Glioma Xenoenxertos Ortotópicos Primários Recapitulam crescimento infiltrativo e isocitar mutação desidrogenase I

Resumo

Gliomas malignos constituem um grupo heterogêneo de neoplasias gliais altamente infiltrativas com características clínicas e moleculares distintas. Xenograftos ortotópicos primários recapitulam as características histopatológicas e moleculares de subtipos de glioma malignos em modelos animais pré-clínicos.

Resumo

Gliomas malignos constituem um grupo heterogêneo de neoplasias gliais altamente infiltrativas com características clínicas e moleculares distintas. Xenograftos ortotópicos primários recapitulam as características histopatológicas e moleculares de subtipos de glioma malignos em modelos animais pré-clínicos. Para modelar gliomas malignos de grau III e IV em ensaios de transplante, as células tumorais humanas são xenoengrafadas em um sítio ortotópico, o cérebro, de camundongos imunocomprometidos. Em contraste com os xenoenxertos secundários que utilizam células tumorais cultivadas, as células de glioma humano são dissociadas de espécimes ressecados e transplantadas sem passagem prévia na cultura tecidual para gerar xenoenxertos primários. O procedimento deste relatório detalha a preparação da amostra de tumores, transplante intracraniano em camundongos imunocomprometidos, monitoramento de enenxerção tumoral e colheita de tumores para posterior passagem em animais receptores ou análise. A preparação das células tumorais requer 2 horas e o procedimento cirúrgico requer 20 minutos/animal.

Introdução

Gliomas malignos são tumores gliais primários do sistema nervoso central que ocorrem no cérebro e ocasionalmente na medula espinhal. Os gliomas são classificados pela Organização Mundial da Saúde (OMS) de acordo com a semelhança histológica com astrócitos, oligodendrócitos ou células ependímicas e, em seguida, numericamente classificados (I a IV) para características patológicas da malignidade. Os subtipos histológicos mais comuns são astrocitomas, oligodendrogliomas e oligoastrocitomas mistos. Gliomas malignos que englobam os graus II a IV da OMS são caracterizados pelo crescimento invasivo e recalcitrância às terapias atuais. Todos os anos, nos Estados Unidos, cerca de 15.750 indivíduos são diagnosticados com glioma maligno e estima-se que 12.740 pacientes sucumbem a essa doença. Estas estatísticas destacam a natureza particularmente letal dos gliomas malignos e a importante necessidade de maior eficácia terapêutica.

Modelos de câncer são essenciais para investigar biologia tumoral e terapias. As linhas celulares cancerígenas humanas representam um importante primeiro passo para manipulações in vitro e estudos de xenoenxerto in vivo (xenoenxertos secundários)¹. No entanto, as culturas de células cancerígenas padrão sofrem transformação fenotípica e genotipada^2-4 que pode não ser restaurada em xenoenxertos secundários⁵. Além disso, alterações genéticas como mutações isocitadas de desidrogenase(IDH)⁶, populações distintas de células-tronco⁷ e dependência de caminhos-chave de sinalização⁸ podem ser perdidas nas culturas celulares cancerosas. Perfis genômicos podem ser mantidos em melhor medida na cultura da esfera do câncer, embora ainda não se espelhem totalmente o genótipo dos tumores primários^2,3. O transplante ortotópico direto nega as influências da cultura in vitro, fornece um microambiente adequado e preserva a integridade das células iniciantes do tumor^9,10. Portanto, os xenoenxertos primários representam um modelo pré-clínico poderoso e relevante para testar rigorosamente agentes-alvo para auxiliar no desenho racional de futuros ensaios clínicos^5,11,12.

Protocolo

1. Preparação da suspensão das células tumorais

Nota: As aprovações institucionais adequadas para o uso de material do paciente e animais são necessárias para estabelecer e manter xenoenxertos ortotópicos primários de glioma. No Vanderbilt University Medical Center, o material tumoral ressecado que é superior ao necessário para fins diagnósticos é coletado com o consentimento do paciente para um repositório de tecido de pesquisa. As amostras são rotuladas com um número de banco de dados REDcap de 5 dígitos randomizado e todos os identificadores específicos do paciente são removidos. O banco de dados REDcap contém dados clínicos desidentidos para cada amostra no repositório de tecidos que incluem sexo, idade (em anos), raça, estado de sobrevivência, patologia, tratamentos de câncer, ano de ressecção e tempo de progressão. Para manter a esterilidade e otimizar o sucesso do método xenerto primário, todos os reagentes, instrumentos cirúrgicos autoclavados a vapor e o local cirúrgico devem ser montados ou preparados com antecedência.

Nota: Os espécimes de glioma geralmente contêm grandes quantidades de mielina e detritos. Dependendo do tamanho da amostra, pode ser necessário usar mais de 4 tubos de gradiente descontínuos para a remoção adequada de mielina e detritos.

Nota: O processo é concluído quando não há, ou pouco, tecido claramente visível não distincionado restante. Evite a introdução de bolhas durante o processo de trituração.

Nota: A viabilidade celular após a dissociação é tipicamente >90%. Viabilidades mais baixas podem refletir muitas variáveis, incluindo manuseio de tecido subótimo ou tempo de transporte da sala de cirurgia, método de criopreservação ou técnica de dissociação de papain. Viabilidades celulares mais baixas ainda podem ser adequadas, no entanto, desde que um número suficiente de viável possa ser transplantado no volume apropriado. Para cada rato, 50.000-200.000 células viáveis são implantadas em volume de 2 μl. Devido à ponta chanfrada da agulha de seringa, deve-se incluir um adicional de 5 μl de suspensão celular no volume final para garantir que o material adequado possa ser arrastado para a seringa para cada injeção. Por exemplo, para injetar 2 μl/mouse para 5 ratos o volume final deve ser de 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl).

1. Coloque material de paciente recém-ressecado e desidentiado em um recipiente estéril e tampado no gelo para transporte ao laboratório. Processe a amostra diretamente para transplante ou criopreserve a amostra em nitrogênio líquido (veja abaixo) para armazenamento em nitrogênio líquido e posterior utilização.
2. Prepare as soluções de dissociação papain (solução papain, solução inibidora de lavagem/protease e solução gradiente descontínua) em uma capa estéril com os componentes do kit e instruções fornecidas pelo fabricante. Rotule tubos cônicos de poliestireno estéreis de 15 ml e distribua as soluções da seguinte forma:
   • Tubo 1: 5 ml de solução papain
   • Tubo 2: 3 ml de solução inibidora de lavagem/protease
   • Tubos 3-6: 5 ml cada uma da solução gradiente descontínua
3. Coloque a amostra de glioma no tubo 1 com 5 ml de solução de papain e triturate com uma pipeta de 5 ml durante um período de tempo de 10-20 min.
4. Pipeta o material para cima e para baixo 10 vezes e, em seguida, incubar o material por 2-3 minutos à temperatura ambiente antes de iniciar o próximo ciclo de trituração.
5. Posicione a ponta da pipeta de 5 ml mais perto da parte inferior do tubo cônico a cada ciclo de trituração de tal forma que a ponta esteja tocando a parte inferior do tubo para os últimos 2 ciclos.
6. Centrifugar a 300 x g por 5 min a temperatura ambiente. Remova o supernatante e pipeta a pelota para cima e para baixo 10x em 3 ml da solução inibidora de lavagem/protease.
7. Camada cuidadosamente um volume igual da suspensão sobre cada uma das soluções de gradiente descontínuo de 5 ml (tubos 3-6), com um conjunto de pipettor na velocidade de dispensação "gravidade".
8. Coloque os tubos em uma centrífuga equipada com um rotor de balde balançando, com a velocidade de aceleração reduzida ao ajuste mais baixo e o freio desligado. Centrifugar a 76 x g por 12 min a temperatura ambiente. Com o freio desligado, a centrifugação é geralmente concluída após 20 minutos.
9. Remova o supernaspetivo, resuspend e combine cada pelota em 5 ml de solução de sal estéril e balanceada e coloque as células no gelo.
10. Remova uma porção (10-100 μl) da suspensão celular e determine a densidade de células viáveis por exclusão azul trypan com um hemócito.
11. Centrifugar a 300 x g por 5 min. Remova o supernasce e resuspense a pelota celular a uma densidade de 25.000-125.000 células viáveis por μl.
12. Transfira um volume adequado da suspensão celular para um tubo de microcentrifuge de 200 μl (tubo PCR) e coloque no gelo.

2. Preparação de Local Cirúrgico e Instrumentos

Nota: Luvas cirúrgicas estéreis são usadas durante o procedimento. Dependendo dos requisitos de cada instituição, podem ser necessários vestidos cirúrgicos, bonés e protetores faciais.

1. Prepare um banco desinfetado para cirurgia de roedores com áreas adjacentes separadas para preparação animal, campo de operação e recuperação animal.
2. Esterilize instrumentos cirúrgicos em uma autoclave a vapor. Posteriormente, use um esterilizador de contas quentes para esterilizar instrumentos de flash ao fazer a transição de um animal sujeito para o outro.

3. Indução, Anestesia e Analgesia

Nota: Cirurgias superiores a 15 minutos a partir do momento em que os camundongos são anestesiados requerem uma fonte de calor de contato. Para prevenir hipotermia, os camundongos recebem uma fonte de calor (manta de água quente circulante) durante os períodos pré e pós-operatório.

1. Prepare o coquetel de cetamina/xilazina para anestesia por indução, de modo que cada rato receba cetamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg injetando 10 μl do coquetel por grama de peso corporal.
2. Mesa 1. Coquetel de anestesia.

   	Concentração de estoque	Volume para se preparar
   		um rato	cinco ratos	dez ratos
   Cetamina	100 mg/ml	25 μl	125 μl	250 μl
   Xylazine	100 mg/ml	2,5 μl	12,5 μl	25 μl
   Soro fisiológico isotônico		223 μl	1.113 μl	2.225 μl
   total		250 ul	1.250 μl	2.500 μl

3. Prepare a solução de cetoprofeno para analgesia diluindo a solução de estoque (10 mg/ml) 1:20 em água estéril e sem pyogen, de modo que cada rato receba uma dose de 5 mg/kg injetando 10 μl da solução por grama de peso corporal.
4. Pesar e registrar peso pré-cirúrgico. Os pesos individuais do mouse variam, mas geralmente variam de 18 a 22 g.
5. Injete 10 μl do coquetel de cetamina/xilazina por grama de peso corporal do rato no espaço intraperitoneal com uma seringa de insulina. Por exemplo, injete 200 μl para um mouse de 20 g.
6. Determine se o mouse está totalmente anestesiado pela pitada do dedo do pé da perna traseira. Geralmente leva 3-5 minutos para o mouse não se retirar mais da pitada.
7. Injete 10 μl da solução de cetoprofeno por grama de peso corporal do rato subcutâneamente na pele solta do flanco com uma seringa de insulina. Por exemplo, injete 200 μl para um mouse de 20 g.
8. Raspe o cabelo sobre o crânio com cortadores, esfregue o couro cabeludo exposto com povidone-iodo usando um aplicador de ponta de algodão e, em seguida, limpe uma almofada de álcool. Repita estes passos, esfregão povidone-iodo e álcool wipe, mais duas vezes.
9. Aplique pomada oftálmica aos olhos do mouse.
10. Faça uma incisão de 1 cm de linha média estendendo-se de trás das orelhas para apenas na frente dos olhos com uma lâmina de bisturi estéril.
11. Coloque o mouse sob um escopo de dissecação e exponha o crânio para identificar as linhas de sutura. Utilizando movimentos circulares com uma broca, centralizar um orifício de rebarba 2,5 mm lateral para o bregma e 1 mm posterior à sutura coronal.

4. Transplante intracraniano

Nota: Volumes de injeção superiores a 2,5 μl podem ser letais para ratos.

1. Posicione o mouse sobre uma estrutura estereotática, enganchando os incisivos superiores sobre a barra do incisivo e aplicando o grampo do nariz para que o crânio fique firmemente preso em uma posição neutra.
2. Desenhe 5-10 μl das células em um tubo de microcentrífuga para cima e para baixo várias vezes em uma seringa Hamilton de 10 μl presa no suporte da sonda do manipulador estereotático para misturar a suspensão e eliminar bolhas. Pressione o êmbolo para que a seringa esteja carregada com 2 μl (o volume adequado para injetar um animal).
3. Puxe a borda lateral da incisão da pele para expor o orifício da rebarba e, com o micromanipulador, introduza a agulha no orifício da rebarba para que a porção chanfrada fique logo abaixo da superfície do crânio.
   1. Avance a agulha 3 mm e, em seguida, retire a agulha 0,5 mm para criar um espaço para injeção.
   2. Avance o êmbolo lentamente por mais de 30 segundos e, em seguida, deixe a agulha permanecer no cérebro por mais 2 minutos. Retire a agulha gradualmente subindo 0,5 mm e esperando por mais 30 segundos antes de remover a agulha do cérebro.
4. Remova o mouse da estrutura estereotática e feche a ferida com um clipe automático.
5. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal e monitore continuamente o padrão de respiração e cor das membranas mucosas e tecidos expostos (solas dos pés).
6. Coloque o rato em uma gaiola microisoladora estéril uma vez que ele se recupere totalmente da anestesia (sternal e ambulatorial), e devolva-o ao centro de habitação animal.

5. Cuidados e Observação Animal pós-implantação

Nota: A indicação mais confiável de enenxerção tumoral e crescimento infiltrado é a perda gradual e sustentada de peso acompanhada pelo desenvolvimento de postura curvada e revestimento de cabelo áspero. Em raras ocasiões, são observados déficits neurológicos que incluem ataxia, paresis e convulsões. Xenoenxertos primários ortotópicos são altamente invasivos e se desenvolvem por um longo período de tempo. Camundongos normalmente manifestam sintomas de crescimento do tumor 3-6 meses após o transplante.

1. Observe camundongos com xenoenxertos ortotópicos diariamente para ingestão de alimentos e água, comportamento, aliciamento e sinais de infecção no local da incisão.
2. Administrar cetoprofeno (5 mg/kg subcutâneamente, 1-2x por dia) se a dor ou a angústia for observada no pós-operatório.
3. Remova os clipes automáticos 8-10 dias após a cirurgia.
4. Pese ratos semanalmente.
5. Monitore sinais e sintomas de enxerto tumoral.

6. Colheita de tumores

Nota: Por este método, a primeira fatia coronal (#1) contém o aspecto posterior das lâmpadas olfativas e o aspecto anterior dos lóbulos frontais. O tumor engrafado é mais abundante no hemisfério direito das 3 fatias coronais subsequentes (#2 fatias, #3 e #4) e a visão de injeção está rotineiramente contida em #3 de fatia coronal. Dependendo das necessidades experimentais, o material pode ser usado para passagem de tumor, seções de tecido congelado, seções de tecido incorporado parafina fixa formalina, citometria de fluxo de tecido dissociado, cultura celular ou lises para análise de DNA, RNA ou proteína. Porções do tumor podem ser criopreservadas para necessidades futuras com viabilidade celular variando de 80 a 95%.

1. Eutanize camundongos por exposição prolongada ao dióxido de carbono seguido de luxação cervical.
2. Decapitar camundongos eutanizados na base do cérebro (nível magnum forame) com um par maior de tesoura cirúrgica, e puxar a pele da incisão para a frente para expor totalmente o crânio.
3. Remova o cérebro.
   1. Insira uma ponta de uma tesoura cirúrgica fina no aspecto lateral do foramen magnum ao nível da carne auditiva externa externa esquerda para cortar o osso occipital ao longo do lado esquerdo do crânio. Faça o mesmo corte no lado direito.
   2. Corte o osso occipital ao longo de um plano coronal de um meatus auditivo externo para o outro e remova o osso para expor o cerebelo.
   3. Corte as placas ósseas nasais entre os olhos.
   4. Corte a sutura sagital cortando posteriormente ao longo da sutura sagital das placas ósseas nasais para o bregma. Complete a incisão midline ao longo da sutura sagital cortando anteriormente da lambda para o bregma.
   5. Insira cuidadosamente a ponta de um belo par de fórceps ao longo da abertura sagital de cada lado para rasgar qualquer aderência dural do crânio ao cérebro e, em seguida, descascar as duas metades do crânio lateralmente para expor o cérebro e lâmpadas olfativas dorsalmente.
   6. Deslize as fórceps entre o aspecto ventral das lâmpadas olfativas e o crânio para liberar quaisquer aderências.
   7. Incline o crânio para trás para permitir que o cérebro seja retraído para que a óptica e outros nervos cranianos sejam expostos. Corte os nervos cranianos para liberar o cérebro em um prato contendo PBS estéril.
4. Transfira o cérebro com uma espátula de pesagem para um cortador de matriz e gere fatias coronais de 2 mm com lâminas de barbear.
5. Disponha as fatias coronais em um prato contendo PBS estéril para maior inspeção visual e processamento de tecidos.

7. Criopreservação tumoral

1. Prepare uma solução de estoque de meio criopreservador.
   1. Adicione 50 ml de suplemento de proliferação, 5 ml de solução de penicilina e estreptomicina de 100x e 450 μl de heparina de 0,2% a 450 ml de meio basal.
   2. Armazene a solução de estoque a 4 °C protegida contra a luz.
2. Prepare uma solução de trabalho do meio criopreservador.
   1. Combine 47,5 ml de criopreservação média e 2,5 ml de DMSO estéril em um tubo cônico de polipropileno de 50 ml e misture bem.
   2. Alíquota de 1,0 ml de solução de trabalho para cada criovial e armazenar a 4 °C protegido da luz.
3. Coloque uma fatia coronal de 2 mm de cérebro xenoenxerado em um criovial contendo meio criopreservador no gelo.
4. Tampe firmemente o frasco e coloque-o em um recipiente de congelamento a -80 °C. Transfira o criovial no dia seguinte para um tanque de nitrogênio líquido para maior armazenamento.

Resultados

Células de glioma dissociadas são transplantadas diretamente no cérebro de camundongos imunocomprometidos para obter linhas ortotópicas primárias de xenoenxerto. Cada amostra tumoral recebe um número randomizado antes do transplante, como parte do processo de desidentificação para remover informações de saúde protegidas. Usamos um número de banco de dados REDcap de 5 dígitos para este fim. A Figura 1 ilustra o processo e a nomenclatura para estabelecer uma linha de xenoenxerto a partir de um...

Discussão

Linhas celulares cultivadas, xenoenxertos e camundongos geneticamente modificados são os métodos mais comuns para modelar gliomas, e há benefícios e limitações distintas para cada sistema modelo^3,13,14. Os benefícios relevantes dos xenoenxertos ortotópicos primários incluem o crescimento infiltrado que tipifica gliomas difusos e a retenção de alterações genéticas e mecanismos de sinalização importantes que podem ser extremamente difíceis de manter em células de glioma cultivadas. Por exemplo,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040-133
Papain dissociation system	Worthington Biochemical Corp.	LK003150
Trypan blue solution 0.4%	Life Technologies	15250061
Ketamine HCl	Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company
Xylazine HCl
Ketoprofen
Ophthalmic ointment
Povidone-iodine	Fisher Scientific	190061617
Cryopreservation medium and proliferation supplement	StemCell Technologies	05751
0.2% Heparin sodium salt in PBS	StemCell Technologies	07980
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D6250-5X10ML
NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice	The Jackson Laboratory	005557	NSG mice
Anti-human vimentin antibody	Dako	M7020	Use 1:200 to 1:800
Anti-human IDH1 R132H antibody	Dianova	DIA-H09	Use 1:100 to 1:400
Centrifuge with swinging bucket rotor
Pipetter with dispensing speed control
Disposable hemocytometer	Fisher Scientific	22-600-100
Sterile surgical gloves	Fisher Scientific	11-388128
Disposable gown	Fisher Scientific	18-567
Surgical mask	Fisher Scientific	19-120-1256
Tuberculin syringe	BD	305620
Alcohol pads	Fisher Scientific	22-246-073
Portable electronic scale	Fisher Scientific	01-919-33
Zoom stereomicroscope
Surgical clipper	Stoelting	51465
Scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blades, #10
Stereotaxic instrument	Stoelting	51730
High-speed drill	Stoelting	51449
Drill bit, 0.6 mm	Stoelting	514552
Hamilton syringe	Hamilton	80336
Autoclip, 9 mm	BD	427630
Circulating water warming pad	Kent Scientific	TP-700 TP-1215EA
Hot bead dry sterilizer	Kent Scientific	INS300850
Surgical scissors	Fine Science Tools	14101-14
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11
Spring scissors	Fine Science Tools	15018-10
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-30
Semimicro spatulas	Fisher Scientific	14374
Mouse brain slicer matrix	Zivic Instruments	BSMAS002-1
Cryogenic storage vials	Fisher Scientific	12-567-501