Contextual e Cued Medo Condicionado Teste Usando um sistema de análise de vídeo em Ratos

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo para um teste de condicionamento do medo contextual e cued usando um sistema de vídeo de análise para avaliar o medo de aprendizagem e memória em camundongos.

Resumo

O teste de condicionamento do medo contextual e cued é um dos testes comportamentais, que avalia a capacidade dos ratos para aprender e lembrar uma associação entre estímulos ambientais e experiências aversivas. Neste teste, os ratos são colocados numa câmara de condicionamento e são dadas as aparas de um estímulo condicionado (de um sinal sonoro) e um estímulo não condicionado aversivo (um choque nas patas eléctrica). Depois de um tempo de atraso, os ratinhos são expostos à mesma câmara de condicionamento e uma câmara com uma forma diferente de apresentação do sinal sonoro. Congelamento comportamento durante o ensaio é medido como um índice de memória medo. Para analisar o comportamento automaticamente, desenvolvemos um sistema de análise de vídeo usando o programa de software aplicativo ImageFZ, que está disponível como um download gratuito em http://www.mouse-phenotype.org/. Aqui, para mostrar os detalhes do nosso protocolo, demonstramos o nosso procedimento para o contextual e cued teste medo condicionado em ratos C57BL/6J usando o sist ImageFZem. Além disso, nós validado nosso protocolo e o desempenho do sistema de vídeo de análise por meio da comparação do tempo de congelação medido pelo sistema ImageFZ ou um sistema de medição de computador baseado em photobeam com que marcado por um observador humano. Como mostrado nos resultados representativos, os dados obtidos por ImageFZ foram semelhantes aos analisados ​​por um observador humano, indicando que a análise comportamental usando o sistema ImageFZ é altamente fiável. O artigo filme presente fornece informações detalhadas sobre os procedimentos de teste e irá promover a compreensão da situação experimental.

Introdução

O teste de condicionamento do medo contextual e cued é o paradigma comportamental utilizado para avaliar medo associativa aprendizagem e memória em roedores ^1-3. Este teste tem sido amplamente utilizada para compreender os mecanismos neurobiológicos da aprendizagem medo e memória em camundongos transgênicos e knockout ^1,4-16. Comportamento de congelamento, que é definida como a imobilidade completa, com a exceção da respiração, é uma resposta comum a situações de medo. Neste paradigma comportamental, depois de animais são expostos a um emparelhamento de um sinal sonoro com uma footshock elétrica, eles respondem ao estímulo de produção de medo, mostrando o comportamento de congelamento, que é medido como um índice de aprendizagem medo associativa e memória. Este teste requer equipamentos menos elaborado, menos esforço físico pelo investigador, e muito menos tempo de treinamento para os ratos do que outras tarefas de aprendizagem e memória, que geralmente requer cerca de 5-10 min / dia por rato durante 2 dias. Embora o procedimento de teste é simple e requer pouco tempo para realizar, o investigador deve cuidadosamente observar e medir o comportamento do mouse e, portanto, vários sistemas automáticos de medição foram desenvolvidos para realizar a análise comportamental ^17-20. Nosso sistema de vídeo-análise, que foi desenvolvido com o programa de software ImageFZ, nos permite analisar facilmente o comportamento de congelamento e produzir resultados altamente confiáveis. Este artigo fornece informações detalhadas sobre o nosso procedimento de teste e descreve como usar o programa de software ImageFZ.

Protocolo

Todos os experimentos devem ser realizados de acordo com a orientação e protocolos estabelecidos pelos Comitês locais de Cuidados e Uso de Animais.

1. Aparelho de ajuste

1. O aparelho para o teste de condicionamento e de contexto é uma câmara quadrada com um piso de grade electrifiable, uma fonte de som e um gerador de choque calibrado. Vários tamanhos de câmara são utilizados, com dimensões que variam de 54 centímetros x 27 cm x 30 cm ²¹ a 25 cm x 35 cm x 30 cm ^22. Neste protocolo, o aparelho é composto por uma câmara de acrílico quadrado (33 cm x 25 cm x 28 cm; transparente nas paredes frontais e traseiros; branca nas paredes laterais) com grades de metal (0,2 cm de diâmetro, com espaçamento de 0,5 centímetros de intervalo) coberto por uma tampa de acrílico transparente (Figura 1A). É necessário colocar a câmara em um chão de acrílico branco (Figura 1B) para analisar o comportamento de ratos marrons pretos, cutia, ou diluir porque um sistema de análise de imagem com o Iprograma mageFZ software (disponível para download gratuito, consulte a Tabela de materiais / reagentes) distingue um objeto escuro de um fundo branco de cada imagem de vídeo capturado em. Camundongos albinos também pode ser testado usando grades de black metal e um chão de acrílico preto (Figura 1B). Diodo emissor de luz (LED) luzes estão ligados ao teto acima do aparelho. O piso de grade é iluminado com 100 lux pelas luzes LED. Um altifalante ligado a um gerador de ruído / tom de branco (Figura 1C) está montado sobre um tecto de 5 cm acima da tampa apresentar um sinal sonoro (um ruído branco, 55 dB) como um estímulo condicionado (CS). As grades são ligados a um gerador de choque (Figura 1C) para entregar um choque nas patas elétrico como o estímulo incondicionado (EUA). A câmara de ensaio é colocado em uma sala à prova de som (170 cm x 210 cm x 200 cm) (Figura 1D) para minimizar o ruído externo durante os testes. Esta condição é também impede que os ratinhos que não estão actualmente a ser submetidas a umteste de ouvir um sinal sonoro ou a vocalização dos ratos de teste.
2. O aparelho para o teste com pistas é composto por uma câmara que tem propriedades diferentes das da câmara de condicionamento, proporcionando um novo contexto. É imperativo para alterar as pistas sensoriais, tanto quanto possível, de modo que o mouse percebe o romance contexto como sendo relacionado para a câmara de condicionamento. Geralmente, a forma de caixa de forma diferente ou uma câmara triangular é utilizado. Além disso, os diferentes sinais de iluminação e / ou olfactivas são também fornecidos para o rato. Neste protocolo, o aparelho é uma câmara triangular acrílica (33 cm x 29 centímetros x 32 cm; brancos em cada parede lateral) com um chão branco liso para os ratos marrons pretos, cutia, ou diluir ou, um piso preto liso para albino ratinhos, coberto com uma tampa de acrílico transparente (Figura 1E). Luzes LED estão ligados ao teto acima do aparelho. O nível de iluminação da pista é de 30 lux. Um alto-falante é montado no teto 5 cm acima da tampa para present de um sinal sonoro que é a mesma que a fornecida aos murganhos no momento do condicionamento. A câmara triangular está localizado num quarto à prova de som diferente do quarto no qual o condicionamento e teste contexto são realizadas.
3. Cada câmara está equipada com uma carga a partir do tecto Coupled Device (CCD) da câmera ligada a um computador Windows via divisor quad vídeo e USB dispositivo de captura de imagem para monitorar o comportamento do mouse, e as imagens do aparelho eo mouse são capturados e analisados ​​pelo programa ImageFZ software de aplicação (ver Protocolo 6). Os geradores de ruído branco e footshock são controladas automaticamente pelo programa de software ImageFZ, o tempo de início e duração do ruído branco e footshock deve ser escrito em um arquivo de texto (ver um arquivo de texto de exemplo "simples-cond 'mostrado no vídeo para o detalhes sobre como os parâmetros são escritos no arquivo), que é lido no aplicativo.
4. Antes de cada teste começa, as paredes de acrílicoe os pisos são limpas com uma toalha embebida em água hipocloroso super (pH 6-7), e as grelhas são limpas com etanol a 70% para evitar um desvio com base em estímulos olfactivos. As grades são eliminados com etanol em vez de água hipocloroso super-para garantir que as grades não diminuem a sua condutividade elétrica devido à ferrugem.

2. Preparação animal

1. Geralmente, 2-4 ratinhos são alojados por gaiola numa sala de espera, com temperatura controlada (23 ± 2 ° C) com um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz (por exemplo, luzes acesas às 07:00).
2. Neste protocolo, a reduzir possíveis influências de transporte gaiola sobre o comportamento e adaptar os ratos para o ambiente experimental, as gaiolas contendo os ratos são transferidos de sala de espera do animal em uma sala de espera à prova de som ao lado de uma sala à prova de som teste pelo menos 30 min antes de cada teste começa.
3. Todas as experiências (Figura 2A) deve ser realizado durante as speríodo de tempo ame à luz ou fase escura cada dia para minimizar as variações de comportamento produzidos por meio de testes em diferentes momentos ^23,24. Neste protocolo, todas as experiências são realizadas entre 1 hora após o início da fase de luz e 1 hora antes do início da fase de escuro (08h00-18:00 na fase de luz). Se apenas um aparelho está disponível, os ratos de cada genótipo deve ser testado em uma ordem de contrapeso para reduzir os efeitos potenciais do tempo experimental ea ordem testes de assuntos sobre o desempenho comportamental. ImageFZ pode controlar um máximo de quatro aparelhos. Testando 4 ratos simultaneamente, utilizando quatro aparelhos em uma ordem de contrapeso permite ao pesquisador para economizar tempo e reduz os possíveis efeitos dos parâmetros experimentais sobre o comportamento do mouse.

3. Condicionamento

1. Os ratinhos são colocados na câmara de condicionamento, e os ratinhos são tipicamente deixada a explorar livremente na câmara, durante 120 segundos. Depois disso, o aucue ditory, como um ruído branco, tom e clicker auditiva, é apresentado como um CS por 30 segundos, e uma mA footshock 0,1-0,8 é dada aos camundongos como EUA durante os últimos 2 segundos do som. A apresentação do emparelhamento CS-US é repetido para reforçar a associação. Os ratos são deixados na câmara durante um período de tempo após a última apresentação para estabelecer adicionalmente a associação entre o contexto da câmara e a experiência aversivo. Neste protocolo, após 120 segundos de exploração livre, um sinal sonoro (ruído branco, 55 dB) é apresentado por 30 segundos, e um choque nas patas de 0,3 mA é entregue de forma contínua durante os últimos 2 segundos do ruído branco. Após 90 segundos, o emparelhamento do sinal sonoro com o choque nas patas é dada aos assuntos de novo. A apresentação de CS-US repete três vezes por sessão (120, 240 e 360 segundos após o início do condicionamento) (Figura 2B). Seguindo o choque nas patas final, os ratos são deixados sem perturbação nas câmaras de 90 seg.
2. Antes da sessão condicionado começa, execute o programa de software aplicativo ImageFZ, selecione o menu plug-in 'FZ Condicionado e FZ Online (4 câmaras)', e definir os valores dos parâmetros passo-a-passo a seguir.
   1. Passo 1: Código do Projeto. Especifique uma pasta onde você deseja armazenar seus arquivos de dados.
   2. Passo 2: Nome da sessão. Digite qualquer palavra, por exemplo, a data experimental, na caixa 'Sessão', e selecione um arquivo de texto de referência em que o tempo de início e duração do ruído branco e footshock são escritas, na caixa 'Referência'. Um arquivo de texto de exemplo é mostrado no vídeo.
   3. Passo 3: Definições dos parâmetros. Digite os valores dos parâmetros em cada caixa da seguinte forma.
      1. Taxa (frame / sec): taxa de quadros de aquisição de imagem, por exemplo, um quadro / seg.
      2. Duração (segundos): no caso de condicionamento, a duração total é de 480 seg.
      3. Duração bin (s): por exemplo, 60 seg; os dados são analisados ​​em cada um dos blocosde 60 seg.
      4. Tamanho Assunto - min (pixels): ImageFZ detecta um mouse e ruído como partículas pretas (alguns em massa de pixels) em um fundo branco em cada imagem. Quando a área da partícula preto (pixels) é menor do que o 'tamanho Objecto - min (pixels)' valor (por exemplo, 100 pixels), as partículas são consideradas como ruído e são excluídos da análise de imagem.
      5. Tamanho Objecto - max (pixels): quando os tamanhos das partículas negras são mais do que o tamanho do "tamanho do Objecto - max (pixels) 'valor, as partículas são excluídas da análise.
      6. Tamanho do quadro - largura / altura (cm): dimensão da câmara, ou seja, 33 centímetros de largura e 25 cm de altura.
      7. Congelamento critério (pixels): por exemplo, 30 pixels, veja os detalhes no Protocolo 6.
      8. Congelamento duração - min (seg): por exemplo, 2 segundos, quando nenhum movimento do mouse é detectado por apenas menos de 2 segundos, o seu comportamento não é contado como "congelamento",.
      9. Taxa de Choque (frame / sec): veja os detalhes no Protocolo 6.
   4. Passo 4: Assunto ID. Digite a identificação do sujeito.
   5. Passo 5: Definições da Câmara. Controle o brilho eo contraste da imagem capturada.
   6. Passo 6: Definições de Limiares. Ajuste os valores de limiar para detectar um rato preto como pixels pretos em um fundo branco em cada imagem e julgar o comportamento do mouse como "congelamento" ou "não-congelamento '(veja os detalhes no Protocolo 6). Para analisar um rato albino, clique na caixa 'modo invertido' e ajuste os valores de limite de forma adequada.
   7. Passo 7: Definir Gaiola Field. Especifique o campo de cada câmara que você deseja capturar. Após clicar no botão retângulo na caixa de ferramentas, desenhar um retângulo ao redor do chão da câmara na janela de imagem ao vivo. Em seguida, selecione o número de câmara e clique no botão 'Definir'. Finalmente, clique no botão "Completo".
3. Após os ajustes de parâmetros são definidos, um teste de preparação deve ser dada utilizando camundongos prática (ratos não utilizados como sujeitos) antes do primeiro teste do dia para determinar se o sistema de análise de imagem e geradores de ruído / choque brancas trabalhar sem problemas.
4. Mover uma gaiola contendo os ratos de prática para a sala de testes à prova de som da sala de espera ao lado, e colocar cada mouse na câmara de condicionamento. Imediatamente após a colocação da ratos na câmara, clique no botão de início de ImageFZ. O software aplicativo irá apresentar sinais auditivos e / ou footshocks elétricos para os ratos na ordem que você especificar em um arquivo de referência.
5. Após 480 segundos decorrido, devolver os ratos para sua gaiola e voltar a gaiola para a prateleira na sala de espera.
6. Limpe cuidadosamente as câmaras. Em seguida, o botão 'Next Análise' click, e repita os passos 3.2.4-3.6 para os ratos de teste.
7. Lojas ImageFZ viver e traçar imagens no formato TIFF. O programa permitenós para realizar uma análise offline para reanalisar as imagens utilizando os valores dos parâmetros modificados. Se você realizar uma análise off-line, selecione o menu plug-in 'Medo Condicionado e FZ offline' e selecione a pasta de dados que você quer para re-analisar. A partir daí, os valores dos parâmetros de entrada novamente, e clique no botão "Completo".

4. Teste Contexto

1. Após a sessão de condicionamento ter sido concluída, os ratos são devolvidos para a mesma câmara de condicionamento e teve um comportamento de congelação para medir medo contextual condicionado (teste contexto). Um intervalo de atraso entre o condicionamento e o teste contexto tem sido geralmente definido em 24 horas. Neste protocolo, para avaliar a memória recente e da memória remota (medida pelo teste de 1 dia e mais de 28 dias após o condicionamento, respectivamente) ^{de 25,} os ratos são submetidos ao teste de contexto de aproximadamente 24 horas e 30 dias após a sessão de condicionamento. Os ratos são colocados no conditioning câmara e estão autorizados a explorar livremente a câmara para 300 segundos sem CS e dos EUA apresentações (Figura 2C).
2. Execute o programa de software ImageFZ e definir os valores dos parâmetros do software de aplicação da mesma forma como no condicionamento (ver secção 3.2.3), no entanto, modificar o tempo de duração desta prova para 300 segundos e selecione um arquivo de texto de referência para o teste de contexto . Após alterar a configuração, um teste de preparação deve ser dada utilizando camundongos prática para verificar o sistema ImageFZ.
3. Coloque cada rato na câmara condicionado e clique no botão Iniciar. Após 300 segundos decorrido, devolver os ratos em sua gaiola, e deixar a gaiola imperturbável até que o teste cued começa.
4. Limpe as câmaras. Em seguida, o botão 'Next Análise' click, e repita os passos 4,3-4,4 nos ratos de teste.

5. Teste Cued

1. Teste Cued é conduzida no mesmo dia do ensaio de contexto ou no dia seguinte.Neste teste, os ratos são colocados em uma outra câmara de teste com propriedades muito diferentes, fornecendo um novo contexto, que não está relacionada com a câmara de condicionamento, durante 3 min. No final dos 3 primeiros minutos, o sinal sonoro que é apresentada no momento do condicionamento é dada aos ratos durante 3 min no ambiente contexto novo. Neste protocolo, teste cued é realizada algumas horas após o teste de contexto. Ratos têm permissão para explorar a câmara triangular para 360 seg. No primeiro 3 min, nem um nem CS EUA é apresentado e, posteriormente, um CS (a 55 dB de ruído branco) é apresentado para o último 3 min.
2. Executar o programa de software ImageFZ e definir os valores dos parâmetros do mesmo modo como no condicionamento, excepto modificar o tempo de duração do teste de 360 ​​seg e seleccionar um ficheiro de texto de referência para o teste com pistas. Depois de ajustar a configuração, um teste de preparação deve ser dada utilizando camundongos prática para verificar o sistema ImageFZ.
3. Coloque cada rato na câmara triangular e clique no iníciobotão. Após 360 segundos decorrido, devolver os ratos para sua gaiola e voltar a gaiola para a prateleira da sala de espera.
4. Limpe as câmaras. Em seguida, clique no botão 'Next Análise "e repita os passos de 5,3-5,4 nos ratos de teste.
5. Para testar mais de memória remota, repetir os protocolos 4-5 a cerca de 30 dias após a sessão de condicionamento (Figura 2A).

6. Análise de Imagem

1. Realizar aquisição de dados e análise, usando automaticamente ImageFZ. Este programa de software aplicativo é baseado no programa de domínio público ImageJ (desenvolvido por Wayne Rasband no National Institutes of Health e disponível em http://rsb.info.nih.gov/ij/), modificado por Tsuyoshi Miyakawa (software aplicativo ImageFZ , disponível para download gratuito, consulte a Tabela de materiais / reagentes).
2. Para todos os experimentos, capturam imagens com uma determinada taxa de quadros (por exemplo, 1 fps) com ImageFZ usando um dispositivo de captura de vídeo USB, incluindo umcâmera de vídeo. Para medir a distância percorrida a partir das imagens consecutivas, ajustar o valor dos limiares min 'do programa (por exemplo, 80 pixels), que é definido para o segmento das imagens em uma partícula preto (um rato) e um fundo branco. A distância percorrida é calculada a partir da distância entre cada conjunto de coordenadas XY para o centro de gravidade da partícula em imagens consecutivas.
3. Para medir o comportamento de congelamento das imagens consecutivas, ajuste o "limiar min (xor)« Valor do programa (por exemplo, 160 pixels), que é definido para o segmento das imagens em uma partícula preto (mouse) e fundo, e, em seguida, calcular o quantidade de área (pixels) de regiões que não se sobrepõem entre as partículas de cada par de imagens consecutivas. Ajustar o valor de utilizar o cursor da ferramenta até que o limite de partícula preto em cada imagem corresponde à forma da totalidade do corpo do rato, excluindo a cauda. Se a área do nonoverlapping região é inferior ao valor de "critério congelamento '(por exemplo, 30 pixels), o comportamento é considerado como" congelamento "(Figura 3), que é geralmente definida como a ausência completa de qualquer movimento, excepto para a respiração e os batimentos cardíacos. Quando a área superior a este valor, o comportamento é considerado "não-congelamento '(Figura 3). O julgamento deve ser feito com base na definição de congelamento. Ratos, por vezes, apresentam um movimento sutil e uma imobilidade momentânea, que não pode ser considerado como um comportamento de congelamento, que reflete o medo. A imobilidade que dura por um curto período de tempo (por exemplo, menos do que 2 segundos), o que é provavelmente diferente da manifestação de medo, pode ser excluído da análise, definindo o limite de tempo do congelamento. Para definir o limite de tempo, a entrada de 'congelamento duração - min (seg)' valor (por exemplo, 2 seg.)
4. O programa ImageFZ automaticamente calculates a distância percorrida (cm) e a percentagem de congelamento. Os resultados são salvos em arquivos de texto, e viver e traçar as imagens são armazenadas em um formato TIFF. Para medir a distância percorrida (cm) como um índice de sensibilidade footshock elétrica, o programa ImageFZ também adquire imagens com uma alta taxa de quadros (por exemplo, 4 fps) por 6 segundos, medido a partir de 2 segundos antes da entrega de um 2 seg footshock até 2 seg após choque nas patas, durante a análise em linha. Para definir a taxa de quadros para captura de imagem, antes, durante e footshock, a entrada de um valor na 'taxa de Choque (frame / seg)' caixa depois. Após a análise on-line, realizar a análise off-line selecionando um menu plug-in 'FZ Choque offline' para obter os dados para a distância percorrida.
5. Os valores dos parâmetros do programa ImageFZ deve ser optimizado para gerar resultados semelhantes aos obtidos por observadores humanos em ensaios de preparação. Para marcar o manual, o comportamento de congelação é medida continuamente utilizando um stopwatch e um programa de eventos de gravação ou de um procedimento de tempo de amostragem instantânea a cada 3-10 segundos, durante a análise utilizando o software ImageFZ. Dois observadores normalmente conduzir a observação comportamental. Para ajustar os valores dos parâmetros do programa ImageFZ para garantir que os resultados da análise de imagem são compatíveis com os de observadores humanos, realizar uma análise offline do programa ImageFZ, modificando o 'min limiar (xor) "e os valores" critério congelamento » . Para realizar a análise off-line, selecione o menu plug-in 'FZ offline' e entrada de quaisquer valores dos parâmetros.

7. Solução de problemas

1. Como pode o programa ImageFZ ser obtido e instalado?
   O programa ImageFZ está disponível para download gratuito no nosso site (ver Tabela de materiais / reagentes), e roda em um computador Windows. Baixe a pasta zip para ImageFZ e instalar o software no seu computador. Veja o arquivo 'readme.txt' para a INSTALAÇÃOem detalhes e siga as instruções passo-a-passo.
2. Por que a mensagem de erro "dispositivo de captura de configuração de erro 'exibido?
   Verifique a conexão do cabo da câmera e sua instalação do driver do dispositivo de captura de imagem USB. Se não houver nenhum problema com as configurações, então o software ImageFZ pode não funcionar com o seu dispositivo de captura de imagem. Veja o arquivo 'readme.txt' sobre o dispositivo apropriado para usar com software ImageFZ.
3. ImageFZ não pode detectar todo o corpo do rato como uma partícula.
   Defina o valor do "limiar min 'e / ou' limiar min (xor) 'menor do que o valor atual. Se ImageFZ não consegue detectar o mouse em um lugar específico, por exemplo, o canto de uma câmara de teste, em seguida, as condições de teste insuficientes, como um piso uniformemente iluminado ou uma diferença de pouco contraste entre o mouse eo fundo, possa existir. Para resolver este problema, ajustar os valores dos parâmetros (por exemplo, brilho e contraste da imagem e os valores de limite ao vivo) de ImageFZ, controlar o número ea posição das luzes, ou usar um fundo branco por um rato preto.
4. Captura de imagem em uma alta taxa de quadros retarda o computador durante a análise online.
   Defina a taxa de quadros para um valor inferior à taxa atual, e realizar a análise online. A análise ImageFZ, por meio de aquisição de imagem em 1 fps, é suficiente para medir com precisão de zero, como mostrado na seção de resultados representativos.
5. Os resultados da análise ImageFZ não concordam com os de pontuação humano.
   Examine a imagem armazenada e arquivos de resultado de julgamento. Se ImageFZ superestima congelamento, defina o "critério de congelamento" para um valor menor do que o valor atual, e realizar análises offline. Se ImageFZ subestima congelamento, defina o "critério de congelamento" para um valor mais elevado do que o valor atual.
6. Em optogenetical e in vivo e eletrofisiológicoxperiments, o cabo de fibra ligado à cabeça do mouse interfere com o julgamento de congelamento.
   Brasão dos cabos em branco para um rato preto, e alterar a posição eo ângulo da câmera até que os cabos não são detectados.
7. O que é necessário para a análise off-line?
   Crie uma pasta chamada 'Image_FZ' no diretório raiz do programa ImageFZ. Nesta pasta, crie as subpastas 'Imagens' e 'Sessões'. Mover uma imagem em escala de cinza de 8 bits para a pasta "Imagens", e criar um arquivo de texto em que o nome do arquivo de imagem é gravada na pasta 'Sessions'. A partir daí, executar a análise off-line ImageFZ, e siga as instruções do programa.

Resultados

No teste de medo condicionado, experimentadores humanos utilizado para quantificar o comportamento de congelamento por meio de observação direta de trabalho intensivo ^26-29, mas de medição computador recentemente com base em photobeam (por exemplo, o sistema de "Congelar Monitor ') e imagem em análise de sistemas têm sido usados ​​para automaticamente medir o comportamento de congelamento ^26,30-32. ImageFZ é um sistema de análise de imagem-automatizado, o qual produz os resultados comparáveis ​​àqueles obtidos por meio de observação humana, tal como descrito abaixo. Aqui, nós comparamos os resultados de observação humana com os de análise ImageFZ sob parâmetros variáveis: 'Rate (quadros / seg) "e" Congelamento critério (pixels). Neste experimento, cinco camundongos C57BL/6J machos (média de peso corporal ± SD (g), 31,4 ± 3,55, com média de tamanho do corpo ± SD (pixels), 351,6 ± 62,2) foram utilizados em 15-27 semanas de idade. A observação humana foi feita usando um programa de evento de gravação (um programa de software Macintosh OS9); um evento de pressionar a tecla que continued por 2 segundos ou mais, quando um rato exibido um ataque de nenhum movimento foi considerado "congelamento". A percentagem de congelamento foi calculado a cada 60 segundos em cada um dos testes e utilizado para análises de correlação. A porcentagem de congelamento marcado pelos dois observadores (confiabilidade interobservador, para condicionado, r = 0,879; para teste de contexto, r = 0,957; para teste cued, r = 0,866, para todos os casos, r = 0,888) foi em média de gerar um ser humano marcar. Correlações entre as porcentagens de congelamento medidos através ImageFZ com cada taxa de quadros (ou seja, 1, 2 e 4 fps) e aqueles obtidos através de observações humanos foram examinados. Tal como ilustrado na Figura 4, as percentagens calculadas através de congelamento ImageFZ (1, 2, e 4 fps) eram altamente correlacionados com o valor médio obtido a partir da medição dos dois observadores. Notavelmente, a captura de imagens a uma taxa de quadros mais alta nem sempre produz a melhor correlação. A análise de imagem em 1 resultados fps gerado semelhantes aos obtidos a partir de observadores humanos e emteste ach. Correlações entre as porcentagens de congelamento medidos através de observações humanas e utilizando ImageFZ em cada condição do 'critério de congelamento (pixels) "(ou seja, 20, 30 e 40 pixels) foram examinados. As percentagens de congelamento calculados usando ImageFZ no 'critério de congelamento (pixels)' de 20, 30 e 40 pixels foram, em todos os casos, altamente correlacionada com os obtidos através de observações humanas (Figura 5). Como mostrado na Figura 5D, quando o critério de congelamento é definido para um valor baixo, o movimento sutil de um rato, consideradas como "congelamento" por observadores humanos, seria considerado "não-congelamento 'usando ImageFZ. Por outro lado, se o critério é definido para um valor alto, o movimento de um rato, marcado como "não-congelamento 'por observadores humanos, seria considerado' congelamento 'usando ImageFZ (Figuras 5C, 5F, e 5I). Assim, para obter os resultados mais fiáveis, cada um dos parâmetros do programa ImageFZ deve ser calibrado nósção os dados marcados através de observações humanas em cada ambiente de teste.

Além disso, compararam-se os resultados obtidos por um observador humano, usando um sistema de medição com base photobeam computador (o sistema de monitor de congelamento), com os obtidos usando ImageFZ (ver Figura 6). O observador humano desconhecia o grupo de tratamento e os resultados do ImageFZ marcar. Para os ajustes dos parâmetros do sistema de congelamento Monitor, usamos três medidas de porcentagem de congelamento de um sistema previamente validado ^30. Resumidamente, o número de intervalos de 10 seg, em que os animais necessitaram de mais de 1 ou 2 segundos a atravessar a primeira nova feixe do intervalo (10 seg 1 seg e 2 seg 10 seg, respectivamente) e a latência entre o início de cada intervalo de cinco segundos e a terceira nova interrupção do feixe dentro deste intervalo (Latency3) foram medidos. As percentagens dos intervalos durante o qual o mouse foi congelamento ou a porcentagem da quantidade total de tempo required para quebrar o terceiro photobeam foram calculados.

As percentagens de congelamento medidos em cada sistema estão ilustrados na Figura 6. Os grupos foram comparados por meio de duas vias para medidas repetidas ANOVA seguido de teste t (ver Tabela 1). As percentagens de congelamento medidos usando ImageFZ (Figura 6B) foram mais semelhantes aos marcados através da observação humana (Figura 6A) do que os resultados obtidos utilizando um sistema baseado em photobeam (Figuras 6C-E). As percentagens de congelamento medidos utilizando o programa ImageFZ em cada teste foram altamente correlacionados com aqueles marcou através da observação humana (condicionado, r = 0,947, teste de contexto, r = 0,970; cued teste, r = 0,934), enquanto que as correlações entre as percentagens de congelamento medido utilizando o sistema de medição de computador baseado em photobeam (10seg 1s, 2s 10seg, ou Latency3) e o observador humano foram menores (condicionado, r = 0,503, 0,593, e 0,761; contexto test, r = 0,772, 0,819 e 0,912) em comparação com as correlações entre as percentagens de congelamento medidos usando ImageFZ e observação humana (Figuras 7A e 7B). Além disso, a Figura 7 revela que as diferenças entre as percentagens de congelação obtidos através da observação humana e usando ImageFZ em cada rato foram as menores diferenças. Estes resultados indicaram que as percentagens de congelamento medidos usando ImageFZ foram semelhantes aos obtidos através de observação humana e que ImageFZ é altamente preciso, quando a medição da quantidade de congelamento.

Figura 1. Aparelhos de contextual e cued teste medo condicionado. (A) Uma câmara quadrada de acrílico para o teste de condicionamento e contexto, ( B) grades de metal sobre um piso de plástico branco para preto, cutia, ou diluir os ratos marrons (em cima) e grades de metal preto electrifiable sobre um piso de plástico preto para ratos brancos (inferior), as imagens ampliadas das grades são mostrados na direita painel, (C) um gerador de ruído / tom branco e um gerador de choque, (D) uma sala à prova de som, e (E) uma câmara triangular acrílica com um piso plano para o teste cued. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 2. Representação esquemática do protocolo. (A) Visão geral do contextual e cued teste medo condicionado, (B) condicionado, (C) cCONTEXTO teste, e (D) com pistas de teste. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 3. A análise de imagem pelo software ImageFZ. Para cada par de imagens sucessivas, sendo a quantidade de área (pixels), através do qual o rato é movido calculado ImageFZ. Quando esta área é inferior a um certo limiar (por exemplo, 30 pixels), o comportamento é julgada ser "congelamento". Quando a quantidade de área igual ou superior ao limiar, o comportamento é considerado "não-congelamento '. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 4. Comparações entre as percentagens de congelamento calculados a partir de imagens em diferentes taxas de quadros usando ImageFZ com os medidos através da observação humana. Os testes de medo condicionado foram realizados utilizando camundongos C57BL/6J machos (n = 5). Durante os testes, dois observadores marcou o comportamento de congelamento. Simultaneamente, imagens ao vivo foram capturados em 4 fps usando o programa ImageFZ. Os arquivos capturados em 4 fps foram reduzidos depois de extrair os quadros para corresponder a imagens capturadas em 1 fps ou 2 fps. Os valores dos parâmetros de "Rate (frames / seg)" foram definidos como 1, 2 ou 4 fps, e as porcentagens de congelamento em cada 60 seg bin foram calculados a partir de arquivos de imagem usando análise offline ImageFZ. Cada ponto representa uma porcentagem de congelamento de cada 60 seg bin. Os coeficientes de correlação de Pearson entre os dados obtidos a partir da observação humana e análise ImageFZ foram calculados.Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 5. As percentagens de congelamento calculados a partir das imagens em diferentes valores de critério de congelamento, utilizando ImageFZ e os medidos através de observações humanos foram comparados. Os testes de medo condicionado foram conduzidos utilizando ratos C57BL/6J machos (n = 5). Durante os testes, dois observadores registraram o comportamento de congelamento, e as imagens foram capturadas ao vivo usando o programa ImageFZ. As percentagens de congelamento em cada 60 seg bin foram calculados a partir das imagens (1 frame / seg) através de análise offline ImageFZ, definir os valores dos parâmetros do "critério de congelamento (pixels) 'a 20, 30 ou 40 pixels. Cada ponto representa uma porcentagem de congelamento de cada 60 seg bin. Co correlação de Pearsonefficients entre os dados obtidos a partir da observação humana ea análise ImageFZ foram calculados em cada teste. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 6. Os percentuais de congelamento foram medidos usando sistemas automatizados e observação humana em grupos incondicionados e condicionados de camundongos C57BL/6J machos (n = 5, cada grupo). (A) a observação humana, (B) ImageFZ, (C) Bloqueio de Sistema Monitor de 1 (10seg 1seg), (D) Bloqueio de Sistema Monitor 2 (2seg 10seg) e (E) Bloqueio de Sistema Monitor 3 (Latency3). Grupo comparações foram realizadas utilizando duas vias para medidas repetidas ANOVA seguido de teste t (uncovs condicionado grupo nditioned grupo, * P <0,05; †, p <0,01). Os dados obtidos com ImageFZ foram semelhantes aos marcou através da observação humana. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 7. Correlação e distribuição das diferenças entre as porcentagens de congelamento, medidos usando sistemas automatizados e de observação humana. (AB) Gráficos de dispersão e os coeficientes de correlação de Pearson entre as porcentagens de congelamento marcados através de sistemas automatizados e observação humana freqüência são mostrados. As percentagens de congelamento, calculados usando ImageFZ, foram altamente correlacionados com os obtidos através da observação humana. (CF) Ocorrências de menos de um dif 10%rença entre as percentagens de congelação obtidos a partir de sistemas automatizados versus observação humana foram maiores quando os dados analisados ​​usando ImageFZ foram comparados com aqueles analisados ​​através da observação humana. Clique aqui para ver imagem ampliada.

	ANOVAs
	Condição	Tempo	Condição x Tempo
Dia 1 (condicionado)
Humano	F (1,8) = 28,53, p = 0,0007	F (7,56) = 20,79, p <0,0001	F (7,56) = 16,58, p <0,0001
ImageFZ	F (1,8) = 13,97, p = 0,0057	F (7,56) = 21,40, p <0,0001	F (7,56) = 11,69, p <0,0001
Congelar Monitor (1sec10sec)	F (1,8) = 5,16, p = 0,0528	F (7,56) = 2,39, p = 0,0329	F (7,56) = 0,72, p = 0,6572
Congelar Monitor (2sec10sec)	F (1,8) = 4,07, p = 0,0782	F (7,56) = 3,44, p = 0,0039	F (7,56) = 1,52, p = 0,1803
Congelar Monitor (Latency3)	F (1,8) = 4,44, p = 0,0682	F (7,56) = 9,94, p <0,0001	F (7,56) = 4,33, p = 0,0007
Dia 2 (contexto)
Humano	F (1,8) = 42,94, p = 0,0002	F (4,32) = 1,91, p = 0,1336	F (4,32) = 1,48, p = 0,2302
ImageFZ	F (1,8) = 49,61, p = 0,0001	F (4,32) = 2,06, p = 0,1087	F (4,32) = 0,83, p = 0,5174
Congelar Monitor (1sec10sec)	F (1,8) = 20,28, p = 0,002	F (4,32) = 1,63, p = 0.1918	F (4,32) = 0,55, p = 0,6997
Congelar Monitor (2sec10sec)	F (1,8) = 40,20, p = 0,0002	F (4,32) = 2,66, p = 0,0504	F (4,32) = 1,20, p = 0,3306
Congelar Monitor (Latency3)	F (1,8) = 35,30, p = 0,0003	F (4,32) = 2,49, p = 0,0626	F (4,32) = 1,09, p = 0,3793

Tabela 1. Comparações de estatísticas.

Discussão

O teste de condicionamento do medo contextual e cued é um dos paradigmas mais utilizados para avaliar a aprendizagem ea memória. Este teste é uma forma de condicionamento pavloviano em que é feita uma associação entre um contexto e / ou um estímulo condicionado (sinal sonoro) e um estímulo aversivo (footshock elétrica). Depois de até mesmo um único par do contexto / sinal sonoro e footshock, os ratos apresentam congelamento de longa duração, quando confrontado com qualquer contexto ou a sugestão. Neste ensaio, o comportamento de congelação é usado como um índice de memória medo. Os estudos farmacológicos e lesão revelaram que a formação da memória, consolidação e recuperação são regulados por diversas regiões do cérebro, como a amígdala, o hipocampo e córtex pré-frontal ^3,33-35. Além disso, estudos de genética molecular têm demonstrado o papel dos genes e moléculas envolvidos na aprendizagem e na memória nestas regiões do cérebro usando camundongos geneticamente modificados ³⁶ específicas. Portanto, este teste é simple e útil para explorar a base neurobiológica aprendizagem medo subjacente e memória. Neste artigo filme, apresentamos nosso protocolo para fornecer pesquisadores com informações detalhadas para entender e facilmente realizar o teste.

Comportamento de congelamento foi quantificada através da observação direta por experimentadores humanos. Um pesquisador bem treinado é esperado para produzir resultados estáveis ​​confiáveis ​​em todo observações. No entanto, este método envolve potenciais problemas, tais como diferenças no método de observação, vieses do observador, e os erros de quantificação simples, o que torna difícil comparar diretamente os resultados de pesquisadores independentes e diferentes laboratórios. Um sistema de medição de computador baseado em photobeam automatizado também foi usado ^26,30-32. No entanto, este sistema também apresenta problemas potenciais na medição comportamentos de congelamento. Devido ao arranjo de sensores, este sistema pode ser incapaz de detectar pequenos movimentos da cabeça que typically ser marcado como "ativo" através da observação humana. Além disso, tremendo durante o congelamento pode ser considerado como não congelantes porque quando um congela animais, interrupções intermitentes no photobeam são observadas como conseqüência do tremor. Como um método alternativo, automatizados imagem e vídeo-análise de sistemas foram desenvolvidos ^17-20,37,38. Anagnostaras et al. ³⁷ descritos alguns sistemas com programas de software de análise de imagem que têm boa validade e marcar congelamento bem ^17,20,37-38. No entanto, a maioria destes sistemas e programas de análise tem que ser obtida a partir de fornecedores comerciais e são tipicamente dispendiosos. Nós desenvolvemos o software ImageFZ para a análise do comportamento de congelamento, e este programa é distribuído como um programa de software livre. ImageFZ detecta o mouse como um corpo de pixels (uma partícula) e discrimina sutil movimento do mouse como "congelamento" ou "não-congelamento ', dependendo da quantidade deárea de regiões que não se sobrepõem entre as partículas de cada par de imagens consecutivas. Como mostrado nos resultados representativos, as medições utilizando o programa ImageFZ são consistentes com ou mais preciso do que o obtido utilizando outros métodos. Assim, o programa ImageFZ mede automaticamente o comportamento que os observadores humanos julgar como o congelamento de acordo com critérios definidos. Além disso, o programa ImageFZ calcula a distância percorrida (cm) antes, durante e após a exposição ao choque no pé, o que facilita uma avaliação da sensibilidade de choque e a análise do comportamento de congelação.

Existem diferenças metodológicas entre os laboratórios. Essas diferenças podem resultar em dificuldade de comparação de dados entre os laboratórios e em replicar os resultados em diferentes laboratórios. Para obter dados mais estáveis ​​e comparáveis, é necessário normalizar o protocolo de teste, tanto quanto possível. O sistema de análise com ImageFZ leva à automação de processos de ensaio, o que pode contribuir paraa padronização dos protocolos usados ​​em laboratórios.

Várias respostas comportamentais devem ser considerados quando se analisa o comportamento de congelamento. Em primeiro lugar, quando os animais enfrentam uma situação temerosa, eles podem fugir em vez de congelar ^39. Fugindo é uma das respostas de medo, e sua ocorrência vai levar a subestimar a memória do medo. Em segundo lugar, a congelação pode depender de um nível de actividade geral, e o nível de actividade em ratinhos experimentais e de controlo necessita de ser examinado. Por exemplo, apesar de ratinhos sem o receptor de acetilcolina muscarínico M1 mostrou níveis reduzidos de congelação em comparação com ratinhos de tipo selvagem, vários testes comportamentais indicaram que os resultados podem ser atribuídos ao seu fenótipo de hiperactividade em vez da sua diminuição da memória ^18. ImageFZ calcula a distância (cm) percorrida pelos sujeitos. Os dados estão disponíveis para examinar se existem diferenças nos níveis gerais de atividade entre os sujeitos. Se houver uma diferença no grupoa distância percorrida, uma abordagem possível para o problema é de considerar a distância percorrida durante o primeiro 2 min de formação, como a actividade da linha de base e para usar uma razão de supressão (razão de supressão = (actividade durante o teste) / (actividade da linha de base durante a + actividade durante teste)) como um índice secundário de medo ^17,40. Finalmente, uma diferença na sensibilidade à dor, induzir as alterações na reactividade a um choque nas patas eléctrico, se houver, pode resultar em variações do comportamento de congelação. ImageFZ também calcula a distância percorrida (cm) em detalhe a partir de 2 segundos antes de uma exposição de um choque nas patas de 2 segundos a 2 segundos após a exposição (em 6 segundos), o qual pode ser utilizado como um indicador da sensibilidade do choque nas patas.

Sistemas de vídeo-análise de ter sido desenvolvido para medir o comportamento de congelamento de albino, preto, cutia, e diluir os ratos marrons. ImageFZ utiliza uma bandeja de piso preto e grades pretas para examinar ratos brancos (ver Figura 1B). As grades pretas são feitas de especi aliado processado metais revestidos com tinta preta e tem uma condutividade eléctrica semelhante à das grelhas de metal não revestida, que são tipicamente utilizados para ratos pretos. ImageFZ também analisa o comportamento de congelamento em ratos e outros roedores por meio de ajustes dos parâmetros do programa. Na versão atual do ImageFZ, o comportamento do sujeito é gravado usando uma câmera de vídeo a partir da parede superior para analisar o congelamento. ImageFZ também pode ser usado em uma configuração em que as imagens são captadas a partir do lado da câmara. Além disso, o ImageFZ controla um máximo de quatro aparelhos. Este recurso permite ao pesquisador analisar simultaneamente quatro ratos, economizando tempo e reduzindo os possíveis influências de diferenças no tempo de execução de cada um dos temas e da ordem de testes sobre o comportamento. Assim, ImageFZ simplifica o procedimento de teste e análise do comportamento de congelamento, e este programa facilita o teste com menos trabalho e sem qualquer tipo de formação para os experimentos comportamentais.

e_content "> No laboratório Miyakawa, avaliamos mais de 110 cepas de ratos geneticamente modificados e dos ratos de controle do tipo selvagem no teste de condicionamento do medo contextual e cued utilizando o sistema de vídeo análise para elucidar os efeitos de um determinado gene na aprendizagem e memória ^41-42 Obtivemos um grande conjunto de dados brutos para mais de 5.000 ratos Os dados brutos que foi usado para artigos de pesquisa publicados ^4-16 estão incluídos no 'Mouse Fenótipo banco de dados ", como um banco de dados público (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). Este artigo filme presente fornece informações detalhadas a respeito dos detalhes do nosso procedimento experimental e promove a compreensão da situação de teste.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageFZ program	Developed by Tsuyoshi Miyakawa		This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7.
Conditioning chamber	O’Hara & Co., Japan	CL-3002L	For mouse.
Cued test chamber	O’Hara & Co., Japan	CLT-3002L	For mouse.
Interface	O’Hara & Co., Japan	CL-1040	The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program.
Scrambled shock generator	O’Hara & Co., Japan	SGA-2040	The shock generator can be controlled by ImageFZ program.
Shock grid tester (ammeter)	O’Hara & Co., Japan	SG-T
USB video capture device	XLR8	USB2IVOSX
Quad image splitter	Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan	400AS
Soundproof room	O’Hara & Co., Japan	CL-4210
Freeze Monitor	San Diego Instruments, Inc., CA, USA		16 x 16 photbeam array  ( 2.5 cm spacing)