VIGS Mediada frente Triagem Genética para identificação de genes envolvidos na resistência não hospedeiras

Resumo

Induzida por vírus silenciamento de genes é uma ferramenta útil para a identificação de genes envolvidos na resistência de plantas não hospedeiras. Nós demonstramos o uso de bactérias patogênicas que expressam GFPuv em identificar plantas silenciados genes suscetíveis a agentes patogênicos não hospedeiras. Esta abordagem é simples, rápido e facilita a triagem em grande escala e protocolo semelhante pode ser aplicado ao estudo de várias outras interacções planta-microorganismo.

Resumo

Resistência à doença de plantas não hospedeiras contra agentes patogénicos bacterianos é controlada por caminhos de defesa complexos. Compreendendo este mecanismo é importante para o desenvolvimento de plantas resistentes a doenças duráveis ​​contra vasta gama de agentes patogénicos. Induzida por vírus silenciamento gênico (VIGS) baseado frente triagem genética é uma abordagem útil para a identificação de genes de defesa da planta transmitindo resistência não hospedeiras. Tobacco rattle virus (TRV) baseado VIGS VIGS vetor é o vetor mais eficiente até o momento e tem sido utilizado de forma eficiente para silenciar genes alvo endógenos em Nicotiana benthamiana.

Neste artigo, demonstramos uma abordagem de triagem genética para a frente para o silenciamento de clones individuais a partir de uma biblioteca de cDNA em N. benthamiana e avaliar a resposta das plantas silenciados genes de resistência não hospedeiras comprometida contra patógenos não hospedeiras, Pseudomonas syringae pv. tomate T1, P. syringae pv. GlycINEA e X. campestris pv. vesicatoria. Estes patógenos bacterianos são manipuladas para expressar a proteína e as suas colónias GFPuv fluorescente verde pode ser visto a olho nu sob luz UV nas plantas não hospedeiras patogénicos inoculados se o gene alvo silenciada está envolvida na transmissão de resistência não hospedeiras. Isso facilita a identificação mais rápida e confiável de plantas silenciadas genes suscetíveis a agentes patogênicos não hospedeiras. Além disso, informações gene candidato promissor pode ser conhecido por seqüenciamento a inserção de genes de plantas em TRV vetor. Aqui demonstramos a elevada capacidade de transferência genética de frente VIGS mediadas para identificar genes envolvidos na resistência não hospedeiras. Aproximadamente, 100 cDNAs pode ser silenciado individualmente em cerca de duas a três semanas, e a sua relevância não hospedeiras na resistência contra vários agentes patogénicos bacterianos não hospedeiras pode ser estudado em uma semana depois. Neste artigo, vamos enumerar os passos detalhados envolvidos neste rastreio. Frente VIGS mediada genética screening abordagem pode ser estendido, não só para identificação de genes envolvidos na resistência não hospedeiras, mas também para estudar os genes comunicando várias tolerâncias de stress bióticos e abióticos em várias espécies de plantas.

Introdução

Resistência não hospedeiras é a resistência de todas as espécies de plantas contra as corridas de ^1,2 patógeno particular. Isto dá amplo espectro e resistência a doenças em plantas durável ^2,3. No entanto, o seu mecanismo, em particular contra patógenos bacterianos, não é bem compreendido ^4. Triagem para mutantes ou plantas silenciadas que a resistência não hospedeiras compromisso, e alta taxa de transferência de perfis transcrição para a identificação de genes diferencialmente expressos durante a resistência não hospedeiras ^5-9 são duas abordagens principais usadas anteriormente para dissecar a resistência bacteriana não hospedeiras. Como a resistência não hospedeiras é controlada por um mecanismo complexo (s) ⁴ com o envolvimento de vários genes, uma abordagem funcional genómico de alto rendimento para a identificação de genes é essencial para uma melhor compreensão do mecanismo de resistência não hospedeiras (s).

Induzida por vírus silenciamento do gene (VIGS) tem sido utilizada com sucesso para silenciar planta endógenogenes em muitas espécies de plantas ^10,11. Nicotiana benthamiana é uma das melhores plantas adequadas para VIGS ^10,12 e seu projecto de seqüência do genoma já está disponível ^13. vírus chocalho do Tabaco (TRV) baseados VIGS tem sido amplamente utilizado como ferramenta genética reversa para caracterizar genes envolvidos na resistência não hospedeiras ^2,4,14. Este VIGS vetores e derivados estão agora disponíveis através Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC, http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ). VIGS também tem sido usada como ferramenta genética para a frente para a identificação de genes envolvidos na imunidade ^15-17 planta, especialmente resistência não hospedeiras ^6,18. Avaliação da resposta de hipersensibilidade (HR) mediada por morte celular induzida por plantas não hospedeiras contra um agente patogénico específico e avaliando a morte celular induzida pela doença são dois importantes ensaios utilizados principalmente para IDENTIFICARgene silenciado plantas susceptíveis g. No entanto, a morte celular HR é induzida apenas contra tipo II patógenos não hospedeiras e não contra os do tipo I não hospedeiras patógenos ^2. Assim, ensaios de RH não pode ser universalmente utilizado para identificar estratégias de resistência não hospedeiras utilizadas pelas plantas, especialmente contra ampla gama de tipo I não hospedeiras patógenos. Além disso, a perda parcial da resistência não hospedeiras em um gene da planta silenciada nem sempre conduz a sintomas da doença e, consequentemente, ⁶ marcar a doença não pode ser utilizado para a identificação de plantas não hospedeiras comprometer a resistência. Em contrário, a avaliação do crescimento de agentes patogénicos em plantas não hospedeiras silenciados genes é um método melhor para estudar a perda de resistência nas plantas não hospedeiras de genes silenciados.

Comparado ao ensaio de crescimento convencional ^6,19, um método mais rápido para avaliar o crescimento bacteriano nas plantas não hospedeiras de genes silenciados pode encurtar o tempo necessário para a frente de triagem genética. Nós relatamos anteriormente um método para observar bactériasl crescimento do patógeno em folhas por olho nu sob luz ultravioleta (UV) utilizando bactérias expressando a proteína fluorescente verde (GFP) ^19. Neste artigo, procuramos demonstrar a utilidade de GFPuv expressar patógenos bacterianos não hospedeiras para facilitar a identificação de plantas silenciadas genéticas que são comprometidos pela resistência não hospedeiras. Esta metodologia é preciso para identificação de plantas suscetíveis e passíveis de triagem em alta velocidade.

Protocolo

1. Crescimento da planta e Target Gene Silenciando

1. Condições de crescimento da planta:
   1. Semear N. sementes benthamiana em solo-less mistura envasamento, Metro-Mix 350 e germinar as sementes em uma câmara de crescimento. Qualquer outro solo ou o solo menos meio também pode ser usado em vez de Metro-Mix.
   2. Transplante de três semanas de idade plântulas em vasos individuais e elas crescem numa estufa mantida a 21 ± 2 ° C, juntamente com outras condições de crescimento, conforme detalhado na literatura anterior ^12. Dois a três dias após o transplante, as plantas podem ser usadas para TRV inoculação.
2. Crescer TRV2 clones:
   TRV é um vírus bipartido e o seu genoma consiste em RNA1 e RNA2. RNA1 codifica para uma RNA polimerase dependente de RNA e de uma proteína de movimento ^20,21. RNA2 codifica uma proteína capsidial (CP) e duas proteínas não estruturais dos RNAs subgenômico ^21. Ambos RNA1 e RNA2 são necessários para a formação de vir amadurecidonós, partículas e sua propagação ^20,21. Construção da biblioteca de cDNA em TRV2 vector é descrito na literatura anterior, ^22,23. Resumidamente, a biblioteca VIGS utilizada neste estudo foi construído a partir do RNA extraído de tecidos de folhas expostas a vários eliciadores bióticos e abióticos.
   1. Retire Agrobacterium (estirpe GV2260) contendo os clones de cDNA no vector TRV2 (uma placa de 96 poços) a partir do congelador. Gradualmente o descongelamento e depois das culturas atingirem a temperatura ambiente, inocular a cultura de Agrobacterium indivíduo em Luria-Bertani (LB) em placa de ágar com rifampicina (10 ug / ml) e canamicina (50 ug / ml), utilizando um replicador de 96 pinos.
   2. Incubar as placas a 28 ° C durante dois dias. Nós geralmente crescem quatro colônias idênticas para cada clone para que inóculo Agrobacterium adequada está disponível para inoculação picada de duas plantas. Executar todas as etapas sob condições estéreis.
3. VIGS:
   1. CrescerAgrobacterium (GV2260) transportando TRV1 a 28 ° C em meio líquido LB com os antibióticos acima mencionados. Células colheita por centrifugação, a partir de culturas crescidas durante a noite, re-suspensão no tampão de inoculação (MES 10 mM, pH 5,5, 200 mM acetosiringona), e incubar durante 3 horas a temperatura ambiente num agitador a 50 rpm.
   2. Colher as células por centrifugação e re-suspensão em 5 mM de tampão MES (pH 5,5) e inocula _(DO600 = 0,3) para o lado abaxial 3-4 N. benthamiana folhas, utilizando uma seringa sem agulha. Procedimento de inoculação pormenorizadas demonstrado na literatura anterior ^24. Mais tarde, no local da inoculação TRV1, inocular respectivos TRV2 colônias por picar as folhas com um palito.
   3. Manter as plantas com nutrição adequada como o crescimento vigoroso é importante para VIGS eficientes ^12. Cerca de duas semanas após a inoculação, as transcrições de genes-alvo vai começar a reduzir e as plantas estão prontas para INOC patógenomento de três semanas após a inoculação de TRV.

2. Preparação das culturas não hospedeiras de patógenos e plantas de inoculação

1. Detalhes de patógenos utilizados neste estudo:
   Pseudomonas syringae pv. Tabaci, P. syringae pv. tomate T1, P. syringae pv. glycinea e Xanthomonas campestris pv. vesicatória são usadas neste estudo. Crescer P. estirpes syringae em King B (KB) meio líquido suplementado com rifampicina (10 ug / ml), canamicina (50 ug / ml) a 28 ° C durante 12 horas. Crescer X. campestris pv. vesicatoria em meio líquido LB por 16 horas. Todos os agentes patogénicos abrigar um plasmídeo que pode expressar GFPuv conforme descrito na literatura anterior ^19.
2. Preparação das culturas de patógenos para inoculação em plantas:
   1. Colher as células bacterianas por centrifugação e confirmar a presença de fluorescência verde usando longo walâmpada UV velength no escuro. Lave as células duas vezes com água esterilizada e re-suspender-los para a concentração desejada com água estéril.
   2. Inocular o respectivo patógeno (s) sobre a face abaxial de folhas de genes silenciados alvo (5 ^ª a 8 ^ª) como pontos (cerca de 1,5 cm de diâmetro). Vários patogénios não hospedeiras podem ser testadas simultaneamente para o seu crescimento em plantas do gene alvo silenciada. Simultaneamente inocular o patógeno hospedeiro como este pode ser usado como um controlo positivo para a visualização do crescimento bacteriano planta. Também inocular o controle de vetores (TRV :: 00) plantas.

3. Observação da planta em crescimento de patógenos bacterianos

1. Expor as folhas inoculadas com uma luz UV de comprimento de onda longo no escuro. Colônias bacterianas podem ser vistos como pontos verdes fluorescentes no lado abaxial da folha no fundo de fluorescência vermelha emitida pela superfície da folha.
2. Observar o crescimento do patógenode dois dias após a inoculação (dpi) para 5 dpi. Observação de todos os dias, durante este intervalo de tempo é necessário.
3. Depois da primeira tela, a lista curta dos clones cuja silenciamento resulta em crescimento de um ou mais agentes patogénicos não hospedeiras (s).
4. Repita VIGS para os clones seleccionados e novamente testar a resposta das plantas de genes silenciados para patógeno não hospedeiras (s). Este segundo nível de triagem é feito para remover os falsos positivos obtidos durante a primeira tela.

4. Confirmação de plantas pré-seleccionados para a Resistência não hospedeiras comprometida

1. Silenciem os clones de ADNc seleccionados a partir do ecrã, como descrito acima. Inocular com a planta inteira patógeno não hospedeiras (s), submergindo as plantas com as respectivas culturas de organismos patogénicos, com 0,01% (v / v), Silwet L-77 e sujeitando as plantas submersas a vácuo durante 3 - 5 min. Quantificar o crescimento bacteriano pelo ensaio de crescimento de ^6,18,19 convencional tal como descrito abaixo.
2. Em 0 horas após a inoculação (hpi),3 dpi e 5 dpi, coletar duas amostras de folhas de cinco repetições biológicas para cada patógeno não hospedeiras (s) folhas inoculadas utilizando um soco folha (0,5 centímetros ^2). Moer as amostras de folhas, diluído em série e a placa de seiva KB em meio de agar suplementado com antibióticos adequados e incubar a 28 ° C durante 2 dias. Contar as colónias de bactérias, utilizando um contador de colónias e calcular o crescimento de bactérias nas folhas, como descrito na literatura anterior ^6.
3. As plantas não hospedeiras suscetíveis ao patógeno (s) deve mostrar maior número de crescimento do patógeno em relação ao controle de vetores.

5. Seqüenciamento do Insert e Identificação de gene alvo

1. Realizar PCR de colónias para o clone seleccionado utilizando attB1 e attB2 iniciadores ou utilizando iniciadores que flanqueiam o local de clonagem no vector TRV2. Executar o produto de PCR em gel e vá para a amplificação de uma única banda.
2. Inserção de genes de plantas no vetor TRV2 podem ser seqüenciados usando attBiniciadores ou primers flanqueando o sítio de clonagem.
3. Realize BLAST usando a seqüência e identificar os detalhes do gene.
4. Obter seqüência de gene de corpo inteiro junto com as regiões não-traduzidas (UTRs).
5. Selecione 300-400 bp fragmentos de três regiões diferentes da seqüência e cloná-los em TRV2 vetor. Independentemente realizar VIGS usando todos os três VIGS construções e confirmar o compromisso da resistência não hospedeiras em todas as três plantas de genes silenciados.

Resultados

Principal objetivo deste estudo é demonstrar um método para a identificação fácil e precisa de gene silenciado N. benthamiana plantas que estão comprometidos para a resistência não hospedeiras. Existem quatro principais etapas desta metodologia. O primeiro passo é o silêncio individualmente grande número de genes usando TRV-VIGS. Nós tínhamos cerca de 5000 genes silenciados ^6,18 ao longo de um período de cerca de 1,5 anos, usando o protocolo ilustrado na Figura 1. Algum...

Discussão

Imunidade da planta limita o crescimento de patógenos não hospedeiras e, portanto, pouca ou nenhuma fluorescência verde é emitido a partir de plantas controle do vetor folhas inoculadas com patógeno não hospedeiras sob luz UV de comprimento de onda longo (Figura 3D). No entanto, quando um gene envolvido na resistência não hospedeiras é silenciada, as plantas de genes silenciados favorecer o crescimento do patógeno e fluorescência verde é visto não hospedeiras (Figura 3E). E...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well U-bottom plates	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)	35-3077
96-pin replicator stainless steel	Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)	250520
High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap	Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)	6283K50	Manufacturer ID 95-0127-01
Stuart SC6 colony counter	Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK	SC6PLUS
Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350	SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)	Custom synthesized
MES, Monohydrate	VWR international (Radnor, PA, USA)	CAS No. 145224-94-8
Acetosyringone (Dimethoxy-4’-hydroxyacetophenone)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)	Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)	VIS-30