Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

Resumo

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Resumo

Muitos tecidos, como os corações humanos adultos, são incapazes de se regenerar adequadamente após a lesão. ^2,3 Estratégias em engenharia de tecidos propor inovações para ajudar o corpo a recuperação e reparação. Por exemplo, as abordagens TE pode ser capaz de atenuar a remodelação cardíaca após infarto do miocárdio (IM) e, possivelmente, aumentar a função cardíaca total a um próximo nível pré-MI normal. ⁴ Tal como acontece com qualquer tecido funcional, regeneração bem sucedida do tecido cardíaco envolve a entrega dos vários tipos de células com sinais ambientais que favoreçam a integração e sobrevivência do enxerto de células / tecido implantado. Tecidos artificiais devem abordar vários parâmetros, incluindo: sinais solúveis, interações célula-célula, e materiais de matriz avaliados como veículos de entrega, os seus efeitos sobre a sobrevivência da célula, resistência do material, e facilitação de organização célula-tecido. Estudos empregando a injeção direta de células do enxerto apenas ignorar esses elementos essenciais. ^2,5,6Um projeto de tecidos combinando esses ingredientes ainda tem de ser desenvolvido. Aqui, apresentamos um exemplo de projetos integrados que utilizam camadas de folhas de células padronizadas com dois tipos distintos de materiais biológicos derivados contendo o tipo de célula para órgãos-alvo e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos no "tecido". Embora esses estudos concentram-se na geração de tecido cardíaco semelhante, este projeto tecido pode ser aplicado a muitos outros do que o coração com design e material alterações mínimas órgãos, e é destinado a ser um produto off-the-shelf para terapias regenerativas. O protocolo contém cinco etapas detalhadas. Uma temperatura de poli sensível (N -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) é usado para placas de cultura de tecidos revestimento. Em seguida, as células são cultivadas de tecido específico sobre a superfície das placas revestidas / superfícies micropattern para formar camadas de células com aderências laterais fortes. Em terceiro lugar, uma matriz de base, é criado para o tecido através da combinação de matriz porosa com Permissi neovascularve hidrogéis e células endoteliais. Finalmente, as folhas de células são levantados a partir dos pratos PNIPAAm revestidos e transferido para o elemento de base, fazendo com que a construção completa.

Introdução

Injection of cells and/or single materials alone has shown variable success in other organ systems and limited success in cardiac regeneration.^5,7-12 Currently, stem cell-derived cells are delivered to damaged tissue using a variety of delivery methods including: direct cell injection into tissue and perfusion into the blood supply.^13-17 Others have implanted cells alone, materials alone and/or in combination with material carriers to help regenerate damaged organs.^18-21 This design combines multiple strategies that provide material strength, patterning in multiple materials and multiple cell types.

Specifically, the base acellularized fibrous matrix provides the foundational physical strength to the construct, making it suitable for suturing in into the patient, if necessary. The void spaces in the base matrix are filled with endothelial cells in a neovascular permissive hydrogel²² for rapidly establishing vascularization of the implanted construct. This composite is then integrated with pre-patterned cell sheets that allow enhanced cell-to-cell communication, more closely mimic the native tissue.^1,23-25 The overall production process for the layered cellular patch is outlined by the flowchart in Figure 1.

Protocolo

1 Criação de placas PNIPAAm revestidas

1. Dissolve-se o 2,6 g de PNIPAAm em 2 ml de uma solução de hexano a 60% de tolueno / 40%.
2. Aquecer a mistura a 60 ° C durante 10 minutos agitou-se, até que a PNIPAAm é dissolvido.
3. Cortar papel de filtro para um círculo de diâmetro 60 mm e coloque o papel no funil de Buchner.
4. Filtrar a solução através de Buchner Funil para a pré-pesado copo de vidro (não use plástico, como o hexano vai derreter plásticos).
5. Colocar a proveta e o conteúdo para um vácuo de sino (24 psi) S / N (16 horas). Nota: Até o resíduo é reagido com isopropílico vai oxidar para ter certeza que não entra em contato com o oxigênio.
6. Pesar no copo para estabelecer o peso do PNIPAAm.
7. Adicionar álcool isopropílico para a PNIPAAm, criando uma 50/50 w / w solução.
8. Coloque 2 ml da solução sobre a superfície da placa de cultura de tecidos, e no revestimento, durante 5 min, sob luz UV.
9. Lava-se a placa com 2 ml de PBS quente duas vezesantes de usar para cultura de células.

2 Criação de Fichas de celulares

Nota: as folhas da pilha de células primárias para o órgão-alvo podem ser criadas através de um número de métodos diferentes, ou por revestimento de superfícies de cultura de tecidos com o polímero termo-sensível, tal como descrito aqui. Placas termossensíveis Pré-revestidos também são oferecidos por um número de fornecedores.

Nota: Este protocolo é para a cultura usando um prato de 35 mm. Resumidamente, as células são primeiro incubadas a 37 ° C durante um mínimo de 24 horas à confluência para estabelecer conexões laterais entre as células adjacentes. Para soltar as folhas de células, as placas são sujeitas a temperaturas inferiores a 32 ° C. A camada de células é então transferido para a matriz fibrosa base forte contendo um hidrogel permissiva neovascular com as células endoteliais vasculares.

1. Isolar a população de células. Nota: Este método é dependente dos procedimentos de derivação individuais e o tipo de células. Rato mu liso aórticocélulas LECSA (RASMC) são utilizadas neste exemplo. Estas são células primárias de músculo liso isoladas a partir da aorta abdominal de um rato.
2. Lavam-se as células com 2 ml de PBS quente.
3. Adicionar 3 ml de tripsina (ou outro / solução dissociando clivagem) para as células durante 5 min.
4. Inibir a tripsina por adição de 3 ml do meio de cultura, ou uma solução tampão de fosfato (PBS) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS).
5. Recolher as células num tubo cónico e contagem de uma alíquota.
6. Rodar as células a 1.000 rpm (228 xg) durante 5 min.
7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células no seu meio de crescimento (mais SmGM2 kit bala meio de cultura é usada para RASMC).
8. Coloque a mídia que contém as células em um termo-sensível placa 35 mm - PNIPAAm placa revestida com uma concentração que vai atingir 100% de confluência. Nota: Para RASMCs que o número foi determinado como sendo de 100.000 células / cm ^2. No entanto, devido à perda de células durante a passagem, 120% do que va lue é usado.
9. Colocar numa incubadora a 37 ° CO / N. Nota: É importante manter as células a 37 ° C, para manter a adesão de células à placa.

3: Preparação da Matriz Fundamental

Nota: Várias matrizes fibrosas em 3D podem ser utilizados para a camada de matriz fibrosa forte entre as camadas de células delicadas. Alguns exemplos incluem: gelfoam, biovidro, materiais naturais acellularized ²⁶ ou nanospun materiais ^27,28 A matriz de bexiga do porco (UBM) utilizada nesses estudos foi generosamente fornecidos a partir de nosso colaborador, o Dr. Badylak ^29.

1. Antes de usar, determinar as características da matriz, incluindo a falta de conteúdo celular se descelularizados matriz é usado, ^27,28 viabilidade celular específica, e o espaço vazio ^22.
2. Cortar a matriz pré-esterilizados em um tamanho e forma desejados. Nota: Aqui, um furador é utilizada para