Single-plantas, estéreis Microcosmos para a nodulação e crescimento da planta da leguminosa<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Com o rizóbio Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Resumo

Crescimento de plantas truncatula Medicago em simbiose com as bactérias fixadoras de nitrogênio meliloti Sinorhizobium em microcosmos, estéreis individuais feitas a partir de placas de laboratório padrão permite o exame freqüente de sistemas de raízes e nódulos, sem comprometer a esterilidade. As plantas podem ser mantidos em câmaras de crescimento para estes até 9 semanas.

Resumo

Bactérias simbióticas, rizóbios formar nódulos fixadores de nitrogênio nas raízes das plantas leguminosas hospedeiras compatíveis. Um dos sistemas modelo mais bem desenvolvidos para o estudo dessas interações é a planta Medicago truncatula cv. Jemalong A17 eo rizóbio bactéria Sinorhizobium meliloti 1021. Imagem repetida de raízes das plantas e de pontuação de fenótipos simbióticas requer métodos que são não-destrutivas para plantas ou bactérias. Os fenótipos simbióticas de algumas plantas e bactérias mutantes se tornam aparentes após períodos relativamente curtos de crescimento, e não necessitam de observação a longo prazo da interacção hospedeiro / simbionte. No entanto, diferenças sutis na eficiência e nódulo senescência fenótipos simbióticas que não são aparentes nos primeiros estágios do processo de nodulação exigem períodos de crescimento relativamente longo antes que eles possam ser marcado. Vários métodos têm sido desenvolvidos para o crescimento a longo prazo e observação deste par host / simbionte.No entanto, muitos destes métodos requerem rega repetidas, o que aumenta a possibilidade de contaminação por outros microrganismos. Outros métodos requerem um espaço relativamente grande para o crescimento de um grande número de plantas. O método descrito aqui, o crescimento simbiótica de M. truncatula / S. meliloti em estéreis, microcosmos uma única planta, tem várias vantagens. Plantas nestes microcosmos tem humidade e nutrientes suficientes para assegurar que a rega não é necessária para até 9 semanas, impedindo a contaminação cruzada durante a rega. Isso permite que os fenótipos de ser quantificado, que pode ser desperdiçada em sistemas de crescimento de curto prazo, tais como atrasos sutis no desenvolvimento de nódulos e nódulo senescência precoce. Além disso, as raízes e nódulos no microcosmos são facilmente visualizado através da tampa da placa, de modo que se-enraizamento das plantas por observação não é necessária.

Introdução

A interação entre a planta hospedeira leguminosa Medicago truncatula A17 ea bactéria rizóbio Sinorhizobium meliloti 1021 é um dos sistemas modelo mais tratável para o estudo do desenvolvimento de nódulos de raiz e simbiose de fixação de nitrogênio. Os genomas de ambos os parceiros simbióticas foram seqüenciados ^1,2 e ambos planta e bactéria são passíveis de manipulação genética ^3,4. Análise dos fenótipos de ambas plantas e bactérias mutantes requer a capacidade de observar as fases de desenvolvimento de nódulos e para quantificar a produtividade simbiótica com o tempo. Aqui nós descrevemos um método para a observação do desenvolvimento de nódulos de raiz de M. truncatula cv. Jemalong A17 inoculados com S. meliloti 1021 dentro de microcosmos individuais feitas a partir de padrão, rodada 100 mm de diâmetro, 15 milímetros placas de laboratório profundas (Figura 1A). O tiro é exposta e cresce através de um portal dentada no lado da placa (Figures 1B, 1C e 1E). Raízes estão contidos dentro dos microcosmos e mantida estéril, ao mesmo tempo permitindo a observação através da tampa da placa (Figura 1D). Uma vez que o rebento é acessível, o seu crescimento não é limitado e pode ser medida em intervalos periódicos, sem comprometer a esterilidade da raiz. O método de criação de microcosmos entalhado de placa foi desenvolvida originalmente por Leigh, et ​​al. ⁵ para o cultivo de plantas de luzerna, mas não foi amplamente adoptada a despeito das suas muitas vantagens sobre os outros métodos. Uma variação deste método foi também desenvolvido para a análise da interacção entre as raízes das plantas e micorrizas ^6. Temos agora adaptado e optimizado desse método para o crescimento de M. plantas truncatula. As vantagens deste protocolo mais mais frequentemente utilizados métodos estão descritos abaixo.

