Técnica de Estudos de Artrópodes e comunidades microbianas dentro Árvore Tecidos

Resumo

We provide a technique to preserve intact tree phloem and prepare it for observation. We create an apparatus called a phloem sandwich that allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms that inhabit phloem tissues.

Resumo

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms. Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear young, feed, or hide from natural enemies or harsh environmental conditions outside of the tree. Organisms that persist within the phloem habitat are difficult to observe given their location under bark. We provide a technique to preserve intact phloem and prepare it for experimentation with invertebrates and microorganisms. The apparatus is called a ‘phloem sandwich’ and allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms. This technique has resulted in a better understanding of the feeding behaviors, life-history traits, reproduction, development, and interactions of organisms within tree phloem. The strengths of this technique include the use of inexpensive materials, variability in sandwich size, flexibility to re-open the sandwich or introduce multiple organisms through drilled holes, and the preservation and maintenance of phloem integrity. The phloem sandwich is an excellent educational tool for scientific discovery in both K-12 science courses and university research laboratories.

Introdução

Floema e casca tecidos de coníferas são hospedeiras de milhares de organismos. Phloeophagy, a alimentação em tecidos do floema da casca interna, é um hábito normalmente associado com besouros, woodborers, e vários outros táxons de invertebrados e micróbios que vivem dentro de árvores ²³ besouros. (Coleoptera: Curculionidae) desenvolver e viver dentro de floema, exceto para períodos curtos quando os adultos procuram novas árvores hospedeiras. ³¹ Casca besouros têm sido extensivamente estudadas devido aos seus impactos econômicos sobre árvores ^18,19, mas observações comportamentais dos insetos dentro de materiais de árvores têm sido limitadas. ⁴ Além disso, as galerias construídas por besouros tornar-se o habitat de uma infinidade de espécies. ¹¹ Um vasto número de fungos, bactérias ^{30 3,} ácaros e nematóides ^{10,21, 16,19,} juntamente com outros artrópodes predadores e parasitas ^22,24 habitam o material floema. As técnicas fornecidas aquipermitem a observação direta de besouros, ácaros e brocas de madeira que normalmente vivem em ambientes subcorticais. Ligeiras alterações ao protocolo pode ser feita para estudar os fungos e bactérias.

Besouros e organismos associados, dentro dos tecidos de árvores foram estudadas utilizando um "sanduíche floema." O uso precoce dessa técnica podem ser encontrados na literatura, que remonta a 1933, quando foi usado para observar os estádios larvais de Douglas-fir beetle (Dendroctonus pseudotsugae). ² O sanduíche floema passou por muitas derivações como diferentes materiais se tornaram disponíveis. Originalmente, este dispositivo consistia de um pedaço de floema colocado entre duas placas de vidro, pressionadas em conjunto por bandas elásticas. ² Mais tarde, grampos, fita adesiva, cola, plástico, e outros materiais têm sido utilizados na construção da sanduíche. ^{13,14 , 15,17,26,28} O protocolo descrito aqui oferece melhorias sobre alguns dos projetos anteriores. Por exemplo, emAntigamente, as espécies de teste foram inseridos no lado da sanduíche, entre as placas de vidro ou de plástico. Isto restringiu a construção de galerias para uma direção. A utilização de orifícios de entrada na placa de topo permite uma maior liberdade para a espécie de ensaio para iniciar galeria construção natural. Uma outra vantagem do protocolo apresentado é o seu desenho simplificado, que pode ser facilmente construída com poucas ferramentas. O uso do sanduíche floema permitiu observações diretas do comportamento alimentar, reprodução, desenvolvimento e interações de organismos que de outra forma não teria sido possível. ^{1,5, 22} Este método também é uma excelente ferramenta para a K-12 educação e ciência programas e exibida.

Existem várias subtilezas na criação de uma sanduíche de floema que são difíceis de interpretar a partir ou não relatada em manuscritos. Cremos que um (isto é, vídeo) Descrição visual da produção de um sanduíche de floema é necessário e seriade valor para os cientistas e educadores interessados ​​em estudar organismos phloeophagous. Nosso protocolo fornece uma maneira simples e barata para observar artrópodes, micróbios e outros organismos que habitam os tecidos do floema.

