Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Resumo

A Listeria monocytogenes é uma bactéria patogénica gram positiva frequentemente utilizado como um importante modelo para o estudo de parasitismo intracelular. Imagiologia tarde L. monocytogenes fases de infecção dentro do contexto de telas de ARN pequenos interferentes permite o estudo global de vias celulares necessários para a infecção bacteriana de células hospedeiras alvo.

Resumo

Patógenos intracelulares bacterianas podem ser concebidas como ferramentas moleculares para dissecar as cascatas de sinalização celular, devido à sua capacidade de manipular requintadamente e subverter as funções das células que são necessários para a infecção dos tecidos-alvo do hospedeiro. Entre estes agentes patogénicos bacterianos, Listeria monocytogenes é um microrganismo gram-positivo que tem sido usada como um paradigma para parasitismo intracelular na caracterização das respostas imunes celulares, e que tem desempenhado as funções instrumentais na descoberta de vias moleculares que controlam citoesqueleto e membrana dinâmica de tráfico. Neste artigo, os autores descrevem um ensaio microscópico robusto para a detecção de níveis de infecção celular final de L. monocytogenes baseado na marcação fluorescente do inLC, uma proteína bacteriana segregada que se acumula no citoplasma de células infectadas, o ensaio pode ser acoplado a high-throughput telas pequenas automatizados ARN interferentes, de modo a characterize vias de sinalização celular envolvidas no cima ou para baixo-regulação da infecção.

Introdução

A bactéria Gram positiva Listeria monocytogenes é um agente patogénico de origem alimentar que invade células hospedeiras, interrompe a sua internalização vacúolo e replica-se no citoplasma das células hospedeiras ^1. L. monocytogenes facilidade de manipulação no âmbito de laboratório (crescimento rápido, uma baixa toxicidade para os indivíduos saudáveis) associada à persistência de traços de virulência da bactéria observadas em modelos celulares e animais (actividade hemolítica, leucocitose) permitiu o seu uso inicial em 1960 como um modelo para a maior o estudo do parasitismo intracelular e para o estabelecimento dos fundamentos teóricos da imunidade celular contra a infecção ^2. No final de 1980 e início de 1990, a dissecação do ciclo intracelular bacteriana ^3, bem como a caracterização molecular da virulência bacteriana mais importante fatores ^4-7 favoreceu o uso de L. monocytogenes como ferramenta molecular chave para a manipulação e cravoy de funções da célula hospedeira. A presença de avirulent (L. innocua) e (L. monocytogenes) espécies virulentas do gênero Listeria pavimentou o caminho para estudos genômicos comparativos ⁸ que, juntamente com a recente criação da L. completo monocytogenes transcriptoma ^9, aumentamos nossa compreensão da evolução de L. Listeria como um patogénico humano e como um sistema modelo para estudos de infecção ^{de 10.}

L. monocytogenes induz sua internalização em células hospedeiras após a interação das proteínas da superfície bacteriana inla e inlB com seus receptores da célula hospedeira E-caderina e MET, respectivamente ^11-12. Estudos de base candidata inicial levou à identificação de uma ligação cateninas-actina α / β como um componente significativo da via ^inla-13 e invasão da fosfoinositida 3-quinase (PI 3-K) como um efector crucial do inlB- dependente casca invasãode ^14-15. Ensaios de proteômica e baseados em funcional, posteriormente, permitiu a identificação de novos elementos do citoesqueleto ¹⁶ e lipídios segundos mensageiros ¹⁷ necessários para a invasão da célula hospedeira. Estudos de transcrição ¹⁸ e proteômica baseada em espectrometria de massa quantitativos ¹⁹ lançaram recentemente uma nova luz sobre a ativação da sinalização de acolhimento cascatas ea repressão da resposta imune durante L. monocytogenes infecção. Biologia de sistemas abordagens baseadas na inativação de grandes conjuntos de genes (kinomes, genomas completos) por pequeno RNA de interferência (siRNA) silenciamento abriram recentemente novos caminhos para a análise do acolhimento global de cascatas de sinalização no contexto de funções celulares específicas, incluindo a fagocitose e patógeno internalização ^20. Telas siRNA Genome-wide foram previamente realizados para investigar cascatas celulares necessários para a infecção de L. monocytogenes em fagocitária Drosophila ^21-22 células S2, mas este tipo de análise não foi realizada em células não fagocíticas, que representam alvos importantes para a infecção in vivo.