Existem vários métodos que estão atualmente em uso largo para estudos nodulação de M. truncatula inoculada com S. meliloti ^7. O método mais vulgarmente utilizado para a preparação em larga escala de raízes noduladas é crescimento em caixões aeroponia ^7. Neste método, as plantas são suspensas sobre um recipiente grande e raízes são arejadas com uma mistura de S. meliloti e solução nutriente ^7. Este método é prático se apenas um genótipo de S. meliloti é para ser testado. Uma vez que ele requer aerossolização de concentrações elevadas de bactérias, existe uma alta probabilidade de contaminação cruzada entre os caixões inoculados com diferentes estirpes bacterianas. Outro método que é frequentemente utilizado para preparar grandes quantidades de plantas inoculadas é o crescimento em banheiras ou vasos de perlita, vermiculita, areia ou argila calcinada que são infundidos com solução nutritiva e inoculado com S. meliloti ^7. Este método requer o uso de banheiras ou vasos abertos, e exige rega e reposição da solução nutritiva. Outra desvantagem dos vasos é que as plantasdeve ser removido a partir desta matriz de partículas, para exame das raízes e nódulos. Outra desvantagem deste método é que uma grande área de espaço da incubadora é necessária quando muitos S. diferente genótipos meliloti são para ser comparado, por um recipiente separado devem ser utilizados para cada genótipo bacteriano. O "jar Leonard" é uma variação deste método ^8,9. Um frasco de Leonard é composto por dois vasos esterilizados empilhadas uma em cima da outra e ligadas por uma mecha. O meio de crescimento é colocado no recipiente inferior e puxado através do pavio por acção capilar dentro de uma matriz de crescimento de perlite, vermiculite, areia ou argila calcinada no recipiente superior. A plântula (s) são colocados na matriz de crescimento e inoculadas com S. meliloti. Este método não necessita de rega, mas o exame das raízes e nódulos requer que a plântula ser removido da matriz de crescimento de partículas.

Existem vários métodos que permitem a análise simples de roots. Uma delas é a transparência "bolsa de crescimento" de plástico ^7. Uma desvantagem deste método é que a rega frequente é necessário uma vez que apenas ≤ 10 ml de meio líquido é óptima para o crescimento de M. truncatula em bolsas ^7. Experimentos bolsa também são normalmente limitados a ~ 2 semanas ^7, devido a avaria da torcida papel dentro da bolsa. Dois outros métodos que são vulgarmente usados ​​são semelhantes para o nosso método em que as plantas são cultivadas em agar e as raízes são visíveis, mas estes métodos também apresentam desvantagens que o nosso procedimento evita. Nestes métodos, as plantas estão completamente contidos 24,5 centímetros x 24,5 cm placas de agar seladas em torno da parte superior com fita cirúrgica poroso ou cultivadas em tubos de agar inclinado tapados por meio de tampões de algodão ou de tampas de plástico ^7. Ambos estes métodos permitem um fácil exame das raízes e pode ser mantido estéril. No entanto, os tubos de ágar inclinado são normalmente cultivadas com apenas 20 ml de ágar média ⁷ e requerem irrigação e de nutrientes addition para crescimento a longo prazo de plantas. Plantas cultivadas dentro dos 24,5 centímetros x 24,5 centímetros de ágar microcosmos placa tem umidade e nutrientes para o crescimento de longo prazo suficiente, mas o tiro crescendo rapidamente torna-se restrita dentro do microcosmo placa fechado e gás etileno podem acumular-se inibir a nodulação ^7. No processo descrito aqui, o tiro é exposta e cresce livremente fora do microcosmos contendo ~ 70 mL de meios de comunicação, permitindo que o crescimento a longo prazo.

O processo descrito aqui pode ser útil não só para o estudo de nodulação de plantas leguminosas, mas também para o estudo de fenótipos raízes de outras plantas, de tamanho médio. A diferença entre estes microcosmos e uma planta tradicional policarbonato frasco de cultura de tecidos é que as raízes em microcosmos placa descritos aqui crescer sobre a superfície vertical do agar em vez de para baixo numa camada de agar horizontal na parte inferior do frasco. Isto permite que a raiz para ser levantada da superfície de agar com um mínimo dAmage de pêlos radiculares e adesão mínima de agar à superfície radicular, o que facilita a análise dos pêlos radiculares por microscopia.

Protocolo

Realizando os passos 1, 2, 4, 6 e numa câmara de fluxo laminar estéril, é recomendado.

1. Preparação de M. truncatula A17 Mudas

Nota: M. truncatula A17 sementes utilizadas nestes estudos são produzidos sob condições de estufa refrigerado a ~ 22 ° C, ou em uma sala de crescimento das plantas mantidas a 22-26 ° C com ~ 150-400 mmol / m ^-2 s ^-1 luz.

1. Preparar placas de germinação de sementes: use 100 milímetros placas quadradas (15 mm de profundidade) e despeje autoclavado 1,1-1,2% w / v purificado agar ¹⁰ a uma profundidade de 3-5 mm. Cada placa será usado para germinar ~ 0,25-0,5 g de semente (equivalente a 63-125 sementes / placa).
   Nota: É fundamental usar células-testado cultura, agar purificado da planta para todas as placas descritos neste protocolo. O vendedor e informações de número de catálogo para o agar é listada na Tabela de Reagentes e Equipamentos específicos.
2. Escarificar / esterilizar o M. truncatula A17 sementes: Pesar sementes suficientes para o número desejado de mudas. (M. truncatula A17 sementes são ~ 4 mg cada) colocar sementes estéreis em frascos de 125 ml com tampas de folha estéreis (0,25-0,5 g de semente / balão, o que é ~ 63-125 sementes) e pipeta de 20 ml de concentrado (96%) H ₂ SO ₄ ao longo das paredes do balão.
   Nota: escarificação ácida vai esterilizar as sementes. Além disso, por pipetagem do ácido ao longo das paredes do balão, será re-esterilizar o interior do frasco, que tenha entrado em contacto com as sementes não esterilizados.
3. Quebra-se aglomerados de semente com uma pipeta de vidro esterilizado. Agitar cada frasco com frequência para 10-12 min. Pequenos, poços castanhos se tornará visível nas sementes. Estes são pequenos furos na casca da semente ^11.
   Nota: Use proteção para os olhos e luvas ao trabalhar com H ₂ SO ₄ concentrado.
4. Retirar H ₂ SO ₄ e lavar as sementes: Quando, pelo menos, 10% das sementes têm pequenas covas castanhos, ou 12 min passaram, consoantevem em primeiro lugar, remover todo o ácido dos frascos com uma pipeta de vidro esterilizado. (Resíduos ácidos lugar para uma proveta de 1-2 L contendo, pelo menos, 300 ml de água da torneira. Isto irá diluir o ácido e evitar o sobreaquecimento.) Inclinação do balão para recolher o ácido que permanece na curva do balão e usar uma pequena pipeta de vidro para remover todo o ácido restante. Se o ácido residual permanece, ele vai reagir com a água de enxágüe, aqueça as sementes e matá-los.
   1. Lavar sementes vertendo rapidamente 100 ml de água ultrapura esterilizada em cada frasco. O volume em excesso de água irá diluir o ácido e evitar o sobreaquecimento e os danos sementes durante a reacção do ácido com a água. Deitar fora a água e chama-esterilizar o lábio da garrafa.
   2. Lave as sementes 8-10x com 50 ml de água ultrapura estéril. Agitar o frasco durante cada enxaguamento. O frasco deve ser considerado estéril neste ponto e o lábio do balão deve ser inflamado antes de cada lavagem.
5. Deixe as sementes absorvem durante a noite: Após oúltimo enxágüe, coloque 50 ml de água ultrapura estéril em cada frasco, recoloque a tampa da folha estéril em cada frasco e colocar a 4 ° C no escuro durante a noite.
6. Coloque as sementes na placa germinação: Após sementes deixando absorver durante a noite, despeje a água, lavar 2x com ~ 25 ml de água ultrapura, em seguida, adicione 20 ml de água ultrapura estéril, redemoinho para voltar a suspender as sementes e despeje-os em um prato germinação agar 1,1-1,2% de passo 1.1. Se as sementes permanecem no frasco, adicione mais água e despeje novamente. Distribua as sementes de cada frasco para uma placa (63-125 sementes / placa).
   1. Agitar a placa para distribuir as sementes. As sementes devem ser distribuídas uniformemente em uma banda de 4-5 cm de uma das extremidades da placa. Este será o "top" da placa. O "fundo" 5-6 cm deve ser mantida livre de sementes (Figura 2A).
   2. Empate fora da água com uma pipeta estéril. Inclinar a placa a um ângulo de 45 ° para permitir o escoamento de água remanescente para a parte inferior da placa. Colocar a tampa sobre o tilplaca ted e proteger da luz. As placas devem ser autorizados a drenar 10-20 min. (Figura 2B).
7. Configure germinação: Retire toda a água que se acumulam na parte inferior da placa inclinada com uma pipeta estéril.
   1. Recoloque a tampa e selar a placa com parafilme. Usar luvas e manter estéril (Figura 2C).
   2. Empilhe as placas de germinação e ligue todos eles em um ângulo de 90 °. As sementes serão deitado sobre a superfície vertical do ágar. Totalmente sementes embebidas deve facilmente aderir ao ágar. As raízes irão crescer para baixo (Figura 2D).
   3. Enrole a pilha de placas de germinação em folha para bloquear a luz e manter a 25 ° C durante 3 dias.

Nota: Se germinação rendimentos para menos de 3 dias, as raízes podem ser demasiado curto para alcançar o agar em microcosmos. Se germinação procede mais de 4 dias antes da transferência para placas microcosmo, a sobrevivência das mudas iráser pobre. Se M. ecótipos truncatula ou mutantes com taxas de germinação mais lentas devem ser comparados, o ecótipo lentamente-germinando devem ser autorizados a germinar mais de 3 dias.

2. Preparação de Microcosmos Placa individuais

1. Prepare médio ¹² (ver Tabela 1 para a composição), permitindo ~ 70 mL de meio de Jensen para cada microcosmos. Prepare em jarros ou frascos que são convenientes para o rápido vazamento (não mais do que 1-2 L por jarra) e deixar uma barra de agitação magnética no jarro durante a autoclavagem.
   1. Depois de meio esfriou para ~ 55-65 ° C, foram adicionados suplementos, e pH foi verificado (ver Tabela 1), despeje em rodada 100 mm de diâmetro, 15 milímetros pratos fundos. As placas devem ser derramado ~ 0,9-1 cm de profundidade (~ 70 ml / placa).
   2. Componentes do meio de Jensen pode formar-se um precipitado turvo, de modo que é importante para retornar o jarro para a placa de agitação magnética periodicamente para evitar que os componentes se depositem. Os precipitados podem ser vistível na chapa após a sua solidificação, e não afecta o desempenho, enquanto eles estão distribuídos uniformemente entre as placas.
   3. Empilhar as placas durante o vazamento para evitar a formação de condensação sobre as tampas da placa.
2. Depois placas de Jensen ter solidificado, entalhe ambas as placas e tampas com uma espátula de peso que foi dobrado em forma de U ⁵ (Figura 3A). Aqueça a curva da espátula com um gravador até vermelhos quentes, notch 5-6 placas e, em seguida, aquecer novamente. Quando a tampa é colocada no entalhe da chapa com entalhe, isto irá criar um portal de forma oval através da qual o ramo do plântulas vão aumentar (Figura 3B). Se as placas entalhadas serão armazenados, embrulhe individualmente com filme de parafina ..

3. Preparação de Sinorhizobium meliloti culturas

Dois dias antes da inoculação das plantas, iniciar culturas de todos S. meliloti cepas a serem inoculados em mudas. Cultures devem ser cultivados em LBMC (Luria-Bertani [Miller]) ¹³ meio suplementado com 2,5 mM de _MgSO4, 2,5 mM de _CaCl2, e antibióticos apropriados (meio TY, também funciona bem). Tão pouco quanto 2-3 ml de cada cultura será suficiente.

1. Crescer a 30 ° C com agitação durante 2 dias até que as células são densos.
2. Para a maioria das vacinas de planta, fase de crescimento da S. meliloti, não é crítica. Normalmente, no final de log ou de células em fase estacionária primeiros são usados.

4. Layout de M. truncatula Mudas em Microcosmos individuais

1. Após 3 dias, abra uma placa de germinação (preparado no passo 1) e inundar imediatamente com água ultrapura estéril. Dip fórceps em etanol e brevemente chama para esterilizar. Use uma pinça estéreis para empurrar suavemente as pontas das raízes de todas as mudas sob a água para evitar o ressecamento. Raízes irão variar de 2-6 cm de comprimento. A maioria será de 3-4 cm. Selecione mudas com raízes retas e não óbviodefeitos.
2. Verifique as tampas dos microcosmos médio do Jensen para o acúmulo de condensação. Flick a tampa para remover a condensação ou substituí-lo por uma nova tampa entalhado. Se houver um excesso de condensação na tampa, a raiz das mudas podem aderir à tampa e depois morrem após a condensação seca.
3. Usando a pinça, pegue delicadamente uma muda da placa de germinação pelos cotilédones e colocar a raiz no microcosmo meio de um Jensen. Certifique-se que a ponta da raiz está em contato com o ágar.
4. Remova cuidadosamente o tegumento se ele ainda está presente. Os casacos de sementes deve ser solto após imersão em água por 5-10 min. Gentilmente provocar o tegumento com a pinça até dá jeito, e descarte. Os cotilédones e aproximadamente 0,5 cm de filmagens devem se projetar para fora do U-entalhe na placa (Figura 4A). Cuidadosamente substituir a tampa da placa, com a L-entalhe da tampa durante a muda, a criação de um portal para a plântula (Figura 4B).Definir placas de lado em pilhas horizontais até que todas as mudas foram colocadas em microcosmos.
5. Use todas as mudas de cada placa germinação que olhar viável e tem uma raiz reta. (Se possível, deixe um prato de mudas não foram abertos para usar como substitutos para mudas murchas pouco antes da inoculação.)
6. Depois de colocar para fora todas as mudas, que lhes permitam sentar-se no microcosmos do Jensen horizontal enquanto o S. suspensões do inóculo meliloti estão sendo preparados.

5. Preparação de S. meliloti inóculo Suspensões

1. Verifique S. meliloti culturas periodicamente após a inoculação para ter certeza de que eles estão crescendo. Após dois dias de crescimento, o OD ₆₀₀ deve situar-se entre 2 e 4.
2. Pipetar 0,5 ml de cada cultura para um tubo esterilizado de 1,5 mL e centrifuga-se para sedimentar. Remover o sobrenadante.
3. Lave as células duas vezes em qualquer 0,85% estéril água ultrapura NaCl ou estéril. Ressuspender as células em 0,5 ml de 0,85% steirritar NaCl ou água ultrapura.
4. Medir a OD ₆₀₀ de uma diluição de ressuspenso S. 1/10 meliloti culturas a partir do passo 5.3. Com base na leitura, efectuar uma suspensão de cada cultura em água ultrapura esterilizada em OD ₆₀₀ = 0,05. Se a densidade de células é muito alto, a nodulação pode ser inibida. Adicione o suficiente da suspensão diluída de modo a que 100 uL pode ser inoculadas em cada muda. A nebulosidade do OD ₆₀₀ = 0,05 suspensão deve ser apenas quase imperceptível a olho nu.

6. Inoculação e Selagem de Microcosmos

1. Imediatamente antes de inoculações começando, verifique se há mudas murchas que não sobreviveram a transferência para microcosmos médio do Jensen. Substitua essas mudas com mudas frescas de placas de germinação.
2. Abra cada microcosmo e inocular 100 mL da S. apropriado meliloti suspensão na raiz de mudas. Recoloque a tampa e reserve em stac horizontalks de 6-10 microcosmos. Para cada S. tensão meliloti a ser comparado, inocular pelo menos 15 plantas. Para as estirpes que têm diferenças sutis na produtividade simbiótica, inocular 30-35 plantas. Deixe pelo menos 10 plantas não inoculado como controle negativo. Inocular 30-35 plantas com S. meliloti 1021 ou outra linhagem selvagem apropriado para servir como controle positivo.
3. Após o S. suspensão meliloti teve tempo para adsorver sobre a superfície da raiz eo líquido suspensão tem embebido no agar (pelo menos 20 min.), envolva cada placa individualmente com filme de parafina. As placas devem ser embrulhados até à borda da fossa, mas o filme de parafina não deve bloquear o crescimento da muda (Figura 4C).
4. No momento do envolvimento, fazer uma verificação final para raízes aderidas ao interior da tampa da placa. Para remover raízes aderidas da tampa, colocar a placa plana no banco e tocar ou apertar a tampa para bater a raiz de volta para a agar surface.
5. Alinhe os portais de mudas de cada pilha de 6-10 placas. Coloque a pilha num ângulo de 90 ° com as mudas apontando para cima (Figura 4D). A viscosidade do filme parafina vai realizar as placas no lugar o tempo suficiente para envolver toda a pilha em papel alumínio, deixando uma faixa de 1-2 cm desembrulhou onde as mudas emergir (Figura 4E). A folha vai proteger as raízes da luz.
6. Coloque os envolvidos folha pilhas em câmara de crescimento iluminada ou sala de crescimento a 21-25 ° C, 60-70% de umidade relativa e 100-175 mmol / m ^-2 s ^-1 luz em um ciclo de 16 escuro luz hr / 8 horas ( Figura 1A). Sob estas condições de crescimento, a incubação prolongada a níveis de luz superior a 200 umol / m ^-2 s ^-1 podem ter um efeito prejudicial sobre o crescimento da planta.

7. O exame do sistema radicular e quantificação de simbióticas fenótipos

As plantas podem ser mantidos nomicrocosmos para até 9 semanas.

1. Número de nódulos pode ser quantificado em uma série de pontos de tempo por retirar a folha de cada pilha e contando nódulos. Desenvolvimento de nódulos nas plantas inoculadas com S. meliloti 1021 tipo selvagem são aparentes por 10-14 dias após a inoculação.
2. Produtividade simbiótica também pode ser medido em cada ponto de tempo, medindo o comprimento do rebento emergente.
3. Quantificação final de produtividade simbiótica é normalmente realizada em 7 semanas após a inoculação por retirar a parte aérea e medir a massa fresca da parte aérea. Esta etapa pode ser realizada mais tarde e 9 semanas, se o crescimento for mais desejado.

Resultados

A preparação e inoculação desses microcosmos placa é relativamente simples em comparação com a maioria dos outros métodos descritos na introdução. O uso desses microcosmos também permite o crescimento das plantas prolongada (até 9 semanas) sem rega ou a suplementação de nutrientes, manutenção da esterilidade de raiz, tanto fácil exame de raízes e proteção das raízes da luz, o crescimento sem restrições da parte aérea, de fácil acesso para a parte aérea para medição do comprimento, e a remoç?...

Discussão

Há várias etapas do protocolo que são críticos para o sucesso: 1) A necessidade do uso de purificada, planta de célula de cultura testados agar não pode ser subestimada. Este não é crítica para plântulas de alfafa, mas que é crucial para o crescimento de M. truncatula A17. 2) É importante para germinar sobre placas de agar de mudas verticais como descrito no Passo 1. A técnica amplamente utilizada de germinação de mudas em uma superfície horizontal invertida em uma placa de 15 milímetros de pro...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar purified, plant cell culture-tested	Sigma	A7921