Protocolo

1. Floema Seleção e remoção de árvore

1. Escolha uma árvore com características particulares. Colete floema de pinheiros (ou seja, árvores do gênero Pinus), como eles têm uma camada distinta floema que é de vários milímetros de espessura. ^18,27 Uma vez que uma árvore está localizado que tem poucos ramos mais baixos, verifique se existem outros defeitos, tais como ataques de insetos e / ou patógenos. Como alternativa, use floema de outras árvores coníferas, como abetos em sanduíches floema. ⁹ Outras espécies árvores pode ser adequado para a remoção do floema, como madeiras.
   NOTA: As árvores coníferas com grandes coroas têm tipicamente o mais grosso tecido floema. Para maximizar a quantidade de floema, o melhor é cortar árvores que têm poucos defeitos e galhos no tronco (fuste). Espécies de pinus que são obra de auto-poda melhor. Floema é tipicamente mais espesso durante a estação de crescimento e é mais espessa mais acima no tronco do que perto do chão. Floema às vezes é difícil remove das árvores durante o outono ou inverno.
2. Cortar uma árvore para baixo ou usar os logs recentemente cortadas para obter floema. Escolha uma direção de queda que irá minimizar os danos à árvore, bem como árvores próximas. Ramos cortar o tronco para facilitar o acesso a materiais de casca durante a remoção do floema.
3. Uma vez que uma árvore é cortada (derrubadas; caiu no chão) começar a raspar a casca do tronco com uma lâmina afiada empate (Fig 1A.). Raspe uma área da casca fora até que a camada de floema é atingido.
   NOTA: A camada de floema é tipicamente de cor mais clara (por exemplo, cor de creme) e úmido, enquanto a casca externa é mais seco e de cor mais escura (Fig 1B.). Tome especial cuidado para não raspar o floema. A área raspada da casca depende do tamanho da peça (s) necessária floema.
4. Depois que a casca é removida, cortar um esboço da peça floema com uma faca afiada. Certifique-se que a faca corta todo o caminho para o xilema (Fig. 2A).
5. Para remover o floema, começar em um canto da peça floema usando os dedos para descascar cuidadosamente de volta o floema. Use uma faca para ajudar a raspar o floema fora do xilema. Continue puxando o floema fora até que toda a peça é removida.
   NOTA: Floema normalmente descasca fora da árvore mais fácil no verão. Para floema que é extremamente difícil de remover, uma ferramenta em forma de espátula pode auxiliar no esforço.
6. Coloque o pedaço floema imediatamente em um saco estéril. Para melhores resultados, feche o saco de vácuo (Fig. 2B) ou, se o uso de sacos Ziploc, retire todo o ar do saco. Isto aumenta a longevidade do floema. Opcionalmente, colocar várias peças de floema em um saco. Floema loja em sacos hermeticamente fechados ligeiramente acima de zero (entre 1 e 10 ° C) para manter a sua frescura.

2. Criar o sanduíche Floema

1. Corte dois pedaços iguais de acrílico transparente, policarbonato ou material similar duro, claro (por exemplo, vidro), um pouco grander que o pedaço de floema (Fig. 2C). Redondo as bordas do acrílico para prevenir os cantos de rasgar o selo Parafilm. Este protocolo usa um 1/8 em. Acrílico transparente de espessura.
   NOTA: O tamanho das peças cortadas depende das necessidades do organismo e sujeito a duração do estudo. Por exemplo, um par de besouros utiliza 4 dm ² de floema durante um período de meses, mas só vai precisar de um dm ² se o estudo tem lugar dentro de alguns dias.
2. Perfurar um furo em uma das peças de acrílico para permitir a entrada de organismo (s) de estudo. O tamanho e número de furos depende dos objectivos (Fig. 2D).
3. Antes de colocar o floema entre as peças de acrílico, esterilizar a superfície de acrílico (com> 70% de etanol), ou, se estiver usando o novo acrílico, retire a película protetora.
4. Coloque o pedaço de queijo fresco de floema entre as peças acrílicas estéreis. Oriente a parte acrílica com o furo (s) no lado interior ou exterior do floema, whichever é necessária. Tipicamente, voltado para a parte exterior do floema (lado que tinha nele casca) para os orifícios de entrada.

3. Vedação da Sandwich Floema

1. Para criar um selo temporário em torno da sanduíche floema, em utilizar 2. Parafilm tiras largas puxados em torno dos bordos da sanduíche de floema (Fig. 2C). Como alternativa, usar um envoltório de cloreto de polivinilideno para selar as arestas. ⁶ Em seguida, colocar um grampo de cada lado da sanduíche para espremer o acrílico para o floema. Certifique-se que toda a superfície é apertado para baixo para evitar o espaço aéreo entre o acrílico e floema (Fig 2C). Se não fixada corretamente, as amostras podem mover-se entre o acrílico e floema.
2. Para criar um selo semi-permanente adicionar um epoxi ou vaselina não-colagem em torno do floema. Certifique-se de que o material envolve completamente o floema. Em seguida, use grampos ou parafusos com parafusos (pode precisar de fazer furos antes do tempo) para manter o acrílico apertado ao floema.Os sanduíches apenas permanecer viáveis ​​por até um ou dois meses.
3. Dependendo das necessidades de oxigénio dos organismos de estudo, adicionar um filtro de ar em um ou mais lados da sanduíche. Isto irá permitir que o ar a entrar na sanduíche floema, mas limitar a perda de água a partir do floema. Nós usamos filtros de carvão simples que também reduzem o risco de contaminação fúngica e bacteriana.
4. Para as amostras de estudo que exigem a entrada e saída à vontade, substituir uma das peças de acrílico com madeira ou material similar que um inseto pode penetram. Isto é particularmente importante para a observação das sondas de madeira, porque, depois de o seu estado larval é completado na camada de floema, em seguida, eles perfuram o xilema.
5. Para evitar cobaias de sair dos orifícios de entrada, coloque pequenas placas de petri (ou outros objetos, fita) sobre os buracos, fuga de bloqueio. Desde organismos que residem nesses espaços são habituar a níveis baixos de luz, pode ser necessário colocar os sanduíches em um quarto escuro ou caixa, ou o lugarmaterial de paque em cima para bloquear a luz.

4. Observando organismos no Sandwich Floema

1. Introduzir espécimes de estudo no orifício de entrada do sanduíche floema (Fig. 2D). Observe as amostras usando um microscópio de dissecação sob uma luz vermelha ou luz branca fixada em um nível baixo (Fig. 2E).
2. Para gravar as atividades ou o crescimento de espécimes dentro do sanduíche floema anexar uma câmera ou câmera de vídeo para o microscópio. Anexar câmeras de vídeo especiais para a ocular do microscópio (Fig. 2E & F). Por muito pequenos organismos, como ácaros, nematóides e pseudoscorpions, use uma câmera de vídeo de alta definição acoplada ao microscópio.
3. Para gravar sons, microfones inserir dentro do orifício de entrada do floema sanduíche ou através do lado da sanduíche de floema. Uma vez que o orifício de entrada é pequena, utilizar um pequeno microfone tal como um microfone de condensador de electreto.
4. Para gravar a partir do lado ou a superfície deo floema sanduíche usar um elemento piezo (Fig. 3B). Para reproduzir o som, use o mesmo elemento piezo ou anexar um transdutor tátil (excitador) para a superfície da parte superior ou inferior do acrílico.

Resultados

O protocolo descrito acima irá permitir que um investigador observar os organismos que vivem no ambiente críptico por baixo da casca de uma árvore. Para ilustrar o uso desta técnica, descrevemos um estudo representativo de nosso laboratório que usa esta técnica. ¹² Nesta experiência, sanduíches floema foram usados ​​para observar os efeitos de tratamentos acústicos na produção de descendência, distância de tunelamento, ea sobrevivência de besouros (Fig . 2E e 2F). A observação directa dos besouros, tornada possível pela utilização de uma sanduíche de floema, revelaram várias conclusões interessantes. Em primeiro lugar, nós gravamos distâncias tunelamento diárias, marcando a localização dos besouros no acrílico com um marcador a cada 24h. Este processo revelou diferenças significativas entre os tratamentos de som que teriam sido escondidos sem o sanduíche floema. Em seguida, observou-se uma redução na produção de ovos com determinados tratamentos de som. A natureza móvel do sanduíche floema permitiu eobservações gg para ser concluída sob um microscópio de dissecação, sem perturbar os besouros. Durante estas observações, capturado, que o comportamento do ovo besouro com uma câmera de alta definição acoplada ao microscópio. Outras observações notáveis ​​incluíram o assassinato de companheiros eo início de voo associado com tratamentos acústicos particulares. O ensaio sanduíche floema foi crucial para o nosso estudo das respostas besouro casca para tratamentos acústicos. Estas descobertas, o que seria impossível observar debaixo da casca de uma árvore, são contribuições valiosas para o desenvolvimento de opções de gestão para combater surtos casca do besouro.

Figura 1. A) Ferramentas necessárias para remover a casca da árvore. Itens 1 e 2 são lâminas de tração usados ​​para raspar casca fora da árvore. Os itens 3 (machado) e 4 (pull-serras) são úteis para remover galhosárea de barbear próximo. B) O uso de lâmina empate para remover a casca de árvore. Observe a cor da luz do floema por baixo da casca avermelhada.

Figura 2. A) Remoção de floema após casca foi raspado de árvore. B) floema fresca armazenada em saco selado a vácuo. C) sanduíche Floema com grampos segurando as peças de acrílico em conjunto e Parafilm em torno das bordas para evitar a contaminação e dessecação de floema. D ) Besouro de casca buraco perto perfurado em acrílico. E) que usam o microscópio para observar sanduíche floema. exibição F) Vídeo de besouros dentro sanduíche floema.

Figura 3. A) aquisição feromônio dos besouros em sanduíche floema. Air está sendo puxado através de tubos contendo Super-Q B) A gravação ea reprodução de som absorvente. Através de um transdutor piezo-elétrico (centro da foto) para besouros montanha de pinheiros dentro de sanduíche floema.

Discussão

O sanduíche floema permite a introdução e observação de artrópodes, micróbios e outros pequenos organismos que habitam os tecidos do floema ^{1,7,8,9,17,18} Esta técnica tem resultado em novas descobertas e uma melhor compreensão dos comportamentos., Vida traços de história, desenvolvimento e interações de organismos dentro do floema da árvore. ^1,5,10 O protocolo sanduíche descrito aqui é um híbrido de projetos anteriores, e irá fornecer um sanduíche econômico que é facilmente construído com equipamentos e materiais mínima. As peças de vidro, acrílico ou policarbonato podem ser reutilizados, e os únicos materiais de consumo são o Parafilm e floema.

Apesar de todas as etapas do protocolo são importantes, algumas etapas devem ser seguidas estritamente para garantir o mais alto grau de sucesso. Em primeiro lugar, uma árvore deve ser localizada, que tem uma parte do fuste livre, ou relativamente livre, de ramos. As árvores que têm muitos ramos são difíceis de fazer a barba e vontade yalgumas peças do floema viáveis ​​ield, como todos os ramos devem ser cortados em torno ao remover o floema. Em seguida, é importante para minimizar a exposição ao ar do floema. Nós rapidamente colocar cada peça floema em um saco em cima da remoção. Depois de 3-6 peças são removidos, eles são transferidos para um saco selado a vácuo; usamos um inversor de potência para executar o aferidor de uma bateria de veículo no campo. Por último, saneantes as peças acrílicas e limpeza geral ao executar este protocolo irá reduzir o crescimento de fungos no sanduíche. Isto é especialmente importante para as observações estendidos.

Como mencionado acima, existem limitações do aparelho de sanduíche floema. Uma vez que a camada de floema é fina, apenas pequenos organismos que normalmente permanecem no floema pode ser introduzido na sanduíche. Insetos maiores, como brocas de madeira (ou seja, Buprestid, espécies Cerambycid) pode ser introduzido e observados para as fases iniciais do seu ciclo de vida. Este prazo é geralmente limitada a dois paratrês semanas; após este ponto as larvas necessitam de madeira xilema para perfurar para pupação. Em contraste, para besouros, especialmente aqueles no gênero Ips, um ciclo de vida completo pode ser observado, inclusive acasalamento, eclosão dos ovos, alimentação, pupating e eclosão em um besouro adulto. Neste ponto, a viabilidade da sanduíche é normalmente esgotado devido à dessecação e crescimento de fungos. ²⁸ Além disso, este aparelho não permite a insectos livremente e colonizam naturalmente ou sair do floema sanduíche. ²⁷

Nosso protocolo é flexível em termos de tamanho, forma, e tipo de floema utilizado. Estudos curtos exigem menos material floema e tamanho sanduíche pode ser adaptado em conformidade. Muitas espécies de coníferas foram utilizados como doadores de floema em um sanduíche floema (por exemplo, ponderosa pine ^12, Douglas-fir ^2, abeto ^29, Pinus taeda ^27, longleaf pinho ^27). Materiais do sanduíche também pode ser alterada; para examplas, placas de vidro podem ser utilizados em vez de acrílico e epoxi ou fita, em vez de Parafilm.

A parte mais difícil deste protocolo é o processo de remoção do floema. Árvores ao lado da outra podem diferir em quão difícil seu floema é remover. Quando uma árvore tem floema difícil, paciência é fundamental. Nestes casos, executar cuidadosamente uma faca entre o xilema duro e floema esponjoso. Este processo se sente literalmente como esfola a árvore.

Depois de dominar a técnica básica sanduíche, alterações ao protocolo pode ajudar a necessidades específicas de ajuste. Por exemplo, por aperfeiçoar as técnicas necessárias para remover o floema, pedaços maiores podem ser removidos e usados ​​para criar sanduíches maiores. Além disso, alterações podem ser feitas para acomodar instrumentos específicos, por exemplo, furos adicionais para monitorar as emissões químicas (Fig. 3), ou gravar ou reproduzir sons (Fig. 3B). As modificações podem ser feitas para permitir a preservação de semi-permanente do floema e seu órgãoismos, ou para observações temporárias de organismos que podem mais tarde ser deixado livre.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Draw blade	Big Horn Brand	20265	11” blade
Fillet Knife	American Angler	30530	9” blade
Polycarbonate	Nexan	GE-33	0.093 in. thickness
Parafilm M	Fisher Scientific	S37441	2” wide
Clamps	Pony Jaw Opening	3201-HT-K	4” x 1”
Vacuum Sealer  and bags	FoodSaver	V2840; FSFSBF0742-015	VacLoc vacuum  bags in rolls