A Brasão Cama Ensaio de Sementes para explorar Geneticamente<em&gt; In Vitro</em&gt; Como a germinação Controles do endosperma das sementes em<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Resumo

Nós apresentamos o procedimento para montar um ensaio da cama tegumento (SCBA) de Arabidopsis thaliana sementes. O ARA foi demonstrado ser uma ferramenta poderosa para explorar geneticamente e in vitro como a germinação de sementes de controlo do endosperma de sementes de dormentes e em resposta a sinais de luz. O SCBA é, em princípio, aplicável em qualquer situação em que se suspeita que o endosperma para influenciar o crescimento embrionário.

Resumo

O endosperma de Arabidopsis consiste de uma única camada celular em torno do embrião maduro e desempenha um papel essencial para prevenir a germinação de sementes dormentes ou que de sementes nondormant irradiados por um pulso de luz vermelho longínquo (FR). A fim de obter mais conhecimentos sobre os mecanismos genéticos moleculares subjacentes à atividade repressiva germinação exercida pelo endosperma, um ensaio de "semente da cama casaco" (ARA) foi inventado. O SCBA é um procedimento de dissecção separando fisicamente casacos de sementes e embriões de sementes, o que permite monitorar o crescimento de embriões em uma camada subjacente de tegumento. Notavelmente, o SCBA reconstitui a germinação atividades repressivas do tegumento da semente no contexto da dormência de sementes e controle de FR-dependente de germinação das sementes. Uma vez que o equipamento autônomo permite o uso combinatória de tegumento dormente, normais e sob geneticamente modificado e materiais embrionárias, os caminhos genéticos que controlam a germinação e, especificamente, operating no endosperma e embrião pode ser dissecado. Aqui detalhamos o procedimento para montar um autônomo.

Introdução

Na Arabidopsis, as sementes maduras, o revestimento de semente é composto do testa, a camada externa do tecido morto de origem materna, e o endosperma, uma camada única de células de tecido vivo, que rodeia o embrião ^1. O endosperma e o embrião são derivadas de eventos de fertilização separadas: o endosperma é um tecido com duas triplóides materno e um genoma paterno enquanto que o embrião é um tecido com um diplóide materno e um genoma paterno ^2.

A principal função tradicionalmente designado para o endosperma é a de um tecido nutritivo. No entanto, torna-se cada vez mais evidente que o endosperma também desempenha um papel central para controlar a germinação das sementes. Esta noção tornou-se aparente pela primeira no caso de dormência, uma característica exibida por sementes produzidos recentemente. Sementes dormentes não germinam apesar da presença de condições de germinação favoráveis. Sementes perdem sua dormência depois de um período de maturação e se tornar nondormant, ou seja, elas vão germinar quando expostos a condições favoráveis ​​de germinação. Em muitas espécies de plantas, incluindo a planta modelo Arabidopsis, o tegumento é absolutamente necessário para impedir a germinação de sementes dormentes desde remoção do tegumento desencadeia o crescimento embrionário e greening ^3,4. Na Arabidopsis, Bethke et al. Observou-se que a germinação permaneceu reprimida após a remoção do tegumento, mantendo o endosperma envolvente do endosperma ^5. Estas observações indicaram nitidamente que o endosperma é o tecido no interior do revestimento de semente de exercer uma actividade repressiva sobre o embrião. No entanto, as experiências de remoção do tegumento não necessariamente ajudar a esclarecer a natureza da atividade repressiva germinação fornecido pelo tegumento nem identificar os genes que a implementam.

Recentemente, lançou um ensaio semente cama casaco (ARA), onde casacos de sementes e embriões são separados fisicamente, mas manteve em estreita proxidade, de modo que a actividade repressora germinação fornecida pelo endosperma é mantido ^6. O SCBA permite o uso combinatória de tegumento dormente, nondormant e geneticamente modificada e materiais embrionárias. Como resultado, as vias genéticas que controlam a germinação e operando especificamente no endosperma e no embrião pode ser dissecado. O ARA foi utilizado no contexto de dormência para mostrar que o endosperma liberta o ácido abscísico fitohormona (ABA) em direcção ao embrião para reprimir o crescimento ^6. Além disso, podemos usar a ARA para identificar as vias de sinalização que operam no endosperma e nos tecidos embrionários para promover a dormência.

O papel do endosperma para controlar a germinação foi reforçada por considerar o caso das sementes nondormant expostas a um pulso de longe vermelho (FR) de luz. Cedo após a embebição das sementes um pulso de luz FR é conhecido por inibir a germinação ^7,8. Quando tegumento foram removidos a partir de sementes de um pulso de luz FRfoi incapaz de inibir a germinação, sugerindo fortemente que o endosperma também pode reprimir a germinação das sementes nondormant ^9. Notavelmente, o ARA também poderia ser usado para recapitular dependente da FR inibição da germinação. Isto permitiu demonstrar que a inibição dependente da FR de germinação das sementes é também um processo que envolve a libertação a partir do endosperma do ABA ^9. Além disso, o ARA permitiu identificar as diferentes vias de sinalização luminosa que operam no endosperma e no embrião para controlar a germinação das sementes nondormant em resposta a sinais de luz ^9,10.

O ARA, por conseguinte, parece ser uma técnica de confiança para explorar a função do endosperma no âmbito do controlo de germinação de sementes. É também uma ferramenta poderosa para avaliar in vitro se os genes suspeitos de controlar a germinação operar no endosperma, o embrião ou de ambos os tecidos. Aqui detalhamos os vários passos necessários para montar um autônomo.

Protocolo

Uma vez que o ARA está montado, o crescimento dos embriões é monitorizado ao longo de vários dias. Portanto, antes do procedimento de dissecção sementes e montagem do equipamento autônomo, é preciso esterilizar as sementes, para evitar contaminações futuras que poderiam impedir a adequada avaliação do efeito do material de revestimento da semente no crescimento embrionário.

1. Esterilização Semente

1. Despeje 50-60 ul de sementes de Arabidopsis maduros e secos num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e se preparar uma solução de etanol a 70%.
2. Adicionar 1 ml de solução de etanol a 70% para o tubo de microcentrífuga contendo as sementes e agitar à temperatura ambiente durante 10 min a 1.200 rpm num agitador.
3. Tubo de microcentrífuga Centrifugar durante 3 segundos a 4000 xg para concentrar as sementes no fundo do tubo.
4. Aspirar a solução de etanol a 70%, utilizando uma ponta de sucção a vácuo deixando cuidadosamente as sementes no fundo do tubo de microcentrífuga.
5. Adicionar 1 ml de água destilada estéril para t ele tubo de microcentrífuga contendo ainda as sementes.
6. Agita-se à temperatura ambiente durante 10 min a 1200 rpm.
7. Tubo de microcentrífuga Centrifugar durante 3 segundos a 4000 xg para concentrar as sementes no fundo do tubo. Aspirar o sobrenadante de água utilizando uma ponta de sucção a vácuo deixando cuidadosamente as sementes no fundo do tubo.
8. Adicionar 1 ml de água destilada, água estéril para o tubo de microcentrífuga contendo ainda as sementes. Certifique-se de que o fluxo de água de forma homogénea suspende as sementes no interior do tubo. O objectivo aqui é o de evitar a agitação adicional de modo a preservar a integridade das sementes.
9. Deixe as sementes assentar por gravidade no fundo do tubo, deixando o tubo ainda durante 30 segundos. Aspirar o sobrenadante de água utilizando uma ponta de sucção a vácuo deixando cuidadosamente as sementes no fundo do tubo.
10. Repita quatro vezes os passos de 1,8-1,9. Em geral, o procedimento de esterilização leva cerca de 30 minutos.

2. Semente chapeamento

ONTEÚDO "> Todas as etapas subseqüentes são realizadas dentro de uma câmara de fluxo laminar para preservar condições estéreis.

1. Prepara-se uma placa de Petri (100 mm de diâmetro, 20 mm de altura) contendo 30 ml de meio de germinação preparado por autoclavagem de uma solução contendo 4,3 g / L de meio de Murashige e Skoog a 2,5 mM de 2 - (N-morfolino) etanossulfónico (MES-KOH , pH 5,7) e 0,8 g / L de agar. Deixar a solução arrefecer num banho de água a 50 ° C antes de coloca-lo na placa de Petri.
2. Adicionar 200 mL de água destilada estéril para o tubo contendo as sementes. Ressuspender as sementes e transferi-los na superfície do meio de germinação usando uma pipeta de padrão com uma ponta de 1 ml.
3. Remover a água em torno das sementes na superfície do meio de germinação usando uma ponta de sucção a vácuo.
4. Deixe a placa de Petri contendo as sementes, sem a tampa dentro da câmara de fluxo laminar para 2 horas para posterior secagem. Feche a placa de Petri com a tampa e deixe repousar sob a laminarfluir gabinete por cerca de 90 min para que cerca de 4 horas se passaram desde o início do processo de esterilização de sementes (passo 1.2).

3. Dissecção Semente

Os seguintes passos necessitam de trabalhar com um estereomicroscópio colocado no interior do armário de câmara de fluxo laminar. Uma pinça Dumont # 5 com pontas truncadas (isto é, sem corte) facilita grandemente o manuseamento das sementes (Figura 1A).

1. Prepara-se uma nova placa de Petri contendo 30 ml de meio de germinação. Lugar na superfície do meio de duas estéreis papéis Whatman 3MM justapostas rectangulares (1.5 cm x 1,0 cm; Figura 1B, passo 1). Whatman 3MM papel é esterilizada em autoclave.
2. Transferência de sementes nos papéis Whatman 3MM usando uma pinça estéril (Figura 1B, Passo 2).
3. Segure uma semente indivíduo contra o papel Whatman 3MM, pressionando suavemente a semente usando as pontas sem corte justapostas dos fórceps truncadas ( Figura 1B, passo 3).
4. Cortar o revestimento de semente (testa e do endosperma) da semente, utilizando uma agulha de seringa (por exemplo, insulina U100 + seringa seringa de 1 ml, 0,33 mm (29 L) x 12,7 mm) (Figura 1B, passo 4). A forma de sementes de Arabidopsis é elipsoidal e recomenda-se para cortar a casca da semente ao longo das mais longas semi-eixo principais o mais próximo possível do local onde os cotilédones são unidas à radícula (ou seja, longe da ponta radical). Isto ajuda a libertação segura do embrião na fase seguinte do processo de esvaziamento.
5. Empurre a semente contra o papel Whatman 3MM usando as pontas sem corte justapostas dos fórceps truncadas (Figura 1B, passo 5). Este passo liberta o embrião para o revestimento da semente através da abertura criada na etapa 3,4 (Figura 1B, passo 6). Recomenda-se aplicar a pressão sobre a semente em que a ponta dos cotilédones são em mais próximo da ponta da radícula (isto é, distância from a abertura).

4. Assembleia da tegumento Cama Assay (SCBA)

Veja a discussão para a escolha adequada do número de demãos de sementes e embriões.

1. Prepara-se uma nova placa de Petri contendo 30 ml de meio de germinação. Lugar na superfície do meio de uma peça rectangular estéril (3.5 cm x 5,0 cm) de malha de nylon (Figura 2, passo 1).
2. Para evitar danos, os embriões e os revestimentos de sementes podem ser transferidos para a superfície das bordas metálicas da pinça por suavemente empurrando-os utilizando a agulha da seringa (Figura 2, passo 2). Transferência de embriões e casacos de sementes sobre a malha de nylon (Figura 2, Passo 3).
3. Montar uma camada circular e único de tegumento usando a pinça embotados e da agulha certificando-se de que o tegumento das sementes estão em proximidade, tanto mais perto possível (Figura 2, passo 4). Tente expor tanto quanto possível a abertura do revestimento de semente gerado pelaagulha para cima. Este passo não foi sistematicamente testada. No entanto, ele pode aumentar a eficiência da ARA desde são esperados substâncias difusíveis que inibem o crescimento do embrião de se difundir para fora directamente para o embrião em vez de fora a partir dele.
4. Colocar os embriões como uma camada única circular no centro do leito de revestimento de semente montados no passo 4.3 (Figura 2, passo 5). Certifique-se de que os embriões estão em proximidade, tanto mais perto possível.
5. Incubar as SCBAs sob luz contínua (40 mmol / m ² s ec) a 20-21 ° C. No caso em que um impulso de RF é usado para prender a germinação, montar o ARA sob luz normal, aplica o impulso de RF, como descrito ⁹ e deixar uma placa de Petri em escuridão.

Resultados

Trabalhos anteriores mostraram que as sementes mutantes incapazes de sintetizar GA foram incapazes de germinar, como resultado da acumulação de alta ABA nas sementes ^11,12. No entanto, a incapacidade de germinar requer a casca da semente, desde a sua remoção provoca embrionário ¹³ crescimento. Isto indica fortemente que o endosperma de sementes incapazes de sintetizar o GA está lançando ABA para bloquear o crescimento embrionário. Esperamos, portanto, o tegumento das sementes incapazes de s...

Discussão

Procedimento O ensaio da cama tegumento (SCBA) aqui descrito é, em princípio, aplicável a qualquer circunstância em que a germinação de sementes de Arabidopsis é bloqueado (ou atrasado) e onde o endosperma é suspeito de implementar esta prisão. Este último pode ser evidenciada através da remoção do revestimento de semente (testa e do endosperma) e observando-se que os rendimentos de crescimento mais rápidas embrionárias relativos à observada quando os embriões são rodeados pelo revestimento da...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermomixer Comfort	Eppendorf AG	5355 000.011	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Vacusafe Comfort	INTEGRA Biosciences AG	158 310	Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland
Petri dish plate (100 mm x 20 mm)	Greiner Bio-One GmbH	664 102	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Murashige and Skoog	Sigma-Aldrich	M5524	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
MES	Sigma-Aldrich	M3671	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
Agar (plant agar)	Duchefa Biochemie B.V.	P1001	Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands
Dumont forceps #5	Fine Science Tools GmbH	11251-10	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany
Syringe needle	BD Micro-Fine	324827	BD, Franklin Lakes, NJ USA
Nylon mesh (SEFAR NYTEX)	SEFAR AG	03-50/31	Sefar AG, Heiden, Switzerland
Growth chamber	CLF Plant Climatics	Percival I-30BLLX	CLF plant Climatics, Wertingen, Germany
Paclobutrazol	Sigma-Aldrich	46046	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA