À base de ácido Polymalic Nano Biopolímeros para Segmentação de múltiplos marcadores tumorais: uma oportunidade para a medicina personalizada?

Resumo

Um exemplo de uma droga baseada em nano ácido polymalic é apresentado para o desenho racional de medicina personalizada que é aplicável para o cancro. Ela descreve a síntese de um fármaco nano para tratar o cancro da mama humano HER2-positivos em um ratinho nu.

Resumo

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.

Introdução

Na era pós-genômica quando genomas de câncer já foram desvendados (Centro Nacional de Biotecnologia e The Cancer Genome Atlas), o tratamento futuro de câncer serão responsáveis ​​pela diversidade genética dos tumores, muitas vezes dentro de um mesmo tumor ^1-4. Bioinformática e rápido, não é caro sequenciamento de DNA permite a aquisição de genes malignos / mutações em um nível pessoal ^2,4,5. Uma vez que os genes foram identificados, os pacientes serão tratados com a medicina personalizada para modificar ou silenciar a expressão de genes malignas ^6. A necessidade de atingir as células cancerosas e entregar drogas para essas células exige sistemas de entrega polifuncionais. Obviamente, as drogas nano pode atender a essa exigência ^7.

Em uma onda de afluência de descobertas as nanopartículas têm provado adequado para trazer cargas de fármacos quimioterapêuticos, proteínas e / ou de material geneticamente activa para células cancerosas. No entanto, os efeitos adversos continuam a ser advestida. Um deles relacionado com a ausência de biodegradabilidade pode causar deposição de material no tecido e órgãos saudáveis ​​com o risco de provocar doenças. Para minimizar a deposição, é introduzido ácido polymalic não-tóxico e não imunogénico, o que é de origem microbiana e biodegradável a H ₂ O e CO ₂ ^8. Nós usamos o polímero para sintetizar um tipo de droga nano covalente tudo-em-um. Ela contém substâncias quimioterápicas quimicamente ligados, como Temozolomida, doxorrubicina, ou oligonucleótidos anti-sentido e os grupos funcionais que servem extravasamento, segmentação do tecido, entrega endosomolytic. As drogas estão intrinsecamente separado da plataforma nano quando chegaram na célula tumoral alvo, regenerando assim a sua actividade farmacêutica integral.

Descreve-se o método de produção microbiana da plataforma nano polímero, a sua purificação, e a síntese química de um fármaco que contém nano Trastuzumab (Herceptin) para o cancroA segmentação e um oligonucleótido anti-sentido para a inibição da sobreprodução de HER2. Ao aplicar o medicamento nano para HER2-positivo câncer de mama humano xenogénicos em camundongos nude, demonstramos alta eficácia do tratamento do câncer. Os princípios de direccionamento de tumor e o silenciamento do gene introduzido aqui para polymalic drogas nano ácido pode ser aplicado no tratamento de outros casos de cancro.

Protocolo

Todos os experimentos cumprir com os regulamentos oficiais, incluindo animais de procedimentos cirúrgicos e não cirúrgicos realizados in vivo e estão em plena conformidade com os protocolos IACUC.

1. Bioprodução de ácido Polymalic

1. Crescer uma cultura de sementes de esférulas em agar e transferir plasmódios a 100 ml de meio de cultura com a 25 ° C thermo afirmou incubadora e meio de cultura basal ^8,9.
2. Produzir uma quantidade de repleto de gravidade de 500 ml plasmódios micro, com exclusão de luz, a fim de evitar a esporulação.
3. Prepare 80 g _CaCO3 suspensas em 8 L meio basal em 10 L navio biorreator. Transferir 500 ml de micro plasmódio embalados dentro do recipiente de reacção e permitem a montagem de bioprocessos para 75 horas a 25 ° C, de 10 L / min, fluxo de ar filtrado e 150 rpm de agitação por um agitador segmento.
4. Termina quando o caldo de cultura tem pH 4,8, indicando o fim da produção de MPLA e medir o teor de PMLA por tele hidroxamato / Fe (III) de ensaio.
5. Arrefece-se o caldo a 17 ° C e permitir que as células assentar por gravidade.
6. Arrefece-se até 4 ° C e o pH ajustado a 7,5, utilizar NaOH 2 M. Bombear o sobrenadante através de uma coluna cheia com 1,5 L de DEAE-celulose, em direcção ao fundo para o topo (DEAE grãos grosseiros, equilibrada com 20 mM Tris-HCl pH 7,5 a 5 ° C).
7. Lavar com 3 colunas de tampão contendo 0,3 M de NaCl, após a alteração da direcção de cima para baixo e eluir PMLA na presença de 0,7 M de NaCl.
8. Ajuste a 0,1 M CaCl ₂ e precipitar PMLA-Cálcio com 80% de gelo etanol frio. Fraccionar sobre Sephadex G25 em PMLA-cálcio de 80-300 kDa, 50 - 80 kDa, e 10 - 50 kDa, usar água na ausência de tampão e de sal.
9. Passar cada fracção através de uma Amberlite IR 120H ⁺ coluna, e congelar imediatamente o ácido polymalic fluxo através de azoto líquido para a liofilização.
10. Dissolve-se em acetona seca. Após filtração, remover solventeno fluxo de ar seco, Liofilizar e loja a menos 20 ° C.

2. Síntese de base de ácido Polymalic Nano droga

1. Activar os grupos carboxilo de MPLA (P) através da mistura de 116 mg (1 mmol unidades malil) de MPLA-H em 1 ml de acetona anidra e 1 mmol de N-hidroxissuccinimida e 1 mmol de diciclo-carbodiimida em 2 ml de dimetil formamida (DMF). Agita-se a 20 ° C durante 3 hr. Adicionar 0,05 mmol de mPEG _{5000-NH 2} (0,05% em moles de unidades malil) em 1 mL de DMF seguido de 0,05 mmol de trietilamina (TEA).
2. Adicionar gota a gota, dissolvido em DMF de 0,4 mmoles de éster etílico leucina (Loet) (40% em mol de unidades malil), 0,1 mmol de 2-tiol-1-etilamina (2-MEA) (10% em mol de unidades malil) e 0,5 mmol de TEA, tudo dissolvido em DMF. Após cada adição, deixe 1 hora e verificar a existência de final da reacção negativa por ninidrina resposta (layer-cromatografia de camada delgada, TLC).
3. Não remover restos de NHS-éster por hidrólise espontânea com solução salina tamponada com fosfato (30 min, pH 6,8). Dessalinizar sobre PD-10 Coluna, obter "preconjugate", como um pó branco por liofilização. Seco loja a menos 20 ° C.
4. Dissolve-se 30 mg de anticorpos (mAb, IgG2a-κ) em 4,5 ml de fosfato de sódio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5.
5. Reduzir ligações dissulfureto com 5 mM de tris (etil-2-carboxi) de cloridrato de fosfina durante 30 min a 20 ° C e purifica-se sobre coluna de PD-10.
6. Dissolve-Mal-PEG _3400-Mal em 2 ml do mesmo tampão e adicionar o mAb reduzida a um volume final de 10 ml e agitou-se durante a noite a 4 ° C. Concentre-se para 2,5 ml sobre Vivaspin 20, a exclusão de 30 kDa, e purificar sobre Sephadex G75. Verifique produto sobre seg-HPLC e medir quantidade fotometria no comprimento de onda de 280 nm.
7. Anexar Mal-PEG-Mal-mAb "preconjugate" tióis obtenção P / PEG ₅₀₀₀ (5%) / Loet (40%) / mAb (0,2%) / 2-MEA (10%). Para fazer isso, a mistura de 5 ml de 200 nmol de mAb _3400-PEG-MAL de 50 mg (P / mPEG ₅₀₀₀ / LOEt/2-MEA) no tampão de pH acima de 5,5, ajustar a concentração de sulfhydryl a 2 mM e incuba-se a 20 ° C durante 3 horas (rendimento de 98%).
8. _{Solubiliza-3'-H2N-AON} em DMF / PBS (pH 7,2) e reagem com N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), em (1:1, v / v) de DMF / metanol (teste da ninidrina ) e purificar AON-PDP sobre Sephadex-LH20 em metanol, em seguida, em água e Liofilizar.
9. Incubar 800 nmol AONs activados no tampão de pH 5,5 com o acima preparado Mal-PEG _{3400-Mal-Acm-preconjugate} durante a noite, até a reacção de permuta de dissulfureto é terminada.
10. Incorporar fluorescente Alexa Fluor 680-maleimide formando tioer com polímero-2-MEA-SH. Bloqueie sulfídrilos excesso com 3-piridiltio-propionato (PDP) e purificar sobre Sephadex G75. Armazenar a 4 ° C ou congelados rapidamente à temperatura de -80 ° C até à sua utilização.

3. Ensaios e Propriedades

1. Realizar testes de pureza e estabilidade em PBS e soro a 4 ° C e 37 ° C por meio de análise de SEC-HPLC. Use sulfonato de poliestireno como MolecOs padrões de peso Ular. Medir a distribuição de tamanho de nano-zeta e potenciais. Utilizar sistemas comerciais.
2. Adicionar a 320 mL de amostra 160 mL de 10% (w / v) de cloreto de hidroxilamónio e 160 mL de 10% (w / v) de NaOH. Depois de 10-15 minutos, se misturar com 160 ul de 5% (w / v), Fe (III) Cl ₃ em 12% (v / v) de HCl e ₅₄₀ de ler um hidroxamato / Fe (III). Calcular PMLA assumindo 1 mg / ml PMLA corresponde a 2,5 A _540.
3. Hidrolisar a droga nano durante a noite em HCl 2M a 110 ° C e de ácido málico no ensaio de cromatografia em fase inversa, com referência a amostras contendo padrões de ácido málico. Cleave a droga nano com 100 mM ditiotreitol e medir Morfolino-AON por HPLC de fase reversa quantitativa em relação aos padrões Morfolino AON.
4. Tome drogas nano sem clivagem e medir anticorpo usando um kit de ensaio de proteína. Quantificar mPEG, permitindo sua reação com ferrothiocyanate de amônio, em seguida, extrair com clorofórmio e ler a absorvância a 510 nm de comprimento de onda ^{de 10} .
5. Realize ELISA com 5 mL de droga nano (1-10 mg mAb) por poço testar atividade de anticorpos e coligação. Use 0,5 ug / poço receptor de transferrina e de HER2, respectivamente, como os antigénios revestidos por placa e anticorpos secundários acoplados com peroxidase.
6. Calcule% obtidos para AON, MPEG e mAb no que diz respeito ao ácido málico (100%) e comparar com o% pretendida pelo projeto (ver exemplos Tabelas 1 e 2).

4. Testes in vitro

1. Incubar a droga nano com células cancerígenas cultivadas e medida de células sobreviventes ao longo do tempo, pela sua actividade para reduzir amarelo reagente [3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5 - (3-carboximetoxifenil) -2 - (4-sulfofenil )-2H-tetrazólio, sal interno] (MTS) de um corante azul e ler a absorbância em relação com um fotómetro. Siga as instruções do fornecedor kit.
2. Preparar extractos de células in vitro ou ex vivo para a transferência de Western. Use gelada extração bpode ser prejudicado que contém SDS e cocktail inibidor de protease. Proteínas separadas por electroforese em gel de redução de SDS-poliacrilamida.
3. Do western blotting para as proteínas de interesse nos extratos das amostras. Use anticorpos secundários conjugados com a fosfatase alcalina.
4. Use microscopia confocal para demonstrar a captação celular e co-localização de nano plataforma polímero de drogas, AON e endosomes usando rotulagem de fluorescência. Anexar Alexa Fluor 680 para a plataforma conjugado nano e Lissamine para AONs como rótulos de fluorescência. Usar um scanner de 5X espectral microscópio e as células cancerosas vivas para visualizar a distribuição das moléculas marcadas
5. Membranas endossoma mancha com tinta fluorescente Estiril Red e demonstrar co-localização endosome ou liberação.

5. Testes in vivo

1. Prepare o modelo do rato de câncer de mama HER2-positivo humano (Tac nu mouse: Cr: (MCR)-Foxnnm). Insira um 0,72 mg 17β-estradiol liberando pellet (liberação de 90 dias) subcutaneously no pescoço de cada rato.
2. Em seguida, injetar 1 x 10 ⁷ células tumorais BT-474 por via subcutânea no flanco direito e deixar o tumor crescer.
3. Iniciar o tratamento quando os tumores são de 120 mm ³ de tamanho através da injecção na veia da cauda de 150 conjugado nano ul contendo 2,5 mg / kg de AON e / ou 4,5 mg / kg de cada anticorpo. Para o tratamento injetar duas vezes por semana, num total de seis vezes.
4. Meça o tamanho do tumor com pinças de duas vezes o fraco e calcular volumes usando a fórmula (comprimento x largura x profundidade) x (π / 6). Eutanásia animais 2 semanas após a última injecção e após sedação com uma solução de cetamina e dexmedetomidina, seguido por deslocação cervical.
5. Isolar tumores e seções mancha com H & E para análise morfológica.
6. Para avaliar a distribuição de medicamentos em escala animal, usar um sistema de imagens de fluorescência. Injectar a Alexa Fluor 680 nano rotulado de drogas e de imagem em 24 e 48 horas.
7. Eutanásia do animal e detectar o fluorescence em tumores e órgãos isolados e perfundidos.

Resultados

A inibição do câncer de mama HER2-positivo humano ao silenciar a expressão do receptor HER2, impedindo a sinalização ^HER2-12

Estratégia

Entre as diferentes formas de câncer de mama humano, os tumores HER2-positivos têm o pior resultado clínico. Apresentamos o sucesso do tratamento de câncer de mama com superexpressão de HER2 humano no modelo nu mouse. A estratégia envolve a droga activa em nano tanto o silenciamento imediata da via de sinalização de HER2 empregando Herceptin e AON HER2-specific para o bloqueio da síntese de ARNm de HER2-dependente do receptor (Figura 1). O conjugado nano chumbo, que contém Herceptin e anti-HER2 AON é mostrado na Figura 3, juntamente com os dois controles, que são desprovidos de qualquer Herceptin ou AON. O composto de chumbo contido anti-MsTfRmAb para alcançar extravasamento ativo por transcitose through ligação endotelial TfR dos vasos tumorais. Muito menos absorção para dentro do tumor foi observada na ausência do anticorpo, e foi atribuído ao tumor dependente efeito EPR ^​​13. Versões fluorescentes de conjugados contendo nano Alexa Fluor 680 foram sintetizados por exames de imagem.

. Figura 1 Mecanismo de entrega AON em células de câncer de mama HER2-positivo e inibição do crescimento do tumor canto superior esquerdo:. Conjugado Nano adaptado da Figura 3. Canto inferior esquerdo: vasos tumorais rato expressando TfR na superfície. A droga nano se liga ao receptor e entra no tumor por transcitose. Além disso, um certo grau de acesso para o tumor é possível através das camadas endoteliais desordenadas que participam de tumor dependente de aumentar a captação e retentiem (EPR) ^13. Em seguida, o nanodrug se liga ao HER2 expressa nas células cancerosas humanas e internaliza no início endosomes. Encadernação blocos também HER2 via de sinalização. Após a maturação de endosomes ea sua acidificação, o mecanismo endosome fuga da droga nano é ativado. Nanodrug entrar no citoplasma é libertado a partir da plataforma de nano por clivagem redutora de dissulfureto espaçador e liga-se à proteína HER2 ARNm bloqueio HER2-síntese. O bloqueio da síntese de bloqueio estende-se à proteína HER2 sinalização e induz a inibição do crescimento do tumor.

Produção microbiana da plataforma ácido polymalic

A plataforma conjugado nano, ácido polymalic (MPLA), foi produzido por microplasmodia cultivadas de Physarum polycephalum e purificada a partir do caldo, como descrito no protocolo e ilustrado na Figura 2. Produção e purificação eram lisas e reprodutível. Era importante cont rol tempo, pH e temperatura para evitar a clivagem espontânea do polímero. Lavagem cuidadosa e eluição da coluna de DEAE-é recomendado, a fim de remover o ADN, hidratos de carbono, toxinas e materiais coloridos. Extrema pureza foi obtida após dissolução em acetona anidra e remoção do material insolúvel. A quantidade total de produção foi de 5 PMLA ± 1 g por campanha. Os valores de 1,5 ± 0,5 g altamente purificado PMPLA de M _w 80.000-100.000 foram reproducibly alcançada ao utilizar a 10 L biorreator. Perfis de eluição Sec-HPLC foram simétricas. A análise da dispersão de luz dinâmica de acordo com a distribuição do número indicado um único pico correspondendo a um diâmetro hidrodinâmico de 8 ± 1 nm e um índice de polidispersão de PDI = 0,10 ± 0,02, calculada pelo software do aparelho para as partículas esféricas assumidas. Potencial zeta foi -22 ± 2 mV (pH 7,5).

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Figura 2. Produção e purificação de ácido a partir de micro polymalic plasmódios cultivadas de Physarum polycephalum (adaptado a partir de Lee et al. ^9). Ácido Polymalic (MPLA) é produzido a partir de plasmódios Physarum polycephalum em um biorreator e recolhidos a partir do sobrenadante da cultura através da ligação em permutador de aniões (DEAE). O eluente é etanol-precipitou como sal de cálcio. As soluções do sal de cálcio são Mw fraccionado sobre Sephadex-G25. PMLA contendo frações são convertidos a partir do Ca-sal no ácido sobre Amberlite IR-120H ^+. A livre PMLA está finalmente liofilizado para produzir um pó branco seco.

A síntese química do conjugado nano liderança

P / mPEG ₅₀₀₀ (5%) / Loet (40%) / AON (2.5%) / Herceptin (0,2%) / a nti-MsTfRmAb (0,2%)

As estruturas esquemáticas da droga nano chumbo e de dois conjugados precursor nano são mostrados na Fig. ra 3. O chumbo contém todos os componentes, enquanto que os precursores foram concebidos para a falta ou AON _HER2 ou o anticorpo Herceptin. Além AON e mAbs, os compostos contidos polietileno glicol, MPEG _5000, para minimizar a ligação às proteínas plasmáticas, a depuração através do sistema retículo-endotelial (RES) e degradação por clivagem enzimática. A sequência antisense 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 'era complementar a Her2 mRNA e foi cuidadosamente testado in vitro em várias linhas de células que expressam HER2 obter alta especificidade para o bloqueio HER2 síntese e não mostrando efeitos off-alvo.

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Figura 3. Nano conjuga para tratar o câncer de mama HER2-positivo humano. Liderando droga nano (estrutura superior) contém duas drogas (Herceptin, AON _HER2). Versões 2 e 3 contêm apenas um dos medicamentos. Captação de 1 e 2 em células do tumor HER2-overexpressing humanos é gerido pela ligação de Herceptin. Nano conjugado 3, que não contém o Herceptin, receberam anti-HuTfRmAb para a absorção do endossoma por as células humanas. A conjugação com Alexa Fluor 680 era opcional para fins de imagem. A barra vermelha representa a plataforma conjugado nano PMLA / Loet (40%). % Indica a fracção de resíduos de ácido málico consumidos na ligação do ligando indicada (quantidade total de resíduos de ácido málico no nanodrug = 100%).

Figura 4. Síntese química de nanoconjugados P / Loet / AON _HER2 / anti-MsTfR/Herceptin De cima para baixo:. Síntese de éster succinimidyl PMLA-N-hidroxi (MPLA-NHS) de carboxilatos pingente (ativação química). Substituição de NHS por formação de amida com o 2-mercapto-1-aminoethan (2-MEA), metil-PEG _5000-amina (MPEG _{5000-NH 2),} trileucina (LLL) ou leucina etílico (Loet). Este "preconjugate" atribui mAb-Mal-PEG-Mal por formação de tioéter e AON por formação de ligações dissulfureto quebráveis. Sobra 2-MEA é tampado formando-ditio-propiônico amidoetil ácido. Apenas a ligação de um único mAb é mostrado. Vários anexos são gerenciados usando misturas de mAbs. Percentagem% significa frações de carboxilatos vinculados a vários ligantes (100% de graça PMLA).

Os conjugados de nano foram sintetizados como descrito na Fig. 4 ure. O peso molecular calculado do chumboconjugado foi 719.000. O rendimento global da síntese foi de 45 ± 5% no que diz respeito ao conteúdo de ácido málico. Em média, as 862 unidades malil (= 100%) da plataforma 100 kDa MPLA, 40% realizado Loet, 5% de mPEG, 2% AON 2%, 0,2% e 0,2% Herceptin anti-MsTfR mAb. O valor para cada anticorpo corresponde a uma média de 1,7 moléculas por molécula de plataforma PMLA. O% projetado eo% verificada por análise do grupo eram os mesmos dentro de ± 5%. Um exemplo é o caso, dado na Tabela 1 para o cálculo do teor experimental de ácido málico, AON, mAb e mPEG ₅₀₀₀ e na Tabela 2 mostra a comparação com o conteúdo de desenho. O elevado grau de pureza de acordo com os critérios previstos no capítulo 3 foi obtido com base em rendimentos elevados de reação e separação eficiente por exclusão de tamanho (por exemplo, livre e mAb mAb-nanoconjugate estão separados por 1 min em sec-HPLC) e solubilidade seletiva em solventes. A actividade de anticorpos monoclonais era mostrado a ser mantida durante a síntese de drogas nano, e confirmou-se que os dois tipos de anticorpos foram montados sobre a mesma plataforma polímero. O resultado da experiência de ELISA atípica é mostrado na Fig. 5 ure. Em geral, os ensaios para a análise quantitativa por grupo de ácido málico, AON, proteína, PEG e para ELISA foram robustos, com resultados reprodutíveis quando realizado por pessoal diferente e instrumentação não apenas no caso da síntese relatados, mas também, quando utilizado para a análise de outros nanoconjugates sintetizados.

Tabela 1. Cálculo da composição nanodrug com referência ao conteúdo em ácido málico.

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Tabela 2. Comparação da composição da droga experimental nano com composição projetado.

Figura 5. ELISA para a medição da afinidade dos anticorpos após a síntese química, e para demonstração de múltiplos de ligação de anticorpos diferentes. Nano A droga contém anticorpo mAb (A) e anticorpo mAb (B) contra os antigénios A e B, respectivamente. As placas de ELISA são revestidas com antigénio (A). MAb livre (A), mAb livre (B), e drogas de nano são aplicadas a placas de ELISA. Após a lavagem, os anticorpos são testados com peroxidase secundário anticorpos acoplados específicos para mAb (A) ou mAb (B), enquanto que apenas o mAb (A) está ligado ao antigénio (A). É visto que o fármaco livre e nano conjugada com mAb (A) e, indirectamente, conjugados de mAb (B) da mesma molécula de droga nano, mas não de mAb livre (B), São retidos na placa. A dependência da concentração mostra as afinidades de ligação comparáveis ​​para a livre e conjugado mAb (A), indicando que a conjugação química não afectou a actividade de ligação do anticorpo. Além disso, a co-ligação de mAb (B) com o mAb (A) sobre a mesma entidade física (plataforma nano) resulta em anticorpo mAb (B) de detecção. Os resultados experimentais aqui apresentados referem-se a TfRmAb anti-humano (A) e anti-rato TfRmAb (B). Resultados semelhantes foram mostrados para outros pares de anticorpos testados, tais como anti-MsTfR mAb anti-HER2 e o mAb (Herceptin).

A investigação de propriedades físico-químicas indicadas diâmetro hidrodinâmico de 22,1 ± 2,3 nm, para o P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0,2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) (chumbo, a dois versão da droga), 20,1 ± 2,4 nm, para o P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) / anti-HuTfRmAb (0,2%) (a versão droga AON) e 15,1 ± 1,2 nm, para o P / mPEG (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0,2%) (a versão fármaco Herceptin). Zeta-potenciais, a pH 70,5 foram nesta ordem -5,2 ± 0,4 mV, -5,7 ± 0,6 mV, e -4,1 ± 0,4 mV. Deve ser mencionado que o diâmetro hidrodinâmico medido de nano conjugados não seguiu aditividade dos diâmetros medidos para componentes livres.

Entrega de drogas nano através da membrana da célula tumoral e liberar para o citoplasma, após 0 horas e 3h r

A entrega de drogas nano através da membrana da célula através da incorporação do endossoma é mostrado na Fig. 6 ure após 0 h e 3 h. Etiquetas de fluorescência estão ligados à plataforma nano droga (Alexa Fluor 680, verde) e AON (Lissamina, vermelho). A sua sobreposição é mostrado nos painéis D e L e em conjunto com a fluorescência de endossomas marcados (azul) em painéis G & O. Os coeficientes de correlação de Pearson (r (r) foram calculados a partir das imagens sobre a co-localização de plataforma / endosomes, AON / endosomes, plataforma / AON para 0 horas e 3 horas. Tele imagem 3 hr indicado libertação de endossomas para o citoplasma e dissociação de AON do fármaco nano-dependente glutationa clivagem no citoplasma.

Figura 6. Microscopia confocal para a absorção do conjugado nano por células alvo (adaptado a partir de Ding et al. ^11). As células foram incubadas durante 30 min a 37 ° C com droga nano, que tinha sido marcado duas vezes com Alexa Fluor 680 (verde) na plataforma de polímero e com lissamina (vermelho) ligado ao AON. Além disso, endosomes foram marcadas com FM1-43 (azul). A localização é mostrado depois de 0 h (A) e 3 horas (B), incubação. Painéis A, AB, & B, ij show de coloração pelo menos os fluoróforos conjugadas nano, esua co-localização em A, cd & B, kl. Além disso, a coloração de endosomes é mostrado nos painéis A, e & B, M e da co-localização de conjugado nano e painéis endosomesin A, fg & B, não. Painéis A, H & B, contraste de fase p show para respectivos painéis. (C) de correlação de Pearson coeficientes R (r) para a co-localização de plataforma-endosomes, AON-endosomes, plataforma de AON calculado para 0 horas e 3 horas. favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A inibição do cancro da mama humano in vitro e in vivo

Na inibição do crescimento in vitro de HER2 superexpressão linha celular BT-474 em comparação com baixo linha de células que expressa de MDA-MB-231 é mostrada na Fig. 7 ure. O grau de inibição é 50% e 30%, respectivamente, pela ligação do conjugado nano P / mPEG / Loet / AON _HER2 / Herceptin / anti-MsTfRmAb. Inibição por outros compostos, mas é menos elevado para BT-474 do que para MDA-MB-231. A linha celular BT-474 foi escolhida para o tratamento do cancro da mama do rato xenogénico.

Figura 7. In vitro de inibição do crescimento de HER2 overexpressing células BT-474 de cancro da mama e baixa expressão de MDA-MB-231 (adaptado a partir de Inoue et al. ^12). Comparação da inibição do crescimento para HER2 overexpressing BT-474 A linha celular de cancro da mama ( à esquerda) e do HER2 baixo expressar linha de células de câncer de mama MDA-MB-231 (direita). TfR (s) indica a anti-MsTfRmAb e TfR (Hu / Ms) denota anti-HuTfRmAb & anti-MsTfRmAb. A droga nano chumbo, P / MPEG / Loet / AON _HER2 / Herceptin / DTR (Ms), e nano drogas desprovidas de qualquer Herceptin ou AON _HER2 são comparados com PBS, Herceptin e AON _HER2. Na ausência de Herceptin, anti-MsTfRmAb foi conjugado para proporcionar absorção endossoma pelas células tumorais. As concentrações foram de 40 ug / ml em relação aos anticorpos, 4 uM no que diz respeito ao AON _HER2, 4 uM endoporter (aplicação de AON). Significância denotado por *, P <0,05: **, P <0,02: ***, P <0,003 em comparação com PBS.

Os resultados do tratamento in vivo na Figura 8 são apresentados para ratinhos portadores de BT-474 que sobre-expressam Her2 cancro da mama humano. O crescimento foi inibida> 95% pela nanodrug chumbo contendo Herceptin e AON HER2-specific em comparação com os controlos tratados apenas com PBS (Fig. ure 8). Inibiçãofoi de 60% ou menos com Herceptin sozinho, P / MPEG / Loet / Herceptin ou P / MPEG / Loet / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb. Análise de Western blot de extractos de tumores mostraram inibição da síntese tanto HER2 e Akt fosforilação, mas nenhuma mudança de Akt total e enzima GAPDH de limpeza. PARP foi clivada em correspondência com um aumento do nível de apoptose. Imagens do tumor após o tratamento, e secções de tecidos coradas com H & E ilustra a regressão do tumor é mostrada na Figura 9 ure.

Tamanho Figura 8. Tumoral e proteínas durante o tratamento com chumbo e precursoras nano drogas (adaptado a partir de ¹² de Inoue et al.). Um tamanho do tumor. Dos vários tratamentos (dia 21 ao dia 42, num total de oito injecções). As barras indicam padrãodesvios da média. O chumbo conjugado com anti-Her2 AON e Herceptin foi superior ao sozinho ou Herceptin ou único medicamento contendo nano conjugados. B. Efeito dos diversos tratamentos sobre a expressão de HER2, fosforilada Akt, Akt total parB, parB clivada e GAPDH são mostrados por western blotting. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9. Tratamento de HER2-positivos BT-474 de cancro da mama humano em ratinhos nus de regressão. Tumoral e necrose / apoptose em secções de tecido (adaptado a partir de ¹² Ionue et al.). Superior: Encolhimento do tumor (setas vermelhas). Indicação do pellet estrogênio para suportar o crescimento do tumor (seta azul). Lower: Hematoxilina & Eosina (H & E) coloração de secções de tumor. Em proliferação tumoral é demonstrada pelo empacotamento denso de células tumorais. O tecido necrosado é visto onde as células tumorais foram eliminados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A via experimental para a preparação de medicamentos de nano a partir de um polímero natural biodegradável é apresentado que possa ser usado na síntese de medicina personalizada. A descrição inicia-se com a produção controlada e purificação de ácido polymalic, que é uma plataforma versátil para a síntese de drogas nano. Usando técnicas reprodutíveis, o polímero é obtido com elevado peso molecular e em extrema pureza adequada para a síntese de produtos farmacêuticos. A síntese é descrita para uma droga nano que é mostrada para o tratamento eficaz do cancro da mama HER2-positivos. A descrição pode ser traduzida em síntese da maioria dos outros medicamentos nano para o tratamento de cancro. Direccionamento envolve anticorpos, tais como Herceptin que se ligam a um antigénio específico de tumor, tais como a proteína HER2 ou qualquer outro marcador de tumor que é eficientemente interiorizado. A droga nano proporciona uma selecção de oligonucleótidos anti-sentido e quimioterápicos que irá inibir eficientemente o crescimento do cancro sob tretamento. No exemplo, a ligação Herceptin para HER2 e recozimento oligonucleotídeo antisense específico com mRNA resultou no bloqueio sustentada de HER2-sinalização e redução grave de câncer de mama HER2-positivo de codificação HER2. Com base no princípio subjacente de segmentação tumor ea inibição da expressão gênica por oligonucleotídeos antisense temos a data sintetizados vários outros medicamentos nano e com sucesso inibido glioblastoma humano pré-clínico e triplo-negativo câncer de mama ^11,14-18.

O trabalho de síntese começa com a preparação de altamente purificada plataforma droga nano, que é ácido polymalic do sobrenadante da cultura de Physarum polycephalum (uma espécie de família "fungo"). A preparação enfatiza elevados pesos moleculares do polímero, permitindo que, em princípio, a ligação de vários anticorpos, péptidos, oligonucleótidos e outras moléculas que funcionam na entrega da droga activa e inibição do crescimento do tumor. Following a cultura controlada e purificação, qualidade reprodutível de polímero em rendimentos previsíveis foi produzido. O polímero é armazenado em condições convenientes para a qualquer momento.

A síntese de conjugados de PMLA nano começando com a activação química dos carboxilatos de polímero-pendentes é realizada em alguns passos de síntese. Entre passos, a síntese pode ser opcionalmente colocados em espera que permite a preparação de quantidades arbitrárias de intermediários e, assim, pode ser utilizado na extrapolação. O progresso da síntese é seguida por TLC e os seg-HPLC, e tanto a composição e actividade da droga nano é controlado por ensaios específicos para grupos químicos quantitativo, ELISA, e uma variedade de medições físicas. Nossa experiência é que essas sínteses foram progrediu bem e reproduzível com excelentes rendimentos e pureza. Ao escolher a especificidade de anticorpos e anti-sentido oligonucleótidos qualquer variante de droga nano é sintetizado favoravelmente como necessário em eprsonalized medicina.

As modalidades do sucesso do tratamento do câncer de mama HER2-positivo humano são representantes válidos para elaboração de modelos de câncer mouse, aplicação de medicamentos nano, imagem e análise do crescimento do tumor. Os resultados dos testes de viabilidade in vitro são úteis na escolha da linha de células e o líder da droga a ser utilizada na experiência animal. Xenogen imagiologia in vivo confirma que a droga nano é efectivamente entregues no tumor. Os resultados de western blotting revela se o nível de certas proteínas respondeu da maneira prevista durante o tratamento do câncer. Medição do tamanho do tumor informa sobre o sucesso do tratamento, ou seja, cerca de inibição, recessão ou de regressão. O exemplo descrito reflecte a nossa experiência com outras polymalic à base de ácido nano drogas indicando um elevado grau de previsibilidade e reprodutibilidade notável ausência de toxicidade. Os resultados recentes sobre a toxicidade ea eficácia de vários targeted conjugados de ácido polymalic para o tratamento triplo-negativo câncer de mama estão em forte apoio a esta hipótese ^18. Uma característica fundamental é que nossa droga nano é capaz de penetrar bio-barreiras: a barreira endotelial por extravasamento para o interstício tumoral, a membrana da célula tumoral por captação endosome e ruptura da membrana endosome pela ação dos grupos etílico leucina ou trileucina. Extravasamento e absorção endosome são realizadas de forma confiável pelos anticorpos específicos associados à droga nano. Anticorpo para o receptor da transferrina anti-ratinho medeia influxo eficiente para o tumor por transcitose, provavelmente, porque o receptor está sobre-expresso na maioria dos vasos do tumor. Um anticorpo diferente ligado nas mesmas funções da molécula de conjugado em nano especificamente dirigir a droga nano na célula tumoral destinatário. A presença de ambos os anticorpos, o outro para a transcitose e o outro para a absorção do endossoma, é essencial para o funcionamento óptimo. A análise quantitativa de mácido álicos e anticorpo é altamente recomendado, a fim de controlar a composição ótima da droga nano. Finalmente, deve notar-se que a droga covalente nano tudo-em-um liberta o fármaco na forma quimicamente ligada rota através da vasculatura para o hospedeiro de células de tumor receptor. Fixação química torna a maioria das drogas inativo (pró-fármacos), até que sejam reconstituídos como medicamentos gratuitos por clivagem da plataforma conjugado nano no local alvejado. Isto é importante porque a modalidade reactivação fornece um alto grau de segurança durante a distribuição e a oportunidade mínima de evocar efeitos secundários nocivos. Versatilidade, eficácia e segurança são atributos indispensáveis ​​de um bom remédio personalizado.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine; 2MEA)	Sigma-Aldrich	30078-25G
4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories, Burlingame, CA
90-Day release 17β-estradiol pellet	Innovative Research of America
Alexa Fluor 680 C2 maleimide	Invitrogen	A20344
Amberlite IR 120H	Sigma-Aldrich	6428
Antifoam Y-30 Emulsion	Sigam-Aldrich	A5758
Anti-laminin-411 chain mAbs	Santa Cruz	SC-59980
Anti-pAkt mAb	Cell Signalling	9271S
Anti-PARB mAb	BD Biosciences	556494
Anti-von Willebrand Factor antibody	Abcam	AB6994
Bacto Yeast Extract	Bacto, Dickinson/Sparks, MD	212720
Beta-actin	Cell Signalling	3700
BT-474	ATCC	HTB-20
Calcium Carbonate	Alfa Aesar	36337
Cell Proliferation Assay kit	Promega, Madison, WI, USA	PR-G3580
Centriplus 100	Millipore	4414
Dicyclohexylcarbodimide	Fluka	36650
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Eosin	Cardinal Health	S7439-4
Galardin (MMP-inhibitors)	Santa Cruz	SC-994
GAPDH	Cell Signalling	2118
Hematoxilin	Cardinal Health	S7439-3
Hemin from porcine	Sigma-Aldrich	51280
Herceptin	Genentech	15534
Herceptin (Western blotting)	Cell Signalling	2165S
IgG2a-kappa murine malignoma	Sigma	M77695X5m
Immun-Star AP Substrate Pack	Biorad	170-5012
Immun-StarTM AP Substrate Pack	Biorad	170-5012
LAL Reagent water	Lonza, MD	W50-1000
Laminin-411 mAbs	Abcam
Leucine ethyl ester (LOEt)	Sigma-Aldrich	61850-10G-F
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests	Cambrex BioScience	N384
Lissamin-Morpholino AON	Gene Tools	Custom made
L-malic acid	Sigma-Aldrich	M6413
Malate dehydrogenase	Sigma-Aldrich	M2634
Mal-PEG-Mal	Laysan	mal-PEG-mal-3400
Matrigel	BD Biosciences	354248
Milk, nonfat powdered	Proteomics	M203-10G
Morpholino oligonucleotides	GeneTools	custom made
mPEG5000	Lysan	mPEG-NH2-5000
N-hydroxysuccinimde (NHS)	ACROS Organics	15727100
Ninhydrin	Merck	1.06762.0100
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich	Invitrogen	LC2001
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm	Invitrogen	LC2001
Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25x)	Invitrogen	LC3675
Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm]	Taconic
PBS pH 7.2 10x	Gibco	10010-49
PBS pH 7.2 1x	Gibco	70013
PD-10 desalting columns	GE Healthcare	17-0851
Physarum polycephalum M3CVII	ATCC	204388
Pierce BCA protein assay	Thermo Scientific	23225
Protease inhibitor cocktail	Roche	1.18362E+11
Protein Detector ELISA Kit	KPL	54-62-18
Sephadex G-25 superfine	GE Healthcare	17-0031
Sephadex G-75	GE Healthcare	17-0050
Sephadex-LH20	GE Healthcare	17-0090
SKBR-3	ATCC	HTB-30
SPDP	Proteochem	C1116
Streamline-DEAE	GE Healthcare	17-0994
Styryl Red FM 1-43	Life Technologies	T-3163
TBS 10x	Bio-Rad	170-6435
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706-2G
TLC, silica coated aluminia sheets	Merck, Darmstadt, DE	60F254
Trileucine (LLL)	Bachem	H-3915
Triton X-114	Sigma-Aldrich	X114
Tween®20	Sigma-Aldrich	P1379
Vivaspin 20	VWR	14005-302
DAPI	Vector Laboratories, Burlingame, CA
Dexmedetomidine	Pfizer
Atipamezole	Pfizer
Carprofen	Pfizer
Betadine	Foster and Smith, Wisconsin