Nós otimizamos um protocolo para a detecção microscópica dos estágios finais da infecção por L. monocytogenes, que é adequada para estudos de alta produtividade siRNA de entrada de bactérias no interior das células epiteliais. Nosso ensaio se aproveita de uma L. altamente invasivo monocytogenes cepa que apresenta uma mutação pontual na PrfA, o principal regulador da transcrição de L. monocytogenes virulência ^6: esta mutação (chamado PrfA *) torna PrfA constitutivamente activa ²³ e conduz a um aumento da expressão das proteínas de invasão inla inlB e, portanto, favorecer a entrada de bactérias em células não fagocíticas outro modo mal infectados. A nossa leitura de infecção baseia-se na detecção da acumulação citosólica do inLC proteína bacteriana segregada: esta molécula éum efector pleiotrópico que é expressa preferencialmente pelas intra-citoplasmático L. monocytogenes ⁹ e que não só participa na célula-a-célula bacteriana espalhar ^24, mas que também modula as respostas imunitárias do hospedeiro ^25. A marcação fluorescente de secreção inLC por bactérias intracelulares não só permite distinguir claramente infectada a partir de células não-infectadas, mas também representa uma leitura de ponto final que pode ser usada para dissecar posteriormente infecção em suas diferentes etapas: entrada, escape vacuolar, citosólica bacteriana proliferação e disseminação célula-a-célula. Este protocolo baseado em microscopia pode ser acoplado a telas de siRNA, por conseguinte, para estudar vias celulares envolvidas na infecção de células hospedeiras por L. monocytogenes.

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Protocolo

1. Preparação de culturas celulares e bacterianos, ferramentas de transfecção e Anticorpos Primários

1. Prepare uma placa de ágar fresco para isolar L. indivíduo monocytogenes colónias a partir de um estoque de glicerol bacteriana (50% glycerol/50% saturada de cultura durante a noite de bactérias líquido) mantida a -80 ° C.
   1. Usando uma cremalheira de alumínio (mantidos à temperatura de -80 ° C) para o transporte de um estoque de glicerol congelado de bactérias, bactérias estrias sobre uma infusão de cérebro e coração (BHI) em placas.
   2. Incubar a placa a 37 ° C durante 48 horas (ou até que as colónias bacterianas individuais podem ser isoladas).
   3. Manter esta placa a trabalhar depois a 4 ° C durante um período máximo de 1 mês (isto irá ser usado para semear culturas líquidas).
   4. Em nosso protocolo, usamos a L. monocytogenes sorotipo 1/2a EGDe.PrfA * estirpe, mas como ilustrado na Figura 1, o L. monocytogenes sorotipo 4b P14.PrfA * tensão dá resultados semelhantes.
2. EleAs células ATCC CCL2 La são cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) na ausência de antibióticos.
3. Piscinas independentes de mexidos (controlo) e os anti-Met siRNAs são carregados em 384 placas de cultura de células de microscopia pretas.
   1. Dilui-se 160 pmol de siRNA em 500 mL de água isenta de RNase e adicionam-se 5 ul desta solução por poço (concentração final: 1,6 pmol).
   2. Manter esta placa à temperatura de -20 ° C durante um período máximo de 1 ano.
4. Os anticorpos policlonais de coelho contra a proteína bacteriana inLC foram obtidos por imunização com uma proteína recombinante inLC-GST, conforme descrito anteriormente ^25.

2. Reverter siRNA transfecção celular

1. 72 horas antes da infecção trazer à temperatura ambiente, uma placa de 384 poços de cultura de células microscopia preto contendo 1,6 pmol siRNA em 5 mL de água livre de RNase em cada poço.
2. Centrifugar a placa durante 3 minutos a 300rcf à temperatura ambiente para reduzir o siRNA que poderia ter sido depositado nas paredes dos poços.
3. Prepare a temperatura ambiente DMEM suplementado com 0,4% de Lipofectamine RNAiMAX.
4. Adicionar 25 ul de meio de transfecção de DMEM / RNAiMAX a cada poço (não incubar o meio de transfecção mais de 20 minutos antes de adicionar o siRNA).
5. Mover a placa para trás e para misturar o siARN com a solução de transfecção, em seguida, manter a placa durante 1 hora à temperatura ambiente para permitir que os complexos de siRNA-lipofectamina a formar.
6. Lavar as células HeLa a partir de um balão de cultura de células confluentes ou sub-confluentes, uma vez com 10 ml de 37 ° C pré-aquecido PBS.
7. Separar as células HeLa pela adição de 1 ml 37 ° C pré-aquecido de tripsina para o frasco de cultura de células e incubar durante 3 a 5 min a 37 ° C.
8. Re-suspender as células em 10 ml de 37 ° C pré-aquecido DMEM suplementado com 16% de FBS.
9. Contagem de células e preparar uma suspensão de células de 12.000 células por ml em DMEM suplementado com16% de FBS.
10. Adicionar 50 ul de suspensão celular a cada poço da placa de 384 poços.
11. Mova a placa rapidamente para trás e para distribuir as células e deixar as células se acalmar por 10 minutos em temperatura ambiente.
12. Selar a placa com Parafilm e mantê-la durante 72 horas numa atmosfera húmida de 5% de CO ₂ contendo atmosfera a 37 ° C.

3. Infecção Celular e Coloração

1. O dia antes da infecção, tomar uma única colônia de L. monocytogenes da placa de agar BHI e ressuspender o em 5 mL de meio BHI líquido em um tubo de poliestireno de 15 ml.
2. Incubar durante a noite a 37 ° C num dispositivo Shacking para permitir o crescimento bacteriano.
3. No dia da infecção, lave 1 ml durante a noite de L. monocytogenes cultura por centrifugação 2 min a 10.600 rcf em uma centrífuga de mesa.
4. Descartar o sobrenadante (que contém a citotoxina segregada listeriolisina O) e re-suspender o sedimento em 1 ml de PBS (REPEAt a etapa de lavagem mais 3 vezes).
5. Ler a densidade óptica a 600 nm bacteriana e estimar o número de bactérias (OD = 1 é equivalente a 1E9 bactérias / ml).
6. Prepare o adequado L. monocytogenes diluição em DMEM suplementado com FBS a 1%: usando estirpes altamente invasivos como EGDe.PrfA *, sugere-se a utilização de bactérias 5E4 em 30 ul de meio por poço (a multiplicidade da infecção foi calculado como 25 por 2.000 células).
7. Remover o meio de cultura de células em cada cavidade (80 ul) e substituí-lo por adição de 30 ul do L. monocytogenes contendo meio.
8. Centrifugar a placa a 200 rcf durante 5 min à temperatura ambiente, para sincronizar o processo de infecção.
9. Incubar a placa durante 1 hora numa atmosfera húmida de 5% de CO ₂ contendo atmosfera a 37 ° C sobre um bloco de alumínio pré-aquecido.
10. Remover o L. monocytogenes contendo meio de cada poço e adicionar 30 ul de DMEM pré-aquecido suplementado com 10% FBS e40 ug / ml de gentamicina para matar L. extracelular monocytogenes.
11. Incubar durante 4 horas em 5% de CO ₂ contendo atmosfera a 37 ° C num bloco de metal pré-aquecido.
12. Prepara-se uma solução de PBS suplementado com 8% de formaldeído (esta solução deve ser preparada de modo a que os monómeros de formaldeído, em vez de os polímeros de paraformaldeído, são utilizados).
13. Sem descartar o meio de cultura celular, adicionar 30 ul de PBS suplementado com 8% de formaldeído (concentração final: 4%) e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
14. Retirar o fixador e lava-se as células três vezes com 80 ul de PBS por poço (manter as células num volume final de 80 ul de PBS por poço).
15. Prepara-se uma diluição de 1:250 de anticorpo de coelho anti-inLC soro em PBS suplementado com 0,2% de saponina.
16. Adicionar 10 ml da solução de anticorpo primário em cada poço após remoção do PBS e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
17. Descarte o primárioA solução de anticorpo e lavar quatro vezes com 40 ul de PBS por poço.
18. Dilui-se a Alexa Fluor 546 acoplado anticorpo secundário anti-coelho (1:250), a solução DAPI (1:1.500) e faloidina-Dy647 (1:150) em PBS suplementado com 0,2% de saponina.
19. Adicionar 10 ul desta solução de coloração secundária a cada poço e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
20. Descartar a solução de coloração secundário e lava-se quatro vezes com 40 ul de PBS por poço (deixar um volume final de 40 ul de cada poço e selar a placa).
21. A placa pode ser fotografada imediatamente ou pode ser armazenada a 4 ° C, protegida da luz (cobrir com folha de alumínio) para análise posterior.

4. Aquisição de Imagem e Análise

1. Adquirir imagens em três canais diferentes (350 nm, 546 nm e 647 nm) utilizando uma objetiva de 10X montado em um microscópio automatizado (adquirir preferencialmente 9 imagens por bem).
2. O sinal inLC pode ser medido usando a imagemO software de análise como CellProfiler que permite a segmentação automatizada dos núcleos e corpos celulares utilizando o DAPI e a coloração faloidina, respectivamente.

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Resultados

Marcação fluorescente de citoplasmática inLC fornece uma leitura robusta para a infecção de células por L. monocytogenes, como ilustrado na Figura 1: a célula central na micrografia é altamente infectados pela estirpe P14.PrfA * ^23, uma vez que pode ser observada na imagem de contraste de fase (setas, Figura 1A) e confirma-se por o sinal de DAPI onde bactérias individuais podem ser claramente distinguidos (Figura 1B). A coloração inLC (sob...

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Discussão

Vários parâmetros são fundamentais para o sucesso do nosso protocolo de detecção inLC, incluindo o uso de linhas de células saudáveis ​​que apresentam um número suficiente de citoplasma para permitir uma detecção inequívoca do sinal inLC. No ensaio que apresentamos neste artigo, propomos o uso de células HeLa CCL2, que são particularmente adequados para o nosso ensaio, devido à extensão de seu espaço citosólico; outros clones HeLa como as células HeLa Kyoto exibir um citoplasma menor, mas pode ser ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Brain Heart Infusion	BD	237500	For liquid BHI preparation
Bacto Agar	BD	214010	Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum	Biowest	51830-500
DMEM	Invitrogen	61965-026
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778-100
Gentamicin	Sigma	G1397-10ML
Formaldehyde (16%)	EMS	15710	Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546	Invitrogen	A-11035
DAPI	Invitrogen	D-1306
Phalloidin Dy647	Dyomics	647-33
siRNA Scramble	Dharmacon	D-001810-10
siRNA Met	Dharmacon	L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate	Corning	3985
AxioObserver Z1 microscope	Zeiss	431007 9901
sCMOS camera	Andor	Neo
Metamorph analysis software	Molecular Devices	4000
CellProfiler analysis software	Broad Institute	Public software available at http://www.cellprofiler.org/