Estabelecendo a Concentração Bactericidal Mínima de um Agente Antimicrobiano para Células Planktônicas (MBC-P) e Células Biofilm (MBC-B)

Resumo

Este protocolo permite uma comparação direta entre a resistência planctônica e biofilme para uma cepa bacteriana que pode formar um biofilme in vitro usando uma placa de microtismo de 96 poços. Bactérias planctônicas ou biofilmes são expostas a diluições seriais do agente antimicrobiano de escolha. A viabilidade é avaliada pelo crescimento em placas de ágar.

Resumo

Este protocolo permite uma comparação direta entre a resistência planctônica e biofilme para uma cepa bacteriana que pode formar um biofilme in vitro. Bactérias são inoculadas nos poços de uma placa de microtismo de 96 poços. No caso do ensaio plantônico, diluições seriais do agente antimicrobiano de escolha são adicionadas às suspensões bacterianas. No ensaio de biofilme, uma vez inoculado, as bactérias são deixadas para formar um biofilme durante um determinado período de tempo. Células nãoectadas são removidas dos poços, a mídia é reabastecida e diluições seriais do agente antimicrobiano de escolha são adicionadas. Após a exposição ao agente antimicrobiano, as células planctônicas são avaliadas para o crescimento. Para o ensaio de biofilme, a mídia é atualizada com mídia fresca sem o agente antimicrobiano e as células de biofilm são deixadas para se recuperar. A viabilidade da célula biofilm é avaliada após o período de recuperação. O MBC-P para o agente antimicrobiano é definido como a menor concentração de droga que mata as células na cultura planctônica.  Em contrapartida, o MBC-B para uma cepa é determinado expondo biofilmes pré-formados ao aumento das concentrações de agente antimicrobiano por 24 horas. O MBC-B é definido como a menor concentração de agente antimicrobiano que mata as células do biofilme.

Introdução

Ensaios de resistência a antibióticos foram inicialmente desenvolvidos para avaliar a resistência de culturas planctônicas (natação livre) de bactérias. Como muitas infecções bacterianas envolvem biofilmes (células ligadas à superfície), estávamos interessados em desenvolver um método para avaliar a resistência a antibióticos específicos do biofilme. No entanto, a maioria dos ensaios de resistência a antibióticos são pouco adequados para medir a resistência de biofilmes. Por exemplo, determinar a concentração inibitória mínima (MIC) é o padrão-ouro para determinar a resistência a antibióticos das culturas bacterianas planctônicas ¹. Este ensaio implica misturar uma cultura plantiônica diluída com uma série de diluição de antibióticos.  A concentração de antibiótico que inibe o crescimento visível das células planctônicas é o MIC. Uma vez que este ensaio se baseia na inibição do crescimento, por definição, ele não pode trabalhar com culturas de biofilme, o que requer examinar a sensibilidade antibiótico das células em um biofilme pré-cultivado. Em vez de medir a inibição do crescimento, o ensaio MBC-B descrito aqui determina a concentração de antibiótico que mata células já existentes em um biofilme. Assim, este ensaio visa imitar tratamentos antibióticos de infecções por biofilmes estabelecidas, e fornecer uma visão mais relevante da resistência a antibióticos bacterianos in vivo.

Uma vez que os biofilmes são geralmente mais resistentes a antibióticos do que as culturas planctônicas ^2-4, foi necessário elaborar um método que relaciona diretamente a resistência a antibióticos de um biofilme com o de uma cultura planctônica. Assim, outro objetivo deste método é ser capaz de comparar diretamente o nível de resistência a antibióticos entre células planctônicas e biofilmes. Os ensaios MBC-P e MBC-B descritos aqui tornam isso possível porque as células são cultivadas em condições semelhantes. Utilizamos este método para estudar vários genes que são importantes para a resistência a antibióticos específicas de biofilme ^5-8 .

Protocolo

1. MBC-B

1. Crescimento de um biofilme (adaptado de O'Toole⁹).
   1. Cresça uma cultura do tipo selvagem de interesse e tensão mutante por 16 horas em um meio rico a 37 °C.
   2. Diluir as culturas saturadas durante a noite 1:100 em meio fresco para ensaios de resistência a antibióticos. Um meio padrão para P. aeruginosa é m63 médio mínimo suplementado com sulfato de magnésio e arginina (ver Tabela 1). Este meio estimula a formação de um biofilme mais robusto.
   3. Adicione 100 μl da diluição por poço em um prato de microtiter de 96 poços (ver Tabela 1). Uma vez que esses ensaios são tipicamente realizados em triplicado para cada cepa, deve haver 24 poços de cada cepa.
   4. Incubar a placa de microtútmetro por 24 horas a 37 °C.
2. Expondo o biofilme pré-formado a um gradiente de concentração de antibiótico
   1. Prepare uma série de diluição de 10x de antibiótico para 7 poços. Exemplo: para a tobramicina antibiótico, as concentrações finais nos poços são 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 e 0,006 mg/ml ^5-8 . A partir de um estoque de 25 mg/ml, prepare diluições de 10x de 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 e 0,06 mg/ml. Deixe no gelo.
   2. Remova o supernatante gasto (contendo células planctônicas) usando uma pipeta multicanal (ver Tabela 1).
   3. Adicione 90 μl M63 (Mg/Arg) a todos os poços.
   4. Adicione 10 μl de cada concentração de antibiótico de 10x para alcançar as concentrações finais desejadas. Adicione 10 μl de água (sem controle de antibióticos) ao poço final para cada réplica e tensão.
   5. Incubar a placa de microtútmetro por 24 horas a 37 °C.
3. Refrescar a mídia e permitir o desprendimento de células vivas.
   1. Remova o supernatante gasto (contendo células planctônicas) usando uma pipeta multicanal.
   2. Adicione 115 μl M63 (Mg/Arg) a todos os poços.
   3. Incubar a placa de microtútmetro por 24 horas a 37 °C.
4. Ensaio para células vivas.
   1. Rotule duas placas de ágar LB por placa de microtiter de 96 poços.
   2. Esterilize o dispositivo multifaceto (ver Tabela 1) mergulhando as pontas em 100% etanol e passando as pontas através da chama aberta de um queimador de Bunsen. repetir. Deixe as pontas esfriarem ligeiramente. Usando o dispositivo multifacetado, transfira ~3 μl (quantidade que normalmente é retida nas pontas das pontas) da cultura planctônica de cada poço da placa de microtítmetro para a superfície de uma placa de ágar LB.
   3. Incubar as placas de ágar LB por 16 horas a 37 °C.
   4. Determine a concentração bactericida mínima do antibiótico identificando, por olho, o corte para o crescimento bacteriano(Figura 1).

2. MBC-P

1. Preparando cepas bacterianas
   1. Cresça uma cultura do tipo selvagem de interesse e tensão mutante por 16 horas em um meio rico a 37 °C.
   2. Diluir as culturas saturadas durante a noite 1:100 em meio fresco para ensaios de resistência a antibióticos. Um meio padrão para P. aeruginosa é m63 médio mínimo suplementado com sulfato de magnésio e arginina (ver Tabela 1).
   3. Adicione 90 μl da diluição por poço em um prato de microtiter de 96 poços (ver Tabela 1). Uma vez que esses ensaios são tipicamente realizados em triplicado para cada cepa, deve haver 24 poços de cada cepa.
2. Expondo células planctônicas a um gradiente de concentração de antibiótico
   1. Prepare a série de diluição de 10x de antibiótico para 7 poços. Exemplo: para a tobramicina antibiótico, as concentrações finais nos poços são 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 e 0,0005 mg/ml. A partir de um estoque de 25 mg/ml, prepare diluições de 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 e 0,005 mg/ml. Deixe no gelo.
   2. Adicione 10 μl de cada concentração de antibiótico de 10x para alcançar as concentrações finais desejadas. Adicione 10 μl de água (sem controle de antibióticos) ao poço final para cada réplica e tensão.
   3. Incubar a placa de microtútmetro por 24 horas a 37 °C.
3. Ensaio para células vivas.
   1. Rotule duas placas de ágar LB por placa de microtiter de 96 poços.
   2. Esterilize o dispositivo multifaceto (ver Tabela 1) mergulhando as pontas em 100% etanol e passando as pontas através da chama aberta de um queimador de Bunsen. repetir. Deixe as pontas esfriarem ligeiramente. Usando o dispositivo multifacetado, transfira ~3 μl (quantidade que normalmente é retida nas pontas das pontas) da cultura planctônica de cada poço da placa de microtítmetro para a superfície de uma placa de ágar LB.
   3. Incubar as placas de ágar LB por 16 horas a 37 °C.
   4. Determinar a concentração bactericida mínima do antibiótico identificando, por olho, o corte para o crescimento bacteriano(Figura 2).

Resultados

Foram realizados ensaios MBC-P e MBC-B, comparando a sensibilidade do tipo selvagem PA14 com o PA14 ∆ndvB. A tobramicina foi usada como antibiótico. São apresentados resultados correspondentes à etapa 1.4.4 (Figura 1) e à etapa 2.3.4 (Figura 2). PA14 e ∆ndvB foram inoculados nos ensaios MBC-P e MBC-B em triplicado. Após a conclusão das etapas 1.0-1.4 do protocolo MBC-B e as etapas 2.0-2.3 do protocolo MBC-P, as células viáveis foram emplacar em uma placa de ...

Discussão

A resistência a antibióticos em células planctônicas é definida como um aumento na concentração inibitória mínima (MIC) de um antibiótico devido a uma mudança permanente nas células (por exemplo, uma mutação). Os mecanismos de resistência ou tolerância específicas de biofilmes que foram identificados até hoje são o resultado da expressão de genes do tipo selvagem dentro de biofilmes. Assim, a definição clássica de resistência não se aplica a biofilmes. No entanto, outro conjunto de defin...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x M63			Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Tobramycin	Sigma		Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
96-well microtiter plates	Corning	3595	Sterile, flat-bottom, low evaporation
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-channel, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate