Isolamento de tecido adiposo de células imunes

Resumo

O tecido adiposo (TA) é um site de ativação imune celular intensa e interação. Quase todas as células do sistema imune estão presentes em AT e as suas proporções são alteradas pela obesidade. Isolamento adequado, quantificação e caracterização de populações de células imunes são fundamentais para a compreensão do seu papel na doença immunometabolic.

Resumo

A descoberta de aumento de infiltração de macrófagos no tecido adiposo (TA) de roedores obesos e humanos conduziu a um interesse em intensificação da contribuição de células imunes à resistência à insulina local e sistémica. O isolamento e quantificação de populações de células imunitárias diferentes nos magros e obesos AT é agora uma técnica vulgarmente utilizada em laboratórios immunometabolism; Ainda extremo cuidado deve ser feita tanto no isolamento das células vasculares do estroma e na análise de citometria de fluxo, de modo que os dados obtidos são fiáveis ​​e podem ser interpretados . Neste vídeo demonstramos como picar, digerir, e isolar a fração de células enriquecido estroma vascular imunológico. Posteriormente, vamos mostrar como anticorpos rótulo macrófagos e linfócitos T e como fazer corretamente portão los em experimentos de citometria de fluxo. Representante de citometria de fluxo de parcelas provenientes de gordura alimentados com ratos obesos alimentados com gordura de baixa magra e alta são fornecidos. Um elemento crítico da presente análise é o uso de anticorpos que fazemnão fluorescência nos canais onde a AT macrófagos são naturalmente autofluorescent, bem como o uso de controles de compensação adequados.

Introdução

Historicamente, o tecido adiposo (TA) tem sido visto como um órgão inerte de armazenamento de lípidos, a qual expande e contrai em resposta ao equilíbrio de energia. Agora entendemos que a AT representa um órgão endócrino dinâmico que secreta ativamente uma série de hormônios que influenciam diretamente no comportamento alimentar e homeostase da glicose sistêmica. Além disso, durante a última década tem havido uma apreciação crescente para as numerosas populações de células do sistema imunológico que residem na fracção vascular do estroma EM (SVF), bem como a sua contribuição para a AT homeostase.

A capacidade para separar o EM adipócito e SVF utilizando uma digest de colagenase seguido de centrifugação diferencial foi descrita pela primeira vez em 1964 por Rodbell ^1. Colagenase II é mais frequentemente usado para a separação dos adipócitos e SVF devido à manutenção de receptores de insulina adipócitos ^1. Logo no início, fracionamento enzimática da AT foi utilizada principalmente para estudar Adipocyte metabolismo e para isolar pré-adipócitos. Mais recentemente, essa técnica, combinada com a ampla disponibilidade de cytometers fluxo eo número cada vez maior de anticorpos a fluoróforos, disponíveis comercialmente, tem facilitado a caracterização da AT células do sistema imunológico.

Embora a presença de células imunes em inflamada no tinha sido descrita anteriormente ^2, os papéis seminais de Weisberg et al. e Xu et al. publicado em 2003, foram os primeiros a documentar o acúmulo de AT macrófagos (ATMs) em obesidade, que secretam citocinas inflamatórias e correlacionar com a resistência à insulina AT específica e sistêmica ^3,4. Estas observações serviu como a base de um novo campo de investigação recentemente inventado, "immunometabolism" ^5, e foram acompanhados por estudos que implicam diferentes populações de células imunitárias, incluindo as células dendríticas, ^{6 7,} mastócitos, células T ^{8 -}10, as células B, células NK ^{11 12 13,} eosinófilos e neutrófilos ^14,15 no desenvolvimento da resistência à insulina associada a obesidade.

O objetivo deste artigo é a de proporcionar uma descrição pormenorizada da técnica de digestão de colagenase usada para isolar células da EM SVF e caracterizar ATMs e AT células T através de citometria de fluxo. Este protocolo foi otimizado para mouse AT, no entanto, os telespectadores podem se beneficiar da leitura de um excelente artigo que fornece muitos detalhes sobre a otimização da técnica para o ser humano aos ^{16 anos.} O público-alvo deste artigo inclui investigadores com pouca experiência de trabalho com o mouse AT e realizando citometria de fluxo. Várias considerações práticas para equilibrar o rendimento ea viabilidade celular com o tempo e os recursos são apresentados, bem como os controles de citometria de fluxo ideais para a caracterização de populações de células imunes. Além do nosso protocolo, os leitores são remetidoed com um artigo recente da Jove Basu et al. uma excelente discussão de alguns dos aspectos técnicos da citometria de fluxo para incluir controles e compensações ¹⁷ adequadas.

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Protocolo

1. Reagentes e Suprimentos

Antes de se iniciar este protocolo experimental, preparar os seguintes reagentes:

1. 70% de etanol
2. PBS 1X
3. 1X DPBS (sem Ca e Mg), suplementado com 0,5% de BSA
4. FACS buffer: 1X DPBS (sem Ca e Mg), EDTA 2 mM, e 1% de FCS
5. ACK tampão: 150 mM de _NH4Cl, 10 mM KHCO _3, e 0,1 mM Na ₂ EDTA em água

2. A colheita e preparação do tecido adiposo

1. Eutanásia camundongos de acordo com os procedimentos aprovados pela IACUC específicos de cada instituição.
2. Molhe cuidadosamente a pele com álcool 70%.
3. Faça uma incisão no nível do processo xifóide (parte inferior do esterno) e abrir a cavidade torácica para expor o coração, tomando cuidado para não cortar os vasos sanguíneos principais.

Nota: Neste ponto, é também útil a deixar intacto o diafragma tanto quantoe possível cortar um entalhe para fora do lado direito da caixa torácica para permitir que o sangue e perfusato a fluir para fora da cavidade torácica.

4. Prenda o átrio direito para permitir que o sangue e perfusato para escapar do sistema circulatório.

Nota: Quando se trata de ratos obesos, o excesso de pericárdio EM podem precisar de ser removidas para permitir o acesso ao coração.

5. Segure o coração com uma pinça e coloque delicadamente uma agulha no ventrículo esquerdo através do ápice. Lentamente perfundir o mouse com 15 ml estéril PBS.

Nota: reduzir a taxa de perfusão se os pulmões começam a encher e expandir.

6. Abra a cavidade peritoneal e remover as bolsas de gordura perigonadal usando o cuidado de evitar qualquer tecido gonadal.
7. Coloque bolsas de gordura em um barco pesar no gelo contendo 2 ml de 1X DPBS (sem Mg ou Ca), suplementado com 0,5% BSA, e picar a AT em pedaços finos.

Nota: Limite a quantidade de AT por pesar barco a 1,2 g. Se a quantidade de AT superior a 1,2 g, dividi-lo uniformemente entre dois pesam barcos.

8. Manter as amostras em gelo e preparar 3 ml de solução de colagenase por digest EM amostra consistindo de 1X DPBS, suplementado com 0,5% de BSA, 10 mM de _CaCl2, e 4 mg / mL de colagenase tipo II.

3. A digestão de colagenase

1. Transferir AT a 50 ml por tubos cónicos vertendo o homogeneizado e enxaguar o barco pesar com 1 ml de DPBS (0,5% de BSA) e 3 ml de solução de digestão de colagenase II.
2. Incubar a homogeneizado num agitador rotativo (200 rpm) a 37 ° C durante 20 min.
3. Adicionar 10 ml DPBS (0,5% BSA) para tubos cônicos e colocar no gelo.
4. Tritura-se homogeneizado de numerosas vezes usando uma pipeta de 10 ml serológica, as suspensões de células e passar através de um filtro de 100 um para um novo tubo de 50 ml.
5. Centrifugar a suspensão de células a 500 xg durante 10 min a 4 & dpor exemplo; C.
6. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células SVF em 3 ml de tampão de lise ACK para eritrócitos contaminantes.
7. Adicionar 12 ml de tampão de FACS e suspensão de células de centrifugação a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
8. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células SVF em tampão de FACS.

Nota: É o tamanho do agregado de células como um guia de quanto tampão FACS para ressuspender pol Se o pellet celular cobre a parte inferior do tubo de 50 mL cónico, utilize 0,5-1 mL de tampão de FACS, caso contrário, ressuspender em 0,25-0,5 ml.

9. Coloque as amostras em gelo e preparar a aliquotas de diluição de 1:10 de cada amostra para a contagem de células por mistura de 40 ul de tampão de FACS, solução de azul de tripano ul 50 (0,2%), e 10 ul de suspensão de células.
10. Contagem de células viáveis ​​com base na exclusão de azul de tripano e dilui-se suspensões de células a uma concentração final de 5-10 x 10 ⁶ células / ml.

4. A coloração de antígenos de superfície celular

1. Adicionar CD16/CD32 anti-murganho de anticorpos (bloco de Fc) para uma concentração final de 0,5-1 μg/10 ⁶ células, e incubar em gelo durante 10 min.
2. Amostras de transferência (≥ 10 ⁶ células) para 12 x mm de poliestireno tubos de fundo redondo 75. Prepare tubos separados se analisar caixas eletrônicos e células T, e combinar células extra para preparar um número suficiente de tubos para acomodar a compensação necessária e fluorescência modificada menos um (FMO) controles.

Observação: Como um exemplo, quando a quantificação da proporção das ATMs baseado em F4/80 e CD11b, a seguinte compensação e controlos FMO terá de ser preparado

- Não corado (células)

- DAPI ou iodeto de propídio (PI), mancha única (células; não adicionar corante de viabilidade até que o passo 5.1)

- F4/80 APC (células ou contas de compensação) única mancha

- CD11b FITC células individuais da mancha (oucontas de compensação)

- FMO 1 (células): + CD11b FITC corante de viabilidade de IgG2a de rato de controlo de isotipo κ APC + (adicionado no passo 5.1)

- FMO 2 (células): F4/80 APC + κ IgG2b de rato de controlo de isotipo FITC corante de viabilidade + (adicionado no passo 5.1)

3. Adicionar anticorpos primários fluoróforos e / ou controlos de isotipo para a concentração apropriada (ver Tabela de reagentes e materiais).
4. Proteger as amostras da luz e incubar a 4 ° C durante 30 min.
5. Adicionar 2 ml de tampão de FACS e suspensão de células de centrifugação a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
6. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células SVF em 2 mL de tampão de FACS.
7. Centrifugar a suspensão de células a 500 xg por 5 min a 4 ° C, e ressuspender o sedimento de células em SVF ≥ 400 ul de tampão de FACS.
8. Transferir amostras de 12 x mm de poliestireno tubos de fundo redondo de 75 equipado com um filtro de células 35 mM tubo tops.
9. Ao abrigo da luz, e as amostras de armazenar a 4 ° C até à análise por FACS.

Nota: Para resultados óptimos as células devem ser analisados ​​immeadiately, no entanto, a análise de FACS com este protocolo foi realizado com sucesso em células marcadas armazenados em tampão de FACS durante 1-2 horas a 4 ° C. Se as células devem ser fixados para aumentar o tempo de armazenamento, as células marcadas podem ser fixadas com paraformaldeído a 2% a 4 ° C durante 24 horas antes da análise de FACS. Anticorpo empresas sugerem que as células marcadas podem ser armazenados durante até uma semana, no entanto, isto não foi testado no contexto do presente processo.

5. Análise FACS

1. Antes da análise por FACS, adicionar corante de viabilidade para as amostras e controlos apropriados para permitir a discriminação de células vivas / mortas.

Observação: Vários corantes de viabilidade estão disponíveis comercialmente, mas DAPI e PI são recomendados, dependendo da excitação / emissão profiles dos anticorpos conjugados com fluoróforo utilizado. DAPI e iodeto de propídio são adicionados a cada amostra a uma concentração final de 0,2 mg / ml.

2. Usar uma amostra de controlo negativo não corado, de preferência, células isoladas a partir do mesmo tecido, como as amostras experimentais, para ajustar de dispersão lateral (SSC) e de dispersão frontal (FSC), de modo a que a população de células (s) de interesse são em escala.

Nota: Para a análise de EM células SVF, recomenda-se que SSC ser apresentado numa escala logarítmica vs FSC em uma escala linear. A utilização de uma escala logarítmica para SSC é especialmente importante para a análise dos ATM, que são frequentemente muito grandes e granulares.

3. Desenhar um portão de dispersão de luz inicial com base no tipo de célula (s) a ser analisado, e ajustar o tubo fotomultiplicador (PMT), o ganho de modo que as células não coradas estão na extrema esquerda de um histograma de parâmetro único (aproximadamente centrada em 10 de ²⁾ para os canais apropriados.

Nota: É recomendado que os linfócitos e macrófagos (ou outras células mielóides) ser analisada separadamente, devido a diferenças na autofluorescência.

4. Use os controles manchadas individuais ou anticorpo de captura contas de compensação para realizar a compensação multi-color.

Nota: Recomenda-se a utilização de contas de compensação, no entanto, a compatibilidade de cada anticorpo deve ser assegurada. Por exemplo, contas de compensação não pode reação cruzada com anticorpos de coelho, caso em que células isoladas são necessários para obter um controle da mancha único apropriado.

5. Definir portões experimentais baseados em controles FMO modificados.
6. Definir o citómetro de fluxo para recolher o número apropriado de acontecimentos com base na prevalência da população de interesse e gravar dados experimentais.
7. Arquivos de dados de exportação FCS para análise offline. Existem vários programas disponíveis para cytometr fluxoanálise de dados y. Recomendamos Cytobank, uma plataforma baseada na web que permite investigatores para armazenar e analisar os dados e gerar dados a partir de qualquer computador com acesso à internet ^18. Além disso, Cytobank oferece a capacidade de tornar acessíveis dados públicos ou restringir o acesso aos colaboradores.

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Resultados

A colagenase seguido de digestão de EM por centrifugação diferencial foi usado para isolar o SVF de almofadas de gordura epididimal de ratos C57BL/6J machos alimentados com baixo teor de gordura (10% kcal de gordura) ou rica em gorduras (60% kcal de gordura), dieta (LFD e HFD , respectivamente) durante 16 semanas. Células do SVF foram então marcadas com anticorpos primários fluoróforos para quantificar a percentagem de ATMs viável (Figura 1) e AT células T (Figura 2) através d...

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Discussão

O interesse crescente no papel do sistema imunológico nas consequências metabólicas da obesidade levou à utilização generalizada de citometria de fluxo para caracterizar as células imunes do TA. Embora o protocolo exacto irá variar entre laboratórios com base na sua experiência e equipamentos disponíveis, os passos críticos incluem digestão com colagenase, a centrifugação diferencial, e o antigénio da superfície da célula de rotulagem. O objetivo do presente artigo é fornecer um protocolo detalhado e ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml	Life Technologies	14190-250
DAPI	Life Technologies	D3571
BSA	Sigma	A2153-100G
collagenase	Sigma	C6885-5G
propidium iodide solution	Sigma	P4864-10 ml
stable stack 20 microliter	Rainin	SS-L10
20 microliter filter tips	Rainin	SRL10F
stable stack 250 microliter tips	Rainin	SS-L250
1000 microliter tips	Rainin	GPS-L1000
1000 microliter filter tips	Rainin	GP-L1000F
250 microliter Filter Tips	Rainin	SR-L200F
FC Block	BD Biosciences	553142
fisher 100mn strainers	Fisherbrand	22-363-549
medium weigh dish	Fisherbrand	02-202B
aluminum foil	Fisherbrand	1213100
mincing scissors	Fisherbrand	089531B
Vortex	Fisherbrand	2215365
50 ml conical tubes	BD Falcon	14-959-49A
filter top FACS tubes	BD Falcon	352235
10 ml pipette case 200	BD Falcon	1367520
round bottom tubes	BD Falcon	352058
5 ml syringe	BD Falcon	309646
V Bottom Plates	Costar	07-200-107
transfer bulb pipette	Thermo Scientific	13-711-22
Shaker	Thermo Scientific	11 676 071
Adhesive mat	Thermo Scientific	1368750
Cell Culture Centrifuge	Sorvall	75253839
Adapters	Sorvall	75003723
Rat anti-mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553142	Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells
Rat anti-mouse F4/80	eBioscience	17-4801	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321
Rat anti-mouse CD11b	eBioscience	11-0112	Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031
Armenian Hamster anti-mouse CD11c	eBioscience	12-0114	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88
Goat anti-mouse MGL1/2	R&D Systems	FAB4297P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Goat anti-mouse CD206	R&D Systems	FAB2535P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P
Rat anti-mouse CCR2	R&D Systems	FAB5538P	Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P
Armenian Hamster anti-mouse TCRβ	BD Biosciences	553174	Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956
Rat anti-mouse CD8a	BD Biosciences	552877	Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784
Rat anti-mouse CD4	BD Biosciences	557956	Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963
Table 1. List of Materials and Reagents.