Entérico invasão bacteriana de células epiteliais intestinais<em&gt; In Vitro</em&gt; É dramaticamente aumentada usando um Vertical Modelo câmara de difusão

Resumo

Realizando experimentos de cultura celular para investigar a adesão bacteriana e invasão em condições aeróbias é geralmente representativa do In vivo Ambiente. Um modelo de câmara de difusão vertical permite estudo das interações do patógeno humano Campylobacter jejuni Com células epiteliais intestinais em mais In vivo Condições semelhantes, resultando na invasão bacteriana melhorada.

Resumo

As interacções dos agentes patogénicos bacterianos com células hospedeiras têm sido investigados extensivamente usando métodos de cultura de células in vitro. No entanto, como estes ensaios de cultura de células são realizadas em condições aeróbias, estes modelos in vitro não pode representar exactamente o ambiente in vivo nas quais as interacções hospedeiro-agente patogénico a ter lugar. Nós desenvolvemos um modelo in vitro de infecção que permite a co-cultura de bactérias e células hospedeiras diferentes meios e sob condições de gás. A Câmara de difusão vertical (VDC) modelo imita as condições do intestino humano, onde as bactérias estarão em condições de muito baixo do tecido, enquanto o oxigênio será fornecido com o oxigênio do sangue. Colocação de células (IEC) monocamadas epiteliais intestinais polarizadas crescidas em Snapwell insere um VCC cria compartimentos separados apical e basolateral. O compartimento basolateral é preenchido com meio de cultura de células, selado e perfundido com oxigénio wHilst o compartimento apical é enchido com caldo, mantida aberta e incubados sob condições microaeróbias. Tanto as células Caco-2 e T84 IECs pode ser mantida na VCC sob estas condições sem quaisquer efeitos nocivos aparentes na sobrevivência celular ou a integridade monocamada. Coculturing experimentos realizados com diferentes C. as estirpes de tipo selvagem jejuni e diferentes linhas IEC no modelo VCC com condições microaeróbias no compartimento apical reprodutivelmente resultar num aumento do número de interagir (quase 10 vezes) e bactérias intracelulares (quase 100 vezes) em comparação com as condições de cultura aeróbias ^1. O ambiente criado no modelo VCC imita mais de perto o ambiente encontrado por C. jejuni no intestino humano e destaca a importância da realização de ensaios de infecção in vitro em condições que mais de perto imitar a realidade em vivo. Propomos que o uso do modelo VDC permite novas interpretações das interações apostarween agentes patogénicos bacterianos e as células hospedeiras.

Introdução

As interacções dos agentes patogénicos bacterianos com células hospedeiras têm sido investigados extensivamente usando métodos de cultura de células in vitro. Usando estes ensaios de cultura celular, a adesão bacteriana a células hospedeiras, a identificação de receptores de células hospedeiras, células do hospedeiro vias de sinalização e invasão bacteriana de células hospedeiras têm sido estudadas em pormenor, resultando em muitas observações importantes. No entanto, tais ensaios de cultura de células são realizadas em condições aeróbias, que podem não ser representativas do ambiente in vivo. Uma grande limitação de modelos in vitro utilizados para estudar as infecções gastrointestinais é que as condições de cultura, incluindo níveis elevados de oxigénio, geralmente favorece a sobrevivência de células eucarióticas. No entanto as condições no lúmen intestinal será quase anaeróbias. Patógenos entéricos em um ambiente muito baixa de oxigênio expressar genes de virulência cuja expressão mudanças em condições aeróbias ^2. Como tal, os dados obtidos usando o padrão de cultura de células modelos may dar uma indicação imprecisa de interações bacterianas com células hospedeiras.

Campylobacter jejuni é o principal agente causador de gastroenterite aguda bacteriana em todo o mundo, com sintomas que vão desde diarréia leve a enterite inflamatória grave. A maioria dos C. jejuni infecções resultam em gastroenterite simples, no entanto C. jejuni é também o agente infeccioso mais comumente identificados em neuropatias periféricas, incluindo a síndrome de Guillain-Barré (GBS). No Reino Unido, estima-se que existem mais de 500000 casos de enterite causadas por C. jejuni infecção a cada ano, com um custo previsto para a economia do Reino Unido de £ 580 milhões. No mundo em desenvolvimento, C. jejuni é a principal causa de mortalidade entre as crianças. Apesar da importância inquestionável da infecção por Campylobacter e décadas de pesquisa, incluindo a análise baseada em genômica completa, C. jejuni patogênese ainda é mal understood, em contraste com outros agentes patogénicos entéricos, tais como Salmonella, Escherichia coli, Shigella, e Vibrio cholerae. A falta de um modelo animal de pequeno conveniente é uma das principais razões para esta ^3. Também a amplamente utilizados em modelos in vitro de infecção são mais apropriado para estudar microaerofílica C. jejuni, do que para outros agentes patogénicos entéricos que são anaeróbios facultativos. Enquanto C. jejuni é reconhecido como um agente patogénico invasor, os mecanismos de C. jejuni invasão das células epiteliais intestinais (IECs) ainda não são claras ^4,5. C. invasão jejuni demonstrou ser dependente quer microfilamentos, os microtúbulos, uma combinação de ambos, nem ^5. A confusão nesta área é mais provavelmente devido ao uso de inadequado em condições de ensaio in vitro.

Um número de diferentes ensaios de cultura de células foram utilizadas para investigar as interacções de C. jejunicom as células hospedeiras. Caco-2, ^{6, 7} INT 407, T84 e ⁸ linhas de células têm sido usados ​​para estudar as capacidades de adesão e invasão de diferente C. jejuni. No entanto, os níveis de adesão bacteriana e invasão por C. jejuni com IECs são drasticamente mais baixos do que para outros patógenos entéricos ^9. O coculturing de C. jejuni com IECs é normalmente realizado em uma incubadora de CO ₂ sob condições próximas a níveis de oxigénio atmosférico, necessária para a sobrevivência das IECs. C. expressão gênica jejuni será muito diferente no ambiente de baixo oxigênio do lúmen intestinal em relação às condições atmosféricas de oxigênio.

A utilização de um sistema de câmara de difusão vertical (VCC), foi desenvolvido o qual permite a co-cultura de bactérias e células hospedeiras diferentes meios e sob condições de gás ^1,10,11. Este sistema mimetiza as condições presentes no intestino humano, onde as bactérias irão ser under condições de muito baixa tecido, enquanto o oxigênio será fornecido com o oxigênio da corrente sanguínea. As monocamadas de IEC polarizadas crescidas em filtros especiais 0,4 mM foram colocados num VCC criar um compartimento apical e basolateral, que foram preenchidos individualmente com caldo bacteriano e meio de cultura de células, respectivamente (Figura 1). O VDC foi colocado na atmosfera variável incubadora contendo 85% de N _2, 5% _{de O2,} e 10% de CO _2, a 37 ° C, o que representa condições óptimas para C. jejuni. O compartimento apical foi deixada em aberto e exposto à atmosfera microaeróbia dentro da atmosfera variável incubadora, enquanto que o compartimento basolateral selado foi fornecido com oxigénio por administração constante de 5% de CO ₂ / S mistura gasosa de 95% _2, com um tubo de saída da prevenção da acumulação de pressão . Caco-2, a sobrevivência das células e integridade monocamada sob estas condições foram confirmadas através da monitorização do elemento transepitelialresistência ctrical (TEER) através da monocamada durante 24 h, para demonstrar a separação de sobrevivência de células Caco-2 em monocamada de células e física dos compartimentos apical e basolateral sob baixas condições de oxigénio no compartimento apical. O TEER de monocamadas em VDCs mantidos na incubadora de atmosfera variável (condições microaeróbias) e um padrão de cultura de células incubadora de CO ₂ (condições aeróbias) não apresentaram diferenças significativas, indicando integridade da monocamada de células em diferentes condições atmosféricas ^1. Sob condições microaeróbicas, junções apertadas permaneceu presente e uniformemente distribuída entre as bordas das células, com um padrão de coloração occludin semelhantes às células mantidas sob condições aeróbicas ^1.

As interações de C. jejuni com células Caco-2 e T84 células na VCC foram investigados avaliando interacção bacteriana (adesão e invasão) e invasão. Dois C. diferente jejuni tipo selvagem strains foram usados ^​​1. C. jejuni 11168H hypermotile é um derivado da estirpe NCTC11168 sequência original. A tensão 11168H mostra níveis muito mais elevados de colonização em um modelo de colonização garota e, assim, é considerada uma cepa adequada de usar para estudos de interação patógeno-hospedeiro. 81-176 é isolar um ser humano e é uma das estirpes laboratoriais amplamente estudados mais invasivos. C. jejuni foram adicionados ao compartimento apical de uma VCC, quer sob condições microaeróbias ou aeróbico. Observou-se taxas mais elevadas para a interação e invasão foram registradas para C. jejuni em condições microaeróbicas ^1. O aumento C. jejuni interacções não eram devidas a um aumento no número de bactérias em condições microaeróbias ^1. Estes dados apoiam a hipótese de que o ambiente de baixo teor de oxigénio no compartimento apical do VDC aumenta as interacções de bactérias hospedeiras, e indica que as propriedades invasivas de C. jejuni são incraliviou sob estas condições. Este foi o primeiro relato da utilização do modelo de VCC a estudar um agente patogénico bacteriano invasiva e realça a importância de efectuar ensaios de infecção in vitro sob condições que imitar mais de perto a situação in vivo. O VDC modelo pode ser usado para estudar as interacções hospedeiro-agente patogénico para muitas espécies de bactérias diferentes.

Protocolo

1. Crescimento do IEC Monolayers em especial Filtros 0,4 mM

1. Culturas células Caco-2 em meio essencial modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro (v / v) de vitela fetal, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 1% (v / v) de aminoácidos não essenciais em um cultura de tecido padrão incubadora a 37 ° C em 5% de CO ₂ e 95% de ar. Semente de 4 x 10 ⁵ células Caco-2 IECs por 0,4 um filtro de polarização e crescer para mais de 21 dias, passando os meios de comunicação a cada 2-3 dias.
2. Medir a TEER para confirmar o estado de polarização da monocamada utilizando um medidor de resistência de volt-ohm. Nos nossos estudos, o TEER de 21 dias as células Caco-2 cultivadas nesses filtros 0,4 mM é Ωcm 700-800 ^2.

2. Preparação de C. jejuni e Médio bacteriana para o Ensaio Coculturing

1. 24 horas antes do ponto desejado do ensaio coculturing VDC partida, preparar um prato fresco agar sangue de C. jejuni e incubar a 37 ° C sob condições microaeróbias (85% de N _2, 5% _de O2, e 10% de _CO2) na atmosfera variável incubadora.
2. Ao mesmo tempo, pré-incubar 30 ml de caldo de brucela a 37 ° C sob condições microaeróbias numa incubadora de atmosfera variável.

3. Preparação e esterilização do meio Chambers VDC Antes do Ensaio

1. Mergulhe completamente câmaras VDC meia, assim como os anéis e as fichas na solução de esterilização.
2. Usando um estéril seringa de 20 ml, lavar a solução de esterilização através das entradas de gás em ambas as câmaras meia. Não fazer isso pode resultar em contaminação das amostras durante coculturing.
3. Deixar os componentes imersos na solução de esterilização durante> 1 h.
4. Lave todos os componentes com água estéril fresco, usando outra seringa de 20 ml estéril para lavar as entradas de gás.

4. Preparaçãodo inoculo bacteriano

1. Colher metade de um prato de C. jejuni crescimento da placa de agar de sangue preparado no dia anterior em 1 ml de caldo de Brucella-incubadas. Isto deverá dar ~ 10 ¹⁰ ufc / mL.
2. Determinar a densidade óptica da suspensão bacteriana a 600 nm para semiquantify unidades formadoras de colónias bacterianas (UFCs).
3. Ajuste a suspensão bacteriana para o nível desejado de inoculo em 4 ml do caldo de Brucella-incubadas.
4. Efectuar uma diluição em série a partir desta suspensão bacteriana definitivo seguido por plaqueamento das diluições apropriadas em placas de agar de sangue, em triplicado, em seguida, incubado a 37 ° C na atmosfera variável incubadora durante 48 horas para quantificar o número de CFUs bacterianas presentes no inoculo.

5. Configurando o VDC

1. Coloque a metade inferior de uma câmara VDC plano para o banco. Montar um O-ring para a metade inferior da câmara.
2. Retire um filtro que transportam os IECs de tele transportador e lavar três vezes com 400 ul de PBS estéril. Coloque o filtro na metade câmara baixa, certificando-se o anel continua em vigor.
3. Delicadamente abaixar a metade câmara superior no lugar. Uma vez que as duas meias-câmaras são montados, apertar em conjunto, utilizando as braçadeiras de anel. Coloque a VCC horizontalmente no topo da bancada, com as duas aberturas voltadas para cima.
4. Adicionar 4 ml de inoculo bacteriano na metade câmara apical.
5. Adicionar 4 ml de meio de cultura celular para a metade câmara basolateral.
6. Coloque as peças finais nas aberturas de ambas as câmaras meia.

6. Colocar a VDC para o Manifold gás dentro da variável Atmosfera Incubadora

1. Coloque a VCC na atmosfera variável incubadora em estreita proximidade com o colector de gás.
2. Abra o regulador de alimentação de gás ligados ao colector de gás. Ligar o tubo a partir do colector para dentro da entrada de gás na câmara de metade basolateral da VCC. Prenda a gas saída do tubo que conduz para fora da atmosfera variável incubadora para uma das saídas no final peça na metade câmara basolateral.
3. Feche o outro na saída da peça de extremidade na metade câmara basolateral. Abra o fluxo de gás no coletor de gás, tendo o cuidado para abri-lo muito lentamente para evitar o excesso de pressão do gás, pois isso pode levar à expulsão do meio basolateral.
4. O objetivo é um fluxo de 1 bolha a cada 2-5 segundos gás. Verifique periodicamente no fluxo de gás durante o curso do experimento e ajustar se necessário.

7. Desmontagem do VDC após Coculture

1. Após o período de co-cultura apropriado, feche o regulador de gás ligado ao colector de gás. Feche o fluxo de gás para o VDC no coletor. Desligar a entrada do gás, a saída do gás, e a rolha do VCC.
2. Remover o VCC de uma incubadora de atmosfera variável. Remover o sobrenadante e armazenar apical e basolateral a -80 ° C para subsequenanálise t.
3. Remova os grampos anel e tomar cuidado para além do VCC. Retire o filtro a partir da metade da câmara e transferir para um 6-bem placa de cultura de células estéreis. Lavar as IECs três vezes com 400 ul de PBS estéril.
4. Por contagem do número total de bactérias que interagem, adicionar 400 ul de PBS estéril que continha 0,1% (v / v) de Triton X-100 para as IECs e incubar durante 20 min à temperatura ambiente para lisar o IEC. Efectuar uma diluição em série a partir desta ligado celular, seguido por plaqueamento das diluições apropriadas em placas de agar de sangue, em triplicado, em seguida, incubado a 37 ° C na atmosfera variável incubadora durante 48 horas para quantificar o número de interagir CFUs bacterianas.
5. Por contagem do número total de bactérias invasoras, adicionar 400 mL de meio de cultura celular DMEM contendo 150 ug / ml de gentamicina às IECs e incubar durante 2 horas numa incubadora de cultura de tecido padrão, a 37 ° C em 5% de CO ₂ e 95% ar para matar as bactérias extracelulares,siga como para a etapa 7.4 acima.

8. Limpando o VDC após Coculture

Lave o VDC com água estéril e loja para a próxima rodada de experimentos.

Resultados

Coculturing experimentos realizados com um C. jejuni estirpe de tipo selvagem e IECs no modelo VCC com condições microaeróbias no compartimento apical demonstraram um aumento no número de interagir (quase 10 vezes) e bactérias intracelulares (quase 100 vezes) em comparação com as condições de cultura aeróbias em um tempo maneira dependente da ^1. Esta observação foi reprodutível usando duas C. diferente jejuni do tipo selvagem (11168H e 81-176) e duas linhas IEC diferent...

Discussão

A utilização de métodos de cultura de células in vitro para estudar as interacções dos agentes patogénicos bacterianos com células hospedeiras é uma técnica amplamente utilizada em muitos laboratórios de investigação. No entanto, como estes ensaios de cultura de células são realizadas em condições aeróbias, estes modelos in vitro não pode representar exactamente o ambiente in vivo nas quais as interacções hospedeiro-agente patogénico a ter lugar. A amplamente uti...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts	Harvard Apparatus	66-0001	Manifold & six Snapwell chambers
Caps	Harvard Apparatus	66-0020
O-rings	Harvard Apparatus	66-0007
Clamps	Harvard Apparatus	66-0012
Snapwell filters (pore size 0.4 μm)	Corning Costar	3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter	Millipore	MERS00002
WPA Lightwave II spectrophotometer	Biochrom	80-3003-72