Laird Bloom durante a preparação da sua tese de doutoramento ^14. Infelizmente, as dificuldades encontradas com fraca adesão das células ao substrato, diferenciação celular pobres e sobrevivência impediu o estabelecimento deste protocolo no início como um método de cultura celular robusto. Em 1995, Edgar e colegas publicaram um procedimentopara investigar a divisão celular e morfogénese de isolamento e cultura de uma única C. elegans embriões ^15. As células embrionárias obtidos por digestão das cascas de ovo com uma combinação de tratamento enzimático e dissociação manual, continuou a proliferar, produzindo-se ~ 500 células para ^15. Posteriormente, Leung e colegas cultivaram um pequeno número de blastômeros para estudar a morfogênese intestinal. Eles mostraram que um em vitro isolado E blastômeros produziu células intestinais polarizadas que criaram uma estrutura análoga à do lúmen intestinal, interagindo uns com os outros através de aderentes apicais junções ^16. Buechner e seus colegas também relataram um método semelhante para cultura C. elegans células embrionárias in vitro ^17.

Com base neste trabalho precoce, Christensen e seus colegas desenvolveram um protocolo robusto para a cultura C embrionário. elegans células in vitro ^1. Elesmostrou que isolado C. elegans células podem diferenciar-se em vários tipos de células e manter as características que possuem in vivo, incluindo a expressão de marcadores específicos de células. Várias técnicas que são um desafio in vivo, pode ser aplicado em isolado C. elegans células embrionárias. Estes incluem electrofisiológico ^{1,18 19,} de imagem e de técnicas imunoquímicas ^20,21, bem como o isolamento de tipos de células específicas de célula fluorescente-Activated (FACS) para a construção de células específicas de bibliotecas de cDNA ^22,23. Gene knockdown técnicas, tais como interferência de RNA (RNAi) pode ser aplicado em cultura C. elegans células ¹ e um método de marcação metabólica novo usando azido-açúcar como uma ferramenta para a descoberta de glicoproteína, foi recentemente desenvolvido para cultivados in vitro C. elegans células ^24.

Em conclusão, o método de cultura de células se expande a matriz of técnicas que podem ser aplicadas para a C. modelo elegans num esforço para decifrar a função do gene no contexto de um organismo vivo. Descrevemos aqui o protocolo para o cultivo C. elegans células embrionárias in vitro, que é em grande parte baseado no protocolo descrito primeiramente por Christiansen e colegas ^1.

Protocolo

Os asteriscos (*) indicam passos novos ou modificados, quando comparados com Christensen et al. ¹

1. Configuração de materiais

1. O procedimento de cultura celular requer grandes quantidades de ovos isolados de adultos grávidas. Crescer C. elegans em 8P placas de agar semeadas com NA22 (disponível através da C. elegans genética Consórcio - CGC) bactérias para isolar grandes quantidades de ovos. Nestas placas de a quantidade de peptona utilizado é de 8 vezes a quantidade que é normalmente utilizada para placas NGM. A concentração mais elevada de peptona sustenta o crescimento das bactérias NA22 mais eficiente, o que ao contrário do OP50-, crescem em camadas espessas.

8P placas receita:

Dissolve-se 3 g de NaCl, 20 g de Bacto-peptona, 25 g de agar em 1 litro de água destilada estéril e autoclavagem durante 30 minutos. Deixe o meio fresco a 55 ° C e, em seguida, adicionar estéril-filtrada 1 ml de colesterol (5 mg / ml em EtOH), 1 ml de uma _MgCl2, 1 mL de _MgSO4 e 25 ml de tampão de KP (estoque de 500 ml 5 g de K ₂ HPO _4, 30 g _de KH ₂ PO _4, pH 6,00). Despeje meio de agar líquido em placas de Petri de 10 centímetros (25 ml / placa).

2. No dia seguinte espalhar toda a superfície de cada placa de agar de peptona enriquecida com 1 ml de NA22 E. coli cultivadas durante a noite em meio 2 x YT (16 g de triptona, 10 g de extracto de levedura, 5 g de NaCl em 1 litro de água estéril, pH 7,0) a 37 ° C. Estas bactérias constituem uma fonte de alimento abundante que irá formar uma camada grossa de suporte do crescimento de grandes quantidades de adultos grávidos. Deixar as placas semeadas durante a noite à temperatura ambiente para permitir o crescimento das bactérias. O processo pode ser acelerado por incubação a 37 ° C durante 4-5 horas.
3. Transferir animais sedentos para semeados 8P placas. Lavar os animais fora uma placa NGM esfomeados usando 5-6 ml de tampão M9 ou água e adicionar 1-2 mL desta suspensão a cada placa 8P.
4. Permitir o crescimento e a multiplicação dos animais until das placas são preenchidos em confluência por adultos grávidas.
5. Isolar os ovos necessários para a preparação de C. elegans células embrionárias, a partir de adultos grávidas que usam 5-6 ml de solução de lise.

Solução de Lise receita

5 ml de fresco Bleach, 1,25 ml de NaOH 10 N e 18,5 ml de H ₂ O. estéril Esta mistura deve ser renovada antes de cada utilização.

6. Lave os ovos isolados de adultos grávidas utilizando tampão de ovo:

Receita tampão Egg

NaCl 118 mM, KCl 48 mM, CaCl2 ₂ mM, MgCl2 ₂ mM, Hepes 25 mM, pH 7,3, osmolalidade 340 mOsm.

7. Retirar a casca do ovo, que envolve os ovos por tratamento com quitinase. A chitinase é uma enzima com a actividade mais elevada a pH ácido ^25. Dissolver quitinase (Sigma, catálogo n °. C6137) em tampão de ovo a pH 6,5 a uma concentração final de 2 mg / ml. Guarde o estoque chitinasesolução a -20 ° C em aliquotas de 1 mL em tubos de 15 ml estéreis cónicos. As aliquotas podem ser guardadas a -20 ° C até alguns meses.
8. Crescer C. células cultivadas sobre lamínulas elegans autoclavados (12 mm de diâmetro) cobertos com amendoim lectina. Dissolver amendoim lectina em água estéril (0,5 mg / ml). Solução lectina de amendoim não deve ser filtrada ou autoclavado. Ela também não precisa de ser tratada com luz UV. Loja 2 mL alíquotas a -20 ° C por até 6 meses.
9. Meio de cultura celular completo (500 ml) contém 500 ml de meio L-15 de cultura de Gibco, 50 ml de soro fetal de bovino (inactivado pelo calor), 7,7 g de sacarose (45 mOsm), 5 mL de 100 U / ml de penicilina e de 100 ug / ml de estreptomicina (2%). O meio completo é, então, filtrado usando um filtro de poro de 0,20 um.

Note-se que o tampão de ovo e o meio de cultura tem a osmolaridade de 340 e 345 mOsm, respectivamente. Com efeito, contrariamente às células de mamíferos, C. células elegans tem uma relativamente alta osmolaridadeque tem de ser tido em conta quando se preparam soluções que entram em contacto directo com a membrana plasmática das células. As receitas destes reagentes foram ajustados para atingir a osmolaridade desejada, que foi medido usando um osmómetro ^1. Não é necessário o uso de um osmómetro se estas receitas são seguidos exactamente e cuidado é usado na preparação destes reagentes. No entanto, deve-se usar um Osmoter se outras soluções precisam estar preparados, cujas receitas não são relatados aqui ou em qualquer uma das publicações que usam C. elegans células cultivadas.

2. Ovo de isolamento

1. É recomendável começar com pelo menos quatro placas 8P para recolher ovos suficiente para 12 poços de cultura de células (em placas de 24 poços).
2. Antes de iniciar o procedimento descongelar um tubo da solução de lectina de amendoim. Coloque lamelas autoclavados no fundo das cavidades numa placa de 24 poços e adicionar 200 mL de lectina de amendoim para as lamelas. Incubar durante 1 h ou uté as células estão prontas a ser revestida. Remover completamente a lectina de amendoim e lavar os poços uma vez com 1 ml de água autoclavada estéril. A remoção completa da lectina de amendoim das lamelas é essencial para evitar a aglomeração de células.
3. Lave os adultos grávidas fora das placas de ágar com água autoclavada estéril. Coletar a suspensão em duas estéril tubo cônico de 50 ml. Deixar os tubos em gelo durante até 5 minutos para permitir a precipitação dos vermes, na parte inferior dos tubos (*). Retire a água com uma pipeta de plástico e substituí-lo com água estéril fresco autoclavado. Granulado de vermes por tampo de mesa de centrifugação a 200 x g (~ 1200 rpm) durante 10 minutos (*). Repetir este último passo, pelo menos, 3.
4. Transferir vermes em um tubo de 15 ml estéril, cónico e sedimentar-los a 200 xg (~ 1200 rpm) durante 10 minutos (*). Não usar maior velocidade de centrifugação para evitar a recolha das bactérias na parte inferior do tubo, bem. Às vezes, depois centrifugações os vermes não são completamente peletizada. After cada lavagem e antes da remoção do sobrenadante, colocar os tubos durante 5 min em gelo. Em refrigerados vermes água precipitar para o fundo do tubo.
5. Retire a água e adicionar 5-6 ml de solução de lise (ver material configurado). Balance a suspensão suavemente durante 5-10 min e, em seguida, começar a monitorar verme lise sob a lupa a cada 2-3 min. Uma gota de suspensão pode também ser colocado sobre uma lamela de inspecção mais fácil. O tempo de incubação varia de acordo com o frescor da água sanitária; comprar pequenas garrafas de água sanitária e abrir uma nova garrafa a cada mês.
6. Quando ~ 70-80% dos vermes são lisadas (10 minutos a partir do início do período de incubação), parar a reacção de lise pela adição de 9 ml de tampão pH 7,3 de ovo (ver Materiais definido acima). Centrifugar a suspensão a 200 x g (~ 1200 rpm) durante 10 min. Deste ponto em diante tem um bico de Bunsen em diante, no banco para evitar a re-contaminação dos ovos (*).
7. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de transferência estéril de plástico e lavar o pellet 3-4x com tampão de ovo até que a solução é límpida. Certifique-se de misturar o bem pellet no buffer óvulo durante cada lavagem.
8. Os ovos são separadas das carcaças dos animais, utilizando uma solução de sacarose a 30%. Ressuspender o sedimento em 2 ml de tampão de ovo estéril e adicionar a solução de sacarose de 2 ml de 60% (material em tampão de ovo esterilizada). Misturar bem e centrifuga-se durante 20 min a 200 x g (~ 1200 rpm) (*).
9. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga. Os ovos são flutua à superfície da solução. Usando uma pipeta P1000 e dicas estéreis, transferir todos os ovos em uma frescos 15 ml estéreis tubo cônico.
10. Adicionar 10 ml de tampão de ovo esterilizada aos tubos e centrifugar a 200 xg (~ 1200 rpm) durante 10 min. Repita a lavagem 3 x. Certifique-se que os ovos são completamente ressuspenso no tampão óvulo durante cada lavagem.

3. As células embrionárias de dissociação

Realizar os próximos passos do processo em condições estéreis, utilizando uma câmara de fluxo laminar. Enquanto os animais sãovestido em placas de bactérias, as lavagens e o tratamento com a solução de lise contendo lixívia deve eliminar a maior parte, se não todas as bactérias. Assim, usando uma capa laminar, neste ponto do processo evita a contaminação de novo a suspensão do ovo.

1. Ressuspender ovos peletizadas em 1 ml de 2 mg / ml quitinase (estoque em tampão ovo pH 6,5 (*)) e transferi-los para um novo 15 ml estéril tubo cônico. Rock do tubo para 10-30 min à temperatura ambiente. O tempo exato de incubação muda de acordo com o frescor da enzima e da temperatura da sala e, portanto, deve ser determinado para cada preparação. Recomenda-se iniciar o monitoramento dos ovos sob um microscópio invertido de cultura celular após 10 min de incubação. Nota: em nossa experiência, baixo pH aumenta a atividade enzimática de quitinase. Por esta razão, utilizam ovo tampão a pH 6,5 para dissolver quitinase (receita mencionada acima, onde o pH é ajustado para 6,5 ​​utilizando NaOH).
2. Quando ~ 80% dos ovos são digeridos pelatratamento de quitinase (Figuras 1 AB), sedimentar os ovos por centrifugação a 900 x g (~ 2500 rpm) durante 3 min (*). Usando uma pipeta P1000 e dicas estéreis, retire cuidadosamente o sobrenadante e adicionar 3 ml de L-15 médio (*).
3. Transferir os ovos para uma placa de diâmetro de 6 cm, e suavemente dissociar as células utilizando uma seringa de 10 ml estéril equipado com uma agulha G 18. Controlar o grau de dissociação, colocando uma gota de suspensão em uma placa de Petri de plástico fresco e exibindo sob o microscópio. Não aspirar o ar para dentro da seringa, durante este procedimento, para evitar danificar as células. Continuar a dissociação até ~ 80% das células são dissociadas.
4. Filtrar a suspensão através de um filtro estéril 5 um Millipore. As suspensões de células deve ser filtrada a fim de remover aglomerados de células, ovos não digeridos e larvas chocadas. Filtrar adicionais 4-5 ml de fresco meio L-15 através do filtro para recuperar as células. Não use força excessiva durante a etapa de filtração para evitar damaging o filtro e / ou as células.

4. A cultura de células

1. Agregar as células dissociadas por centrifugação a 900 x g (~ 2500 rpm) durante 3 min (*). Usando uma pipeta P1000 e dicas estéreis retire cuidadosamente todo o sobrenadante. Ressuspender as células peletizadas em completa meio L-15 e a placa 1 ml / poço. A quantidade de meio adicionado depende do número de placas 8P utilizado, a confluência dos vermes nas placas, e do tipo de experiências que vão ser realizadas sobre as células. A densidade celular pode ser determinado utilizando um hemocitómetro. Para gravações de patch-clamp chapeamento densidade de ~ 230 mil células / cm ² é o ideal.
2. Mantenha a placa de 24 poços em um recipiente Tupperware de plástico com papel-toalha molhada para evitar a evaporação do meio de cultura. Guardar o recipiente numa incubadora humidificada a 20 ° C e ar ambiente.
3. As células são normalmente preparados para os testes dentro de 24 horas, quando a diferenciação morfológica e expressaíon de marcadores GFP estão completos. As células podem ser mantidas em cultura durante até 2 semanas, mas são geralmente mais saudável até 7-9 dias após o plaqueamento. O meio deve ser substituído uma vez por dia para manter as células saudáveis.

Resultados

C. elegans células em cultura e diferenciar células expressam marcadores específicos

Christensen e colegas usando a coloração azul de tripan demonstrou que> 99% dos embrionário C. elegans células sobrevivem ao procedimento de isolamento. No dia 9, e 22 após o plaqueamento, 85% e 65%, respectivamente, estão ainda vivos ^1. Isolada embrionário C. células elegans devem aderir a um substrato, a fim de se diferenciar. As células que não c...

Discussão

C. elegans é um poderoso organismo modelo para decifrar os caminhos genéticos envolvidos no desenvolvimento, comportamento e envelhecimento. A sua conveniência provém principalmente da facilidade com que ele pode ser manipulado geneticamente e do seu ciclo de vida curto. Apesar da sua conveniência, C. elegans tem suas limitações. C. elegans células são pequenas e confinado dentro de uma cutícula pressurizado que limita a aplicação de métodos que requerem o acesso directo às célu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Bacto Peptone	VWR International Inc.	90000-382
Difco Agar Granulated	VWR International Inc.	90000-784
Bacto Tryptone	VWR International Inc.	90000-284
Bacto Yeast Extract	VWR International Inc.	90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
NA22 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
Sucrose	Sigma	57903-1KG
D-(+)Glucose	Sigma	67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)	Sigma	E0396-25G
Hepes	Sigma	H3375-500G
Cholesterol
NaCl	Sigma	57653-1KG
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl2	Sigma	C1016-500G
MgCl2	Sigma	M8266-100G
MgSO4	Sigma	M2643-500 g
K2HPO4	Sigma	P2222-500G
KH2PO4	Sigma	P9791-500G
NaOH	Sigma	S8045-500G
KOH	Sigma	P1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
50 ml Conical Tube	USA Scentific	1500-1811
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator