Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

Resumo

Descrito aqui é um método para medir diretamente faíscas de cálcio, as unidades elementares de Ca ^{2 +} liberação de retículo sarcoplasmático em fibras musculares esqueléticas intactas. Este método utiliza osmótica mediada por estresse disparo de Ca ^{2 +} liberação do receptor rianodina nas fibras musculares isoladas. A dinâmica ea capacidade homeostática de Ca ^{2 +} intracelular de sinalização pode ser empregada para avaliar a função do músculo na saúde e na doença.

Resumo

A manutenção da homeostase de ^{Ca2 +} de sinalização é um processo fisiológico essencial em células vivas. Ca ^{2 +} faíscas são as unidades elementares de Ca ^{2 +} de sinalização nas fibras musculares estriadas que aparecem como altamente localizada Ca ^{2 +} eventos de liberação de mediadas pelo receptor rianodina (RyR) Ca ^{2 +} liberar canais no retículo sarcoplasmático (RS) membrana. A avaliação adequada do músculo Ca ^{2 +} faíscas poderia fornecer informações sobre os intracelulares de ^{Ca2 +} propriedades de manipulação de músculos estriados saudáveis ​​e doentes. Apesar de Ca ^{2 +} faíscas eventos são comumente visto em cardiomiócitos de descanso, eles raramente são observados em repouso fibras musculares esqueléticas; portanto, há uma necessidade de métodos para gerar e analisar faíscas em fibras musculares esqueléticas.

Detalhado aqui é um protocolo experimental para a medição de Ca ^{2 +} faíscas isolado flexores digitorm brevis (FDB) fibras musculares usando fluorescent Ca ^{2 +} indicadores e microscopia confocal de varredura a laser. Nesta abordagem, as fibras FDB isolados são expostos ao estresse hiposmótico transitória seguida por um retorno à solução fisiológica isotônica. Sob estas condições, uma robusta Ca ^{2 +} faíscas resposta é detectada adjacente à membrana sarcolema em pequenas fibras musculares FDB saudáveis. Alterou Ca ^{2 +} faíscas resposta é detectada em distróficas ou envelhecidas fibras musculares esqueléticas. Essa abordagem tem demonstrado recentemente que a sinalização delimitado por membrana envolvendo conversa cruzada entre inositol (1,4,5) trifosfato de receptor de IP ₍₃ R) e RyR contribui para Ca ^{2 +} activação faísca no músculo esquelético. Em resumo, nossos estudos usando estresse osmótico induzido Ca ^{2 +} faíscas mostrou que esta resposta intracelular reflete um músculo sinalização mecanismo em fisiologia e envelhecimento estados / doença, incluindo modelos de ratos de distrofia muscular (MDX ratos) ou esclerose lateral amiotrófica (ALS modelo).

Introdução

Intracelular livre de ^{Ca2 + ([Ca2 +]} _i) é um mensageiro secundário versátil e importante que regula várias funções celulares em células excitáveis ​​como neurônios, cardíaco, esquelético e músculos lisos (para revisão ver Stutzmann e Mattson ^1). Regulamentado Ca ^{2 +} mobilização e cross-talk entre retículo sarcoplasmático (RS) e T-túbulo (TT) membranas são reguladores fundamentais da fisiologia muscular. Além disso, as alterações no ^{Ca2 +} sinalização tinha sido demonstrado ser um mecanismo subjacente da disfunção contráctil em várias doenças musculares.

Ca ^{2 +} faíscas são localizados eventos Ca ^{2 +} libertação elementares provenientes de abertura do receptor rianodina (RyR) canal no retículo sarcoplasmático (RS) membrana ^2. No músculo cardíaco, faíscas ocorrer espontaneamente através da abertura do canal RyR2 por uma CA ^{2 +} induzida por ^{Ca2 +} release (CICR) mecanismo ^3-5. No músculo esquelético, RyR1 é estritamente controlado pelo sensor de tensão na membrana ^6,7 TT. Assim, Ca ^{2 +} faíscas são reprimidas e raramente detectada em condições de repouso em fibras musculares esqueléticas intactas. Até recentemente, a membrana sarcolema necessário para ser rompidas por vários métodos químicos ou mecânicos "skin" para desacoplar a supressão do sensor de tensão em RyR1 e permitida para o Ca ^{2 +} desencadear eventos a serem detectados no músculo esquelético ^8,9. Um método anteriormente descrito é necessária a permeabilização da membrana das fibras musculares por detergente saponina ^10.

Em 2003, descobrimos que, ou o stress hipoosmótico transiente ou stress hiperosmótico poderia induzir Ca ^{2 +} faíscas periférica adjacente à membrana sarcolema em fibras musculares intactas ^11. Este método já foi modificado para estudar o mecanismo molecular e modulação de Ca ^{2 +} liberação e dinâmica ^12-16. Aqui destacamos os detalhes de nossa abordagem experimental para a indução, detecção e análise de Ca ^{2 +} faíscas no músculo esquelético intacto. Apresentamos também o nosso programa de análise de faísca custom-built que podem ser usados ​​para quantificar as propriedades elementares de Ca ^{2 +} faíscas individuais em músculo esquelético, por exemplo, freqüência de ignição e amplitude (Δ F/F0, o que reflete a probabilidade aberta dos canais RyR e a carga de ^{Ca2 +} para dentro do SR), o tempo até ao pico (tempo de subida) e duração (FDHM, a duração total de amplitude de metade do máximo) de faíscas, bem como a distribuição espacial de Ca ^{2 +} faíscas. Além disso, apresentamos evidências que ligam alterado Ca ^{2 +} fagulhas para os diversos estados fisiopatológicos no músculo esquelético, como a distrofia muscular e esclerose lateral amiotrófica.

A vantagem desta técnica envolve a capacidade de medir de Ca ^{2 +} em relativamente undamcélulas envelhecidas, em vez de descascar as fibras musculares, permitindo a gravação de Ca ^{2 +} faíscas em condições mais próximas fisiológica. Além disso, nosso programa concebido permite cálculos mais precisos das propriedades da faísca em relação às fibras musculares.

Protocolo

1. Configurando osmótica-stress Sistema de Perfusão

A Figura 1 é um diagrama esquemático de protocolo de cálcio faíscas avaliação em fibras musculares esqueléticas intactas.

1. Defina-se um micromanipulador de três eixos (xyz) capaz de posicionar a ponta de saída do sistema de perfusão que contém um mínimo de dois canais. Isto poderia ser feito com o descartável barril Luer-seringa ligados com três - forma Luer - Lok torneira para ligar e / ou desligar o fluxo de soluções para perfusão. Estes canais de perfusão deve ser capaz de fornecer> 1 ml / min de solução através de uma única ponta de perfusão com um> 0,2 milímetro de diâmetro.
2. Carregar dois canais do sistema de perfusão, uma com solução isotónica de Tyrode e o outro com Hipotônico solução de Tyrode.

2. Fibras Preparando Único brevis flexor (FDB) musculares intactas de Rato

1. Remover o pé de um rato uethanized seguinte NIH e IACUC diretrizes usando um par de tesouras de dissecação pesados ​​cortando a perna acima da articulação do tornozelo.
2. Pin o pé em uma câmara cheia de dissecção mínima Ca ^{2 +} Tyrode Solution com a superfície plantar voltada para cima.
3. Dissecar FDB cortando o tendão e puxando para cima sobre o tendão de separar o músculo do tecido circundante.
4. Termine dissecção cortando o tendão distal onde se ramifica em dígitos individuais nas camadas profundas do músculo.
5. Transferir o músculo FDB pegando com uma pinça, através das suas tendões para evitar danos adicionais para as fibras musculares e colocar num tubo com uma alíquota descongelada de solução de digestão de colagenase pré-aquecido a 37 ° C.
6. Incubar o tubo contendo a FDB na vertical num agitador orbital a 37 ° C durante 60-90 minutos com uma velocidade de 160 rpm. Este protocolo de dissociação feixes musculares precisa ser examinado experimentalmente para diferentes estirpes de animais, Especialmente para aquelas doenças / fibras mutantes vulneráveis ​​a danos de membrana.
7. Transfira a FDB digerido no tubo com 700 mL de solução isotônica de Tyrode e gentilmente triturar para liberar as fibras desenhando o músculo várias vezes através de uma série de 200 dicas ml-micropipeta de gradualmente diminuindo de diâmetro através de corte com uma lâmina de barbear limpa para remover as pontas de 200 ml de micropipeta. Para evitar danificar as fibras dos músculos particularmente fracos da doença, certifique-se a ponta é grande o suficiente para permitir que o feixe de fibras para passar sem degola. Não force o pacote através de muito pequena abertura.
8. Placa para fora das fibras FDB delicadamente tocando e ressuspensão fibras FDB no tubo e, em seguida, tirando 70 ml (1/10 de fibras totais) com um corte de 200 ml micropipeta para o centro do prato de 35 mm Delta TPG contendo 1 ml de isotônico Solução de Tyrode para reduzir a difusão através do prato.
9. Determinar o número de fibras individuais intactas no dish usando um microscópio de dissecação. Adicionar alíquotas adicionais de fibras de FDB para obter 3-4 fibras intactas sobre o prato.
10. Armazenar fibras musculares adicionais isoladas a 4 ° C e utilizar no prazo de 6 horas.

3. Fluo-04:00 Dye Carregando e Ca ^{2 +} Imagem (Faíscas Measurement)

1. Transferência de 500 ml de solução isotônica de Tyrode prato com fibras FDB banhado em um tubo com 10 ml de Fluo-4 AM Stock (1 mM), misturar e adicionar de volta para o prato para um Fluo-4 AM concentração final de 10 mM. Alternativamente, o ácido plurónico pode ser utilizado para aumentar a eficiência de carga de corante.
2. Carregar durante 60 minutos à temperatura ambiente no escuro.
3. Lave as fibras cuidadosamente tirando 500 ml de Fluo-4-AM isotônico contendo solução Tyrode do prato com um sem cortes de 200 ml-plástico ponta micropipeta e substituir com igual volume de solução isotônica fresco Tyrode.
4. Repita esse processo mais 3 vezes.
5. Para visualizar a função mitocondrial, transferir 500 ml de Isotonic solução Tyrode do prato com fibras FDB num tubo com 5 ml de caldo de TMRE (1 mM), misturar, e adicionar de volta para o prato para uma concentração final de 50 nM.
6. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
7. Lave as fibras cuidadosamente tirando 500 ml de TMRE contendo isotônico solução Tyrode do prato com um sem cortes de 200 ml micropipeta ponta de plástico e substituir com igual volume de solução isotônica fresco Tyrode.
8. Repita esse processo mais 3 vezes.
9. Transferir o prato para o microscópio confocal e seleccionar uma fibra intacta com estrias claras e uma membrana sarcolema suave para a experimentação.
10. Posicionar a ponta do sistema de perfusão de 400-500 mM de distância a partir da fibra do músculo alvo e para fora do centro utilizando controles micromaniplador.
11. Começar o fluxo da solução de Tyrode isotónica para assegurar a fibra FDB permanece no lugar.
12. Registre o sinal de fluorescência do Fluo-04:00 com um objetivo de imersão em óleo de 40X e excitar Fluo-04:00 com umlaser de argônio (comprimento de onda de excitação 488 nm) e emissão de registro de sinais (comprimento de onda 510-580 nm). A intensidade do sinal de fluorescência é proporcional ao nível relativo de concentração de ^{Ca2 +} intracelular ([Ca ^{2 +]} _i).
13. Induzir a transientes de Ca ^{2 +} por alteração da pressão osmótica da solução extracelular, a fim de produzir o stress osmótico em fibra. Inicialmente perfundir as fibras com uma solução isotónica de Tyrode (290 mOsM) (linha de base para a recolha de 60 seg) e, em seguida, com uma solução hipotónica de Tyrode (170 mOsM) durante 100 segundos para induzir o inchaço. Perfundir as fibras FDB volta com solução isotônica de Tyrode. Geralmente, apenas um choque osmótico é aplicado a uma única fibra intacta em uma delta TPG prato e os eventos de ignição último 10 min para a aquisição de dados.
14. Gravar localização espacial de Ca ^{2 +} faíscas (Figura 2), utilizando uma série temporal de xy imagens bidimensionais com velocidade de varredura de 166 lps (linhas por segundo, e eAlinha ch composto por 512 pixels, resultando em 3,08 seg / frame) para cada condição de isotônico (1 min), stress hipotônica (100 seg) e estresse pós-hipotônica (5 min). Sinais de loja para análise off-line para avaliar a distribuição e freqüência de Ca ^{2 +} faíscas após a conclusão do experimento.
15. Encontre uma nova fibra em um prato novo e seguir o mesmo protocolo de choque osmótico para induzir Ca ^{2 +} transientes. Use uma linha de varredura confocal modo (xt) (512 pixels de comprimento, taxa de amostragem de 2 ms / linha de varredura para gravar Ca ^{2 +} transientes por um minuto (ou seja, 30 mil linhas) com a linha de varredura confocal colocado diretamente sob membrana sarcolema (Figura 3 ). Altere a varredura linha a diferentes planos focais para gravar três séries seqüencial (a 1 min intervalos) de linescans para análise da magnitude e cinética de Ca ^{2 +} faíscas individuais.

4. Análise de Dados

1. Recolha de um grande número devarredura linha xt traça para avaliar a morfologia e cinética de Ca ^{2 +} faíscas parâmetros individuais, ou seja, a amplitude (F / F _0, onde F ₀ é o Ca ^{2 +} fluorescência de repouso), tempo de subida, tempo de pico, duração (FDHM , a duração total a meia magnitude), e largura espacial (FWHM, largura à meia magnitude) das faíscas gravados. Esses parâmetros representam as propriedades básicas de propagação de RYR Ca ^{2 +} canais, como o Ca ^{2 +} fluxo (amplitude), e cinética de propagação de RYRs (duração).
2. Analisar dados de imagem digital com um algoritmo semi-automático desenvolvido sob medida, que foi criado com a linguagem de processamento de imagem IDL (Interactive Data Language), como descrito anteriormente ^11,16. Porque a cinética únicas de Ca ^{2 +} solte no caso de Ca ^{2 +} induzidos faíscas em fibras FDB pelo stress osmótico, é melhor combinar as funcionalidades manuais e automáticas de Ca ^{2 +} desencadear eventosidentificação e processamento com esses programas de análise de imagem personalizada-build ^11. Este algoritmo é muito útil quando é necessário identificar manualmente ROI (região de interesse) em alguns modelos de doenças musculares. Uma vez que o ROI é definido, o algoritmo poderia derivar automaticamente os parâmetros de ignição acima mencionados, que poderiam então ser exportados para arquivo de Excel. Em alternativa, o software de processamento de imagem pública disponível, por exemplo, em SparkMaster ImageJ, pode ser usado para definir as propriedades cinéticas de Ca ^{2 +} faíscas e sua distribuição espacial no músculo esquelético ^17.

Resultados

Estudos anteriores mostraram que a tensão induzida transitória hipoosmótico Ca ^{2 +} faíscas periférica adjacente à membrana sarcolema em fibras musculares intactas ^11. Figura 1 mostra as imagens das fibras musculares individuais intactas com membrana sarcolema lisa e estrias claras características. Figura 2 mostra típico de Ca ^{2 +} faíscas (como imagens xy) foram induzidos por (100 seg) tratamento transitório com uma solução hiposmóti...

Discussão

Este método de avaliação de Ca ^{2 +} faíscas no músculo esquelético intacto é uma ferramenta útil para a fisiologia muscular e pesquisa da doença. Mostrámos que a resposta de Ca ^{2 +} de ignição foi alterada em diferentes condições, incluindo distrofia muscular ^{11 de} envelhecimento ^{18, _19,} bem como, na esclerose lateral amiotrófica ^20. Nosso estudo recente revelou também acoplamento funcional entre IP ₃ receptor e RyR representando ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation