In situ TEM de Assembleias Biológicas em Líquido

Resumo

Aqui descrevemos um procedimento para imagem de complexos virais em liquidez em resolução de nanômetros usando um microscópio eletrônico de transmissão.

Resumo

Os pesquisadores usam regularmente microscópios eletrônicos de transmissão (TEMs) para examinar entidades biológicas e avaliar novos materiais. Aqui, descrevemos uma aplicação adicional para esses instrumentos: visualização de conjuntos virais em um ambiente líquido. Este excitante e novo método de visualização de estruturas biológicas utiliza um suporte de espécimes de base microfluidic recentemente desenvolvido. Nosso artigo em vídeo demonstra como montar e usar um suporte microfluido para imagem de amostras líquidas dentro de um TEM. Em particular, usamos partículas de rotavírus de dupla camada (DLPs) como nosso sistema modelo. Também descrevemos passos para revestir a superfície da câmara líquida com biofilmes de afinidade que amarram DLPs à janela de visualização. Isso nos permite fazer assembleias de imagem de forma adequada para a determinação da estrutura 3D. Assim, apresentamos um primeiro vislumbre de partículas subvirais em um ambiente líquido nativo.

Introdução

Um objetivo comum de biólogos e engenheiros é entender o funcionamento interno das máquinas moleculares. Os microscópios eletrônicos de transmissão (TEMs) são instrumentos ideais para visualizar esses detalhes intrincados na resolução quase atômica^1-2. Para sustentar o sistema de alto vácuo de um TEM, as amostras biológicas são tipicamente incorporadas em pelíneas de gelo vítreo³, açúcares^4,sais de metal pesado⁵, ou alguma combinação de⁶. Como resultado, imagens de espécimes incorporados podem revelar apenas instantâneos limitados de processos dinâmicos.

As primeiras tentativas de manter espécimes biológicos hidratados em câmaras de líquidos ambientais foram realizadas por Parsons e colegas utilizando estágios diferenciais de bombeamento. Padrões de difração eletrônica de cristais catalase não manchados foram registrados com sucesso em uma resolução de 3 Å em um estado hidratado^7-8. Além disso, domínios lipíduos separados em fases poderiam ser examinados em membranas hidratadas de eritrócitos humanos^9-10. No entanto, o movimento causado pela difusão do líquido e sua interferência com o feixe de elétrons, resultou em perda severa de resolução e outros experimentos usando espécimes biológicos não foram tentados até recentemente.

Recém-desenvolvidos foram introduzidos portadores de amostras microfluidas que utilizam microchips semicondutores para formar uma câmara ambiental microes em escala. Estes dispositivos podem manter amostras em líquido enquanto estão posicionados em uma coluna TEM^11-12. Esse avanço técnico na imagem TEM permitiu que os pesquisadores vissem, pela primeira vez, eventos progressivos no nível molecular¹³. Referimo-nos a esta nova modalidade como " microscopia molecularin situ", pois os experimentos agora podem ser realizados "dentro" da coluna EM^14-15. O objetivo geral deste método é imaginar conjuntos biológicos em líquido, a fim de observar seus comportamentos dinâmicos na resolução de nanômetros. A lógica por trás da técnica desenvolvida é registrar observações em tempo real e examinar novas propriedades do maquinário biológico em solução. Essa metodologia amplia o uso de TEMs para fins mais amplos em biologia celular e molecular^12-16.

No artigo de vídeo atual, apresentamos um protocolo abrangente para montar e usar um suporte de espécime microfluidic comercialmente disponível. Esses suportes especializados utilizam microchips de nitreto de silício produzidos com espaçadores integrados para formar uma câmara líquida que inclua volumes minuciosos de solução. Janelas finas e transparentes são gravadas nos microchips para fins de imagem¹². Demonstramos o uso adequado de um suporte microfluido para examinar partículas de rotavírus de dupla camada (DLPs) em camadas sídicas em líquido usando um TEM. Para garantir que os conjuntos biológicos, como os DLPs, não se difundam rapidamente em grandes distâncias durante a imagem, empregamos a abordagem Affinity Capture para amarrá-los à superfície da câmara microfluidica¹⁶. Esta etapa de captura molecular tem uma grande vantagem sobre técnicas alternativas para imagens de amostras biológicas em líquido, pois permite a aquisição de imagens que serão usadas para rotinas de processamento a jusante. Esta etapa de captura usada em conjunto com a imagem microfluidica é exclusiva dos nossos procedimentos¹⁷. Os leitores que utilizam aplicações de biologia estrutural usando câmaras de imagem TEM ou microfluidic podem considerar o uso de técnicas de captura de afinidade quando observações dinâmicas no nível molecular são o objetivo final.

Protocolo

1. Prepare os dispositivos de captura de afinidade¹⁶

1. Limpe o nitreto de silício E-chips incubando-os em 15 ml de acetona por 2 min seguido por 15 ml de metanol por 2 min(Figura 1A). Deixe os chips secarem sob o fluxo de ar laminar.
2. Incubar os chips secos em uma placa de agitação aquecida (sem mexer) durante 1,5 h a 150 °C, em seguida, deixe esfriar até a temperatura ambiente antes de usar.
3. Use seringas Hamilton para compor misturas lipídicas em pequenos tubos de vidro para conter 25% de clorofórmio, 55% DLPC (1,2-dilauroyl-fosfocolina) em clorofórmio (1 mg/ml) e lipídio ni-NTA de 20% (1,2-dioleoyl-iminodiacético ácido-succinyl-sal) em clorofórmio (1 mg/ml) para um volume total de 40 μl.
4. Aplique uma alíquota de 1 μl da mistura sobre cada gota de 15 μl de água Milli-Q em um pedaço de Parafilm em uma placa de Petri úmida(Figura 1B). Incubar amostras no gelo por pelo menos 60 minutos.

2. Capturar macromoléculas¹⁷

1. Coloque um E-chip com um espaçador integrado de 150 nm em cima de uma amostra de monocamadas e incubar por 1 min(Figura 1C).
2. Retire suavemente o chip da amostra e adicione uma alíquota de 3 μl de Proteína A. Incubar por 1 min a temperatura ambiente(Figura 1D).
3. Limpe a gota de excesso usando o Whatman #1 papel filtro e adicione imediatamente uma alíquota de 3 μl de solução de anticorpos. Incubar por 1 min a temperatura ambiente.
4. Remova a solução em excesso usando uma seringa Hamilton e adicione imediatamente uma alíquota de 1 μl de DLPs rotavírus (0,1 mg/ml) em solução tampão contendo HEPES de 50 mM (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ e 10 mM CaCl₂. Incubar por pelo menos 2 minutos em temperatura ambiente. A preparação dos DLPs foi descrita anteriormente¹⁸.

3. Monte a Câmara Microfluiídica e Carregue o Porta-Espécimes In situ

1. Carregue o e-chip molhado contendo a amostra viral na ponta do suporte da amostra microfluida. Descarregue um segundo e-chip plano por 1 min e depois carregado em cima do chip espaçador(Figura 2, painéis 1-5).
2. Alternativamente, para aumentar o contraste das macromoléculas biológicas, a mancha de metal pesado (por exemplo, 0,2% de formação de urano) pode ser adicionada a espécimes molhados antes de colocar o segundo e-chip no espécime molhado. No entanto, o e-chip contendo o espécime precisará ser lavado com água Milli-Q antes de adicionar o reagente de contraste.
3. Sanduíche toda a montagem para formar um gabinete selado, mantido no lugar mecanicamente dentro do suporte por 3 parafusos de latão (Figura 2, painéis 6-8).
4. Após o montagem, a ponta do suporte é bombeada para 10^-6 Torr usando uma estação de bombeamento a seco turbo-bombeada antes de colocar o suporte dentro do TEM.

4. Imagem em líquido usando um microscópio eletrônico de transmissão

1. Carregue o porta-espécimes in situ em um microscópio eletrônico de transmissão (FEI Company) equipado com um filamento LaB₆ e operando a 120 kV.
2. Ligue o filamento TEM e ajuste a altura eucêntrica do estágio do microscópio em relação à amostra usando a função wobbler para inclinar a amostra de -15° para +15° para frente e para trás na coluna. Este procedimento ajusta o estágio na direção z para ajudar a explicar a espessura adequada da câmara líquida. Esta etapa também garante que uma ampliação precisa seja usada ao gravar imagens.
3. Registo as imagens ao longo das bordas e nas regiões do canto da câmara microfluidica primeiro. Essas áreas normalmente contêm a solução mais fina. Registo imagens de amostras em condições de baixa dose (1-3 elétrons/Ų) usando uma câmera CCD. Use ampliações nominais de 6.000X - 30.000X.
4. Determine o valor adequado do desfoco focando na borda da câmara fluida. Use um valor de -1,5 μm para gravar imagens a 30.000X de ampliação. Se a solução espessa for encontrada ou se o agente de contraste não for usado na preparação da amostra, use valores de desfoco mais elevados na faixa de -2 a -4 μm.
5. Para garantir que a solução esteja contida na câmara microfluida durante os experimentos, concentre o feixe de elétrons até que as bolhas sejam formadas no líquido dentro do dispositivo.

Resultados

Imagens representativas de DLPs em líquido usando E-chips que foram descarregadas por brilho(Figura 3A) mostram menos DLPs em uma determinada área de visualização, presumivelmente devido à difusão, em comparação com DLPs que são enriquecidos em dispositivos affinity capture(Figura 3B). A adição de formato de urano na câmara de imagem aumenta o contraste da amostra e, consequentemente, a visibilidade de DLPs individuais na solução(Figura 3C, painel superior)...

Discussão

Em nosso trabalho apresentado, utilizamos a abordagem de captura de afinidade para dLPs rotavírus de tether para uma plataforma microfluida. Isso permitiu imagens in situ de complexos macromoleculares em um microambiente líquido. A abordagem de captura é significativa em relação a outras técnicas de imagem microfluidica, pois localiza espécimes biológicos na janela de imagem para negar grandes problemas difusivos que surgem durante a gravação de imagens em líquido. No entanto, uma das ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
E-chips, spacer chip	Protochips, Inc.	EPB-52TBD	400 μm x 50 μm window
E-chip, top chip	Protochips, Inc.	EPT-45W	400 μm x 50 μm window
Ni-NTA lipid	Avanti Polar Lipids	790404P	Powder form
DLPC (12:0) lipid	Avanti Polar Lipids	850335P	Powder form
Volumetric flasks	Fisher Scientific	20-812A; 20-812C	1 ml; 5 ml
Hamilton Syringes	Hamilton Co.	80300, 80400	1-10 μl; 1-25 μl
Whatman #1 filter paper	Whatman	1001 090	100 pieces, 90 mm
Glass Petri dishes	Corning	70165-101	100 mm x 15 mm
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-010	14673-010
Glass culture tubes	VWR	47729-566	6 mm x 50 mm
Acetone	Fisher Scientific	A11-1	1 L
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	1 L
Chloroform	Electron Microcopy Sciences	12550	100 ml
His-tagged Protein A	Abcam, Inc.	ab52953	10 mg
Milli-Q water system	EMD Millipore Corp.	Z00QSV001	Ultrapure Water
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	500 g
Equipment
Poseidon In situ specimen holder	Protochips, Inc.		FEI compatible
FEI Spirit BioTwin TEM	FEI Co.		120 kV
Eagle 2k HS CCD camera	FEI Co.		10 Å/pixel sampling at 30,000X
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		Pump holder tip to 10-6 range
PELCO easiGlow, glow discharge unit	Ted Pella, Inc.		Negative polarity mode
Isotemp heated stir plate	Fisher Scientific		Heat to 150 ºC for 1.5 hr