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Resumo

Um biossensor ótico sem rótulo para detecção de bactérias rápidas é introduzido. O biossensor é baseado num nanoestruturada de Si poroso, que se destina a captar directamente as células de bactérias alvo na sua superfície. Usamos os anticorpos monoclonais imobilizados, para o transdutor poroso, como as sondas de captura. Os nossos estudos demonstram a aplicabilidade destes biosensores para a detecção de concentrações baixas de bactérias dentro de minutos, sem processamento prévio da amostra (tal como a lise das células).

Resumo

Um biossensor óptico livre de rótulo com base em uma nanoestruturada Si poroso foi concebido para a captura rápida e detecção de bactérias de Escherichia coli K12, tal como um modelo de microorganismo. O biossensor se baseia em ligação directa das células das bactérias alvo na sua superfície, enquanto que nenhum pré-tratamento (por exemplo, através de lise celular), da amostra em estudo é necessário. Uma película fina mesoporoso Si é utilizada como o elemento de transdutor óptico do biossensor. Sob iluminação com luz branca, a camada porosa mostra bem resolvidas padrões de franjas de Fabry-Perot em seu espectro de reflectividade. Aplicando uma transformação rápida de Fourier (FFT) para reflectividade resultados dados em um único pico. As alterações na intensidade do pico da FFT são monitorados. Assim, as bactérias alvo capturar sobre a superfície do biossensor, através de interacções anticorpo-antigénio, induz alterações mensuráveis ​​na intensidade dos picos de FFT, que permitem uma observação "tempo real" de fixação das bactérias. nt "> O filme mesoporoso Si, fabricado por um processo de anodização electroquímica, é conjugado com anticorpos monoclonais, específicos para as bactérias alvo. A imobilização, imunoactividade e especificidade dos anticorpos são confirmadas por experiências de marcação fluorescentes. Assim que o biossensor é exposta ao bactérias alvo, as células são directamente capturado na superfície de Si poroso com a modificação de anticorpos. Estes eventos de captura específicas resultar em alterações de intensidade na película fina do espectro de interferência óptica do biossensor. Nós demonstramos que estes biossensores podem detectar concentrações relativamente baixas de bactérias (detecção limite de 10 4 células / mL) em menos de uma hora.

Introdução

Precoce e preciso de identificação de bactérias patogênicas é extremamente importante para a segurança alimentar e água, monitoramento ambiental, e de ponto-de-cuidados diagnósticos 1. Como técnicas de microbiologia tradicionais são demorados, trabalhoso, e não têm a capacidade de detectar microorganismos em "tempo real" ou fora do ambiente de laboratório, biossensores estão evoluindo para enfrentar esses desafios 2-5.

Nos últimos anos, o Si poroso (psi) tem emergido como uma plataforma promissora para o desenho de sensores e biossensores 6-20. Na última década, vários estudos sobre sensores e biossensores ópticos baseados em psi foram publicados 21,22. A camada nanoestruturado PSi normalmente é fabricado por ataque anódico eletroquímica de um único cristal de Si wafer. Os nanomateriais PSI resultantes exibem muitas características vantajosas, como grande superfície e volume livre, pore tamanhos que podem ser controlados e sintonizável optipropriedades cal 10,16. As propriedades ópticas da camada PSi, como fotoluminescência 8,11 e luz branca à base de reflectância interferometria 7,19, são fortemente influenciados pelas condições ambientais. Captura de hóspedes analitos moléculas / alvo dentro da camada porosa em resultados de uma mudança no índice de refracção médio do filme, observada como uma modulação em espectro de fotoluminescência, ou como um desvio de comprimento de onda no espectro de reflectividade 10.

Embora a grande inovação em tecnologia de biosensor óptico PSi, só há poucos relatos sobre plataformas baseadas em PSI para bactérias detecção 6,8,20,23-29. Além disso, a maioria desses estudos de prova de conceito demonstraram "indireta" de detecção de bactérias. Assim, em geral, antes de lise das células é necessário para extrair os fragmentos de proteína / ADN-alvo, característicos para as bactérias estudadas 29. Nossa abordagem é captar diretamente a bactéria alvocélulas para o biossensor psi. Portanto, os anticorpos monoclonais, que são específicos para alvejar as bactérias, são imobilizadas sobre a superfície porosa. A ligação de células de bactérias, através de interacções anticorpo-antigénio, para a superfície do biossensor induzir alterações na amplitude (intensidade) do espectro de reflectividade 24-26.

Neste trabalho, relatamos a construção de um biossensor à base de PSi óptica e demonstrar a sua aplicação como uma plataforma biosensing livre-label para a detecção de Escherichia coli (E. coli) bactérias K12 (usado como um modelo de microorganismos). The monitorados sinal óptica é a luz reflectida a partir da nanoestrutura PSi devido Fabry-Perot de interferência de película fina (Figura 1A). As alterações na amplitude de luz / intensidade são correlacionados para imobilização específica das células de bactérias alvo para a superfície do biossensor, permitindo a rápida detecção e quantificação das bactérias.

Protocolo

1. Preparação de Oxidado poroso SiO2

  1. Bolachas de Si (Etch único lado polido sobre o <100> rosto e fortemente dopado tipo p, 0,0008 Ω · cm) de uma solução 3:1 (v / v) de HF aquoso e de etanol absoluto durante 30 segundos a uma corrente constante densidade de 385 mA / cm 2. Por favor, note que a IC é um líquido altamente corrosivo e deve ser manuseado com cuidado extremo.
  2. Lavar a superfície do Si (psi) película porosa resultante com etanol absoluto várias vezes; secar as películas sob uma atmosfera de azoto seco.
  3. Oxidar as amostras recém-psi-gravados em um forno tubular a 800 ° C durante 1 h em ar ambiente (colocar a amostra no forno à temperatura ambiente, o calor do forno para 800 ° C, deixar no forno durante 1 hora, desligar o fornalha e retirar as amostras do forno apenas à temperatura ambiente).

2. Biofunctionalization de Psio 2 Andaimes

  1. Incubar uma PSi oxidada (PSiO 2) da amostra durante 1 hora em mercaptopropil (solução trimetoxi-3) 95% (MPTS) (108 mM em tolueno).
  2. Lavar o psio 2 amostra tratada com silano com tolueno, metanol e acetona, seco sob uma atmosfera de azoto seco.
  3. Incubar a amostra Psio 2 modificado com silano durante 30 min em 1 ml de solução de biotina 100 mM de PEO-iodoacetilo.
  4. Lavar o psio 2 amostra tratada com a biotina, com 0,1 (PBS) M de fosfato salina tamponada várias vezes.
  5. Incubar a amostra Psio 2 modificado com biotina durante 30 minutos em 1 ml de solução de 100 ug / ml de estreptavidina (SA).
  6. Lavar o tratado-SA Psio 2 amostra com 0,1 M PBS solução várias vezes.
  7. Incubar a SA-2 modificado Psio amostra resultante durante 30 min em 1 ml de 100 ug / ml E. biotinilado A solução de anticorpo monoclonal de E. coli (imunoglobulina G, IgG), ou com 100 ug / ml de IgG de coelho biotinilado (como um modelo para um anticorpo monoclonal).

3. Labeling fluorescentes e microscopia de fluorescência

  1. Incubar as superfícies de IgG modificadas com 15 ug / ml de fluoresceína (ITCF) marcado anti-IgG de coelho durante 40 min e com 15 ug / ml de fluoresceína (ITCF) marcado anti IgG de rato como controlo.
  2. Lavar as amostras modificadas com 0,1 M PBS solução várias vezes.
  3. Examine as amostras sob um microscópio de fluorescência.

4. Cultura de bactérias

  1. Cultive E. bactérias coli K12 em um tubo de 10 ml com 5 ml de Luria Bertani (LB) (composição do meio em 1 litro de água desionizada: 5 g de NaCl, 5 g de extracto de levedura e 10 g de triptona). Incubar as bactérias durante a noite com agitação a 37 ° C.
  2. Monitorar a concentração de bactérias através da leitura da densidade óptica (DO) a um comprimento de onda de 600 nm. Após crescimento durante a noite em meio LB, ler a DO600 utilizando um espectrofotómetro para determinar a concentração bacteriana. O número de células é extremactly proporcional para as medições de OD 600 (1 OD 600 = 10 8 células / ml).

5. Bactérias Sensing

  1. Coloque o psio IgG-2 modificado e limpo Psio 2 (como o controlo) em amostras de uma célula de fluxo feito por encomenda de Plexiglas. Fixar a célula de fluxo para assegurar que a reflectividade da amostra é medido no mesmo ponto durante todas as medições.
  2. Incubar as amostras com E. coli K12 suspensão (10 4 células / ml) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, remover a suspensão de bactérias através de lavagem da célula com 0.85% w / v de solução salina durante 30 minutos.
  3. Monitorar as mudanças nos dados de refletividade em todo o experimento. Todas as medições ópticas devem ser realizados num meio aquoso circundante. Espectros devem ser coletados por meio de um espectrômetro de CCD e analisadas aplicando transformada de Fourier rápida (FFT), como descrito anteriormente 25,26.
  4. Confirmar a presença da bactéria nasuperfície do biossensor, por observação das amostras sob um microscópio de luz vertical imediatamente após a experiência biosensing.

Resultados

PSi oxidada (psio 2) filmes são preparados como descrito na secção de texto protocolo. Figura 1B mostra uma alta resolução de micrografia electrónica de varrimento da película resultante PSi após a oxidação térmica. A camada Psio 2 é caracterizada por poros cilíndricos bem definidos, com um diâmetro na gama de 30-80 nm.

O anticorpo monoclonal (IgG) moléculas são enxertadas sobre as duas superfícies de psio, utilizando uma tec...

Discussão

Um imunossensor óptica livre de etiqueta, com base em um Psio 2 nanoestrutura (um filme fino de Fabry-Perot) é fabricada, e a sua aplicabilidade potencial como um biosensor para a detecção de bactérias é confirmada.

Modificações e solução de problemas

Uma das principais preocupações na concepção de um imunossensor é a susceptibilidade de anticorpos a sofrer alterações de conformação indesejáveis ​​durante a deposição e modelaçã...

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Fundação de Israel Ciência (concessão n º 1118-1108 e concessão n º 1146/12) e do Fundo de Investigação Kroll Memorial Minna. ES agradece o apoio financeiro do Instituto de Nanotecnologia Russell Berrie.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Si waferSiltronix Corp.Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%)Merck101513
Ethanol absoluteMerck818760
PBS buffer solution (pH 7.4)prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/vprepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS)Sigma Aldrich Chemicals175617
PEO-iodoacetyl biotinSigma Aldrich ChemicalsB2059
Streptavidin (SA)Jackson ImmunoResearch Labs Inc.016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidinJackson ImmunoResearch Labs Inc.016-010-084
Biotinylated-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.115-095-003
Biotinylated E. coli antibodyJackson ImmunoResearch Labs Inc.1007
E. coli (K-12)was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion

Referências

  1. Velusamy, V., et al. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).
  2. Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. . Food Microbiol.: Fundamentals and Front. 2, (2001).
  3. Radke, S. M., Alocilja, E. C. A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents. IEEE Sens. J. 5 (4), 744 (2005).
  4. Glynn, B., et al. Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety. Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126 (2006).
  5. Leonard, P., et al. Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water. Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3 (2003).
  6. Alvarez, S. D., et al. Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing. Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439 (2007).
  7. Archer, M., et al. Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection. Micro- and Nanosystems. 782, 385 (2004).
  8. Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities. J. Am. Chem. Soc. 123, 11797 (2001).
  9. Dancil, K. -. P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J., Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. . Development of a Porous Silicon Based Biosensor. 536, 557-562 (1999).
  10. D'Auria, S., et al. Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest. J Phys - Condens Matter. 18 (33), S2019 (2006).
  11. de Leon, S. B., et al. Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon. Appl Phys Lett. 84 (22), 4361 (2004).
  12. Janshoff, A., et al. Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing. J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108 (1998).
  13. Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity. Adv. Mater. 18, 1393 (2006).
  14. Pacholski, C., et al. Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636 (2005).
  15. Pacholski, C., et al. Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2. J. Am. Chem. Soc. 128, 4250 (2006).
  16. Sailor, M. J., Link, J. R. Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand. Chem. Comm. , 1375 (2005).
  17. Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species. Anal. Chem. 79 (1), 327 (2007).
  18. Schwartz, M. i. c. h. a. e. l. P., et al. The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells. Langmuir. 22, 7084 (2006).
  19. Stewart, M. P., Buriak, J. M. Chemical and biological applications of porous silicon technology. Adv. Mater. 12 (12), 859 (2000).
  20. Zhang, D., Alocilja, E. C. Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis. IEEE Sens J. 8 (5-6), 775 (2008).
  21. Bonanno, L. M., Segal, E. Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery. Nanomedicine. 6 (10), 1755 (2011).
  22. Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. Porous silicon biosensors on the advance. Trends Biotechnol. 27 (4), 230 (2009).
  23. Li, S., Huang, J., Cai, L. A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection. Nanotechnology. 22 (42), 425502 (2011).
  24. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E., Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. . Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research. 733, (2012).
  25. Massad-Ivanir, N., et al. Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via "Direct Cell Capture". Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).
  26. Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria. Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).
  27. Mathew, F. P., Alocilja, E. C. Porous silicon-based biosensor for pathogen detection. Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656 (2005).
  28. Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. . Frontiers in Surface Nanophotonics. 133, 49 (2007).
  29. Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors. Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).
  30. Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
  31. Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305 (1998).
  32. Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development. Sensors. 8 (8), 4669 (2008).
  33. Shtenberg, G., et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Anal. Chem. 85 (3), 1951 (2013).
  34. Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor. Langmuir. 23 (10), 5817 (2007).
  35. Banada, P. P., Bhunia, A. K., Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 567 (2008).
  36. Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S., Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. . Designing receptores for the next generation of biosensors. , 105 (2013).
  37. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples. Food Res. Int. 40 (7), 803 (2007).
  38. Dudak, F. C., Boyaci, I. H. Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Biotechn J. 4 (7), 1003 (2009).
  39. Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339 (2008).
  40. Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , 83 (2008).

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