Medição de cálcio total em neurônios por Electron Probe X-ray Microanálise

Resumo

Este artigo descreve a aplicação de microscopia eletrônica cryoanalytical para a medição quantitativa de teor de cálcio total e distribuição em resolução subcelular em espécimes biológicos fisiologicamente definidos.

Resumo

Neste artigo as ferramentas, técnicas e instrumentos adequados para medidas quantitativas de conteúdo elementar intracelular utilizando a técnica conhecida como microanálise eletrônica (EPMA) são descritos. Cálcio intramitocondrial é um foco especial por causa do papel crítico que a sobrecarga de cálcio mitocondrial desempenha nas doenças neurodegenerativas. O método baseia-se na análise de raios-X produzidos por um microscópio electrónico (EM) por interacção de um feixe de electrões com o espécime. A fim de manter a distribuição natural de elementos difusíveis em amostras de microscopia electrónica, EPMA requer "criofixação" de tecido, seguido pela preparação de criocortes ultrafinos. Congelamento rápido das células em cultura ou culturas organotípicas de fatias é realizada por imersão em etano líquido de congelação ou de congelação por bater contra um bloco de metal fria, respectivamente. Criosecções nominalmente 80 nm de espessura são cortadas seco, com uma faca de diamante em ca. -16076: C, montado no / grelhas de cobre revestidas com carbono pioloform, e cryotransferred num crio-EM usando um suporte cryospecimen especializado. Depois de inspecção visual e de mapeamento de localização no ≤ -160 ° C, e dose baixa de electrões, criocortes congeladas-hidratado são a -100 ° C durante ~ 30 min liofilizada. Imagens de nível Organelle de criosecções secos são registrados, também em baixas doses, por meio de uma câmera CCD-scan lento e regiões subcelulares de interesse selecionadas para análise. Raios-X emitidos por ROIs por um, focado, sonda de elétrons de alta intensidade estacionário são recolhidos por um raio-X de energia dispersiva (EDX) espectrômetro, processada pela eletrônica associados, e apresenta-se como um espectro de raios-X, ou seja, um lote de intensidade dos raios-X vs energia. O software adicional facilita: 1) identificação dos componentes elementares por suas "características" energias de pico e de impressões digitais e 2) análise quantitativa por extração de áreas de pico / fundo. Este artigo termina com dois exemplos que ilustram típicoAplicações EPMA, aquele em que a análise mitocondrial de cálcio fornecidos uma visão crítica sobre os mecanismos de lesão excitotoxic e outro que revelaram a base da resistência isquemia.

Introdução

Os íons de cálcio são, indiscutivelmente, a entidade sinalização celular mais importante e versátil em biologia, desempenhando um papel essencial nos processos normais tão diversas como a transmissão sináptica e expressão gênica. Por outro lado, o cálcio é igualmente importante na morte celular. Em particular, a desregulamentação de cálcio é um fator-chave na lesão neuronal no AVC, Parkinson, Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas ^3,5. Assim, é extremamente importante para entender quantitativamente como o cálcio é distribuído no interior das células, e como isso muda após estímulos fisiológicos ou fisiopatológicos. Este objectivo é complicada pelo facto de que o cálcio é distribuído de forma dinâmica entre dois estados físicos - livre em solução ou ligada a um substrato - e que as concentrações de cálcio celular mudar ao longo de várias ordens de grandeza, como consequência da estimulação.

Embora existam vários métodos avançados disponíveis para a análise de free de cálcio intracelular, a determinação das concentrações de cálcio total em compartimentos intracelulares definidos é realisticamente limitados a uma abordagem, isto é, electrões microanálise (EPMA). EPMA é uma técnica que os casais um espectrômetro de raios-X de um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). O canhão de elétrons TEM foca, uma sonda de elétrons submicron parado em uma região subcelular de interesse e os raios-X específicos do elemento emitidas como resultado do bombardeio de elétrons são coletados e analisados ​​(ver referências ^{7, 4} para análises técnicas detalhadas). Vantagens de EPMA incluem resolução de nível organela única e sensibilidade submillimolar. Na prática, no entanto, requer técnicas de criofixação EPMA especializados e instrumentação para a preparação e análise de amostras. Aqui, são descritas as ferramentas, técnicas e instrumentos adequados para a medição de cálcio intracelular utilizando EPMA. Cálcio intramitocondrial é de i especialnterest em conta o papel fundamental que mitocondriais execuções de sobrecarga de cálcio em doenças neurodegenerativas.

Protocolo

A abordagem descrita aqui foi desenvolvido utilizando instrumentos específicos, ferramentas e software. Porque laboratórios não vai usar a mesma configuração experimental da abordagem é generalizada sempre que possível.

1. Congelação rápida

O método analítico para ser descrito é absolutamente dependente abordagens criogénicos para: 1) o "criofixação" de células ou tecidos de uma maneira que preserva quantitativamente a distribuição dos componentes do tecido difusíveis e elementos químicos que foram em células vivas, no momento da congelação e 2) a preparação de ultrafinos criosecções adequado para imagem e análise de TEM. Estas técnicas são brevemente descritos aqui, mas os detalhes necessários para reproduzir estes procedimentos em outros laboratórios estão fora do escopo deste artigo. Os leitores interessados ​​são encaminhados para excelentes artigos recentes ^9,14.

Atenção: Esta seção descreve o uso de liquetano efied, que é altamente inflamável e explosiva; devem ser tomadas precauções apropriadas. O operador deve também estar familiarizado com nitrogênio líquido (LN ₂₎ as precauções de segurança, incluindo o revestimento protetor laboratório, óculos e luvas cryoresistant. Nota: Aqui e por toda parte, todas as ferramentas (fórceps, etc) usado para lidar com amostras congeladas devem ser pré-resfriada em LN ₂ antes do uso para evitar o descongelamento acidental.

Células cultivadas sobre lamínulas

1. Preparar um dispositivo de congelação por condensação de imersão etano gasoso a -160 ° C na cavidade central LN _{2-arrefecida.} Encha até a marca e cobrir o poço com a tampa giratória de alumínio quando não estiver em uso.
2. Usando cunhas de papel de filtro, borrão lamelas de plástico de células cultivadas sob experimentalmente condições adequadas a um filme aquoso fino. Seque a partir da borda, de modo a evitar tocar no tecido, o filme residual ideais, determinada por tentativa e erro, é tão fino quanto possível, mas não tão them como a evaporar e permitir a secagem da superfície do tecido.
3. Segurando a lamela pela borda com uma pinça de fixação, mergulhe rapidamente em etano líquido, manualmente ou usando o êmbolo movido a gravidade.
4. Coloque a lamela congelado em uma tigela de isopor nas proximidades de LN _2, grande o suficiente para manipular o número desejado de lamelas em recipientes de armazenamento de longo prazo. Latas com tampa de rosca de alumínio que não aproveitar sob LN ₂ são recomendados.

Congelação rápida de fatias cerebrais em cultura

5. Sob um microscópio de dissecação, ver e orientar uma fatia do hipocampo organotípica, imperturbável e ainda ligado à inserção da membrana cultura. Coloque pontos de referência sobre a membrana perto da borda da fatia com uma caneta de tipo Sharpie preto e fotografia.
6. Ainda sob o microscópio, cortar aprox. 5 x 5 milímetros quadrados de membrana com fatias individuais centradas nas praças. Evite tocar a fatia ou dobrar o membrane.
7. Montar uma fatia apoiado por uma membrana, amortecido por um ¼ de almofada agar diâmetro, em um disco de alumínio design personalizado feito para caber um cryoultramicrotome (descrito abaixo). Rapidamente congelar a fatia por pneumaticamente impulsionando-a contra um bloco de safira _LN-2 arrefecido por meio de um dispositivo personalizado "bater de congelamento".
8. Mover para armazenamento, tal como descrito para as células cultivadas.

2. Cryosectioning

Ressalva: produzir com sucesso fitas de corte seco de cortes ultrafinos, enquanto simples e lógico, requer treinamento, paciência e prática considerável.

1. Asse um cryoultramicrotome equipado com um cryoattachment e legal para -135 ° C.
2. Corte lamelas congelados em aprox. 3 x 3 quadrados mm usando uma afiada, bisturi pré-resfriada. Incorporar pedaços com culturas voltado para cima num líquido viscoso "cryoglue" (uma mistura de 01:06 de etanol e 2-propanol ^11), no padrão 3pinos de alumínio mm de diâmetro projetado para caber o chuck espécime micrótomo. Evite vazamento cryoglue na superfície da cultura. Solidificar cryoglue, baixando a temperatura para cryobox ≤ -160 ° C.
   • Para fatias de cérebro congelado, fixar firmemente os discos diretamente para um mandril espécime feito por medida por meio de um colar de parafuso.
3. Apare áreas selecionadas dos espécimes congelados - por exemplo, áreas ricas em células de peças lamela ou áreas identificadas fatias - a um aprox. 250 x 250 um bloco rosto e ~ 100 microns de dimensão usando uma ferramenta de diamante de corte.
4. Fitas seco de corte de secções finas em ca. -160 ° C utilizando um diamante cryoknife 35 °, essencialmente como descritos no referencs ^{4, 9.} Velocidade de corte e faca ângulo de folga são determinados empiricamente, um bom ponto de partida é 0,4-0,6 mm / s em 9 °. A espessura nominal, isto é, amostra de avanço, de secções hidratadas ié tipicamente de 80 nm, embora seções são realmente de 1,5 x 2,0 x mais grosso, principalmente devido à compressão. Para o corte satisfatório, um dispositivo anti-estática é essencial. Coloque a ponta de ionização do dispositivo 0,5-1 cm da borda de faca e ajustar a potência de saída até fitas satisfatórios de seções são produzidos.
5. Prepare sondas cílios colando (com epóxi) cílios para varas aplicador de madeira. Usando tal sonda, pegar e seções de transferência da parte de trás da faca Onto brilho descarregada, filmes de apoio pioloform revestido de carbono emitidos mais de 100 malha grades de cobre dobrar e descansam em um índio envelope meia folha dobrada em uma prateleira atrás de trabalho a faca. Dobre a metade superior da grade e envelope, pressione com uma ferramenta de prensagem a frio.
6. Transferência grades envolto a uma caixa de grade conveniente e guarde em uma lata de alumínio, tal como descrito no passo 1.4.

3. Cryotransfer de amostras para o microscópio eletrônico

O instrumento principal para EPMAneste laboratório é um microscópio eletrônico analítico operado a 120 kV e equipado para criomicroscopia, ou seja, concebido com um vácuo limpo, anticontaminator espécime-área, um de alta sensibilidade câmera digital 2k x 2k e suporte da amostra cryotransfer. Verifique com antecedência alinhamento microscópio e condições de operação em ambos os modos de baixa e de alta ampliação e confirmar um vácuo coluna satisfatório, o ideal é ≤ 10 ^-7 Torr. Sintonize-se, se necessário.

1. Confirme se o isolamento a vácuo do componente Dewar do cryoholder é satisfatória. Bomba como necessário.
2. Arrefecer o cryoholder à sua temperatura mínima, pelo menos -160 ° C, enquanto em alto vácuo dentro do estágio do microscópio; retire o cabo que liga o suporte à sua caixa de controle. Incline o goniômetro 45 ° no sentido horário antes de remover o suporte para minimizar LN ₂ derramando sobre superfícies de operador e de microscópio.
3. Prepare o cryoworkstation bancada pelo resfriamento do isolar integranted copo de ≤ 160 ° C.
4. Transfer (rapidamente!) o cryoholder resfriado de microscópio crio a estação de trabalho. Recolha geada escudo do titular.
5. Recuperar sob LN ₂ um sanduíche da rede de armazenamento e lugar na mesa de trabalho do cryoworkstation. Um anel de retenção de amostra bem do detentor também é colocada sobre a mesa.
6. Abra o envelope de índio e mover a grade dobrável fechada para o bem do espécime cryoholder. Fixe a grade com anel de retenção usando a ferramenta chave fornecida e fechar o escudo geada.
7. Remover rapidamente o cryoholder do cryoworkstation e inserir na câmara do microscópio e passar a seqüência de bombeamento, o mais rapidamente possível. Na inserção, deve haver uma interrupção mínima da coluna de vácuo.
8. Retornar goniômetro a 0 ° de inclinação. Volte a ligar e reenergizar a caixa de controle e verifique se a temperatura da amostra é ≤ 150 ° C.
9. Encher o Dewar dosuporte do espécime e permitir a vácuo e temperatura para se recuperar totalmente.

4. Levantamento Visual das Seções

1. Recolha o escudo geada do titular para expor amostra e ligar o feixe de elétrons.
2. Visualmente avaliar a amostra com pequeno aumento, normalmente 250X, e baixa iluminação. Tal como ilustrado na Figura 1, as secções deve ser fino e suave, não dobradas ou sobrepostas, liso e bem ligados à película de suporte, e, geralmente, não tapada por barras de grelha.
3. Opcionalmente fotografar seções selecionadas. (NOTA: Evite a exposição do feixe, desde cortes congelados hidratado são muito suscetíveis a danos induzidos por feixe.) Use o palco automatizado goniômetro digital para armazenar coordenadas de seções selecionadas.

5. Liofilização de Seções

1. Liofilizar secções, aumentando a temperatura até cerca de titular. -100 ° C durante ~ 30 min.
2. Recool titular a -160 ° C ou abaixo.
3. Antes de imagem, desligue unidade de controle cryoholder e cabo do controlador fisicamente desconexão para evitar imagem deriva devido a ciclos térmicos e / ou vibração pickup.

6. Imagens de células e organelas

Imagens estruturais das secções liofilizadas são obtidas em ca. -160 ° C como de baixa dose, imagens de perda de zero gravados digitalmente usando uma câmera CCD de varredura lenta 2k x 2k controlado por software apropriado.

1. Ative o EM no modo de oi-mag.
2. Escolha e imagem em ~ 2000 X (como TIFF, veja a Figura 2), as células selecionadas e áreas subcelulares de interesse nas seções de alta qualidade cujas localizações foram previamente gravadas e armazenadas. (NOTA: As seções secas são agora bem menos frágil e menos suscetíveis a danos por feixe de elétrons.
3. Avaliar as imagens a fim de selecionar as regiões de interesse (ROIs) para análise de raios-X. Este passo pode opcionalmente ser realizado fora de linha, no caso em que a EM pode ser transformadodesligado e a amostra deixada aquecer até à temperatura ambiente.

7. Aquisição de X-ray Spectra

Espectros de raios-X pode ser gravado usando qualquer um dos vários comerciais ou de design personalizado de raios-X sistemas de análise minimamente que consistem em um raio-X (EDX) detector de energia dispersiva, eletrônica pulso processadores associados e aquisição e exibição de software compatível. (O sistema utilizado neste laboratório é descrito na Tabela 1.)

1. Configurar o EM para a aquisição de raios-X por inserção do detector de EDX para a coluna (se necessário), retirando-se o objectivo da abertura, e a inserção de centragem e quaisquer aberturas de radiação parasita. Ajustar o cryoholder à temperatura mais baixa a que a contaminação geada da amostra é evitada, mas, pelo menos, abaixo de -100 ° C.
2. Incline o suporte de 20 ° em direção ao detector.
3. Sob condições de imagem de campo amplo, e assumindo que se pretende analisar a matriz de uma individual mitocôndrias, escolha uma mitocôndria para análise, movê-lo para o centro do campo e se concentrar.
4. Ir para o modo local (em alguns microscópios apenas convergir o feixe usando segundo foco do condensador) e aumentar a corrente de feixe até ca. 3 nA (como medido com um copo de Faraday ou semelhante) para um local de 100 nm.
5. Inicie o software de aquisição de espectro e começar a 100 aquisições segundo, que podem ser vistos tempo real no monitor de visualização. Guardar espectro registada (Figura 2). O formato EMSA padrão da indústria é o preferido.
6. Desligue o EM e transferir o arquivo (s) de múltiplos espectros para um (offline) workstation análise.

8. Análise de raios X Os espectros

A análise qualitativa

Um espectro de EDX (Figura 2, inserção) é, essencialmente, uma trama xy da intensidade dos raios-X versus a energia. Spectra conter informações qualitativas e quantitativas sobre a composição elementar de tele analisou o volume, em que a energia "característica" de um pico identifica o elemento que dá origem a esse pico, enquanto a intensidade reflete a quantidade desse elemento. Os picos característicos montar na parte superior de um fundo que varia lentamente, o "contínuo". (A legenda da Figura 2 discute mais detalhes salientes de espectros de EDX.) A energia de pico para os colectores de toda a tabela periódica são definidos pela estrutura electrónica bem conhecido dos elementos, assim, todas as ligações de software EDX para uma base de dados que identifica automaticamente os componentes de um analito. Em um contexto fisiológico, os elementos de interesse geral que estão bem adaptados à análise EDX incluem Na (K _α em 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) e Ca (3,69 keV).

1. Aproveite banco de dados de software disponíveis e rotinas de pico correspondentes para identificar os principais elementos nos espectros. Em uma amostra biológica esperar encontrar picos de Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca e. (ATENÇÃO:Os dois últimos elementos se sobrepõem!)

A análise quantitativa

A análise quantitativa do espectro de EDX consiste em extrair a área integrada dos picos identificados e converter este valor para uma concentração. Para análise biológica, a abordagem é estabelecido o método de pico / contínuo Municipal ^4,7,10, que tira partido do facto de que a intensidade do contínuo (definido acima e na Figura 2) é proporcional à massa seca do volume analisado . Assim, a relação da área de superfície / contínuo pico, quando em comparação com a mesma proporção em espectros de padrões de composição conhecida, especifica a concentração no compartimento celular alvo. Note-se que esta abordagem proporciona concentrações em unidades de moles por peso, geralmente expresso como mmol / kg de peso seco. Esta unidade é incomum e de interpretação podem exigir conversão adicional de, por exemplo, mmol / l de peso molhado ou mmol / mg proteína, como descrito elsewhere ^4,10.

2. Extrair as áreas de pico (e estimativas de erro) de elementos biológicos entre Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), isto é, Na, Mg, P, S, Cl, K e Ca, usando uma das rotinas de ajuste construído em software de análise (ver Tabela 1, especialmente a nota 4). Este laboratório usa Simplex ou múltipla dos mínimos quadrados montagem. Note-se que este ajuste requer muita atenção para resolver a sobreposição entre K e Ca picos (ver Figura 2).
3. Integrar o continuum entre 1,45-1,61 keV. Regiões alternativa livre de interferência podem ser usados.
4. Calcular os rácios de pico / contínuo e depois concentrações por comparação com padrões. Propagar erros durante toda a análise.
5. Use software e fórmulas estatística padrão para calcular as médias que refletem a variabilidade biológica.

Resultados

As células do cérebro tipicamente sustentar lesão excitotoxic como resultado da liberação de neurotransmissores patológico que ocorre em condições de isquemia. EPMA foi fundamental para descobrir como a capacidade das mitocôndrias neuronais de sequestrar grandes quantidades de cálcio subjacente ao mecanismo de lesão. A fotografia de microscopia electrónica na Figura 3 ilustra o aparecimento de mitocôndrias nos criocortes liofilizados de neurónios do hipocampo em cultura rapidamente congela...

Discussão

O método analítico baseado em microscópio electrónico aqui apresentada permite a detecção, identificação, quantificação e de vários elementos de interesse biológico, incluindo Na, K, P, e especialmente Ca. Estas análises podem ser realizadas em subcelular, por exemplo, intra-organelos, a resolução devido à possibilidade de localizar e identificar as estruturas de interesse nas imagens de criocortes preparados a partir de amostras rapidamente congelados de elevada qualidade. Note que nenhuma colo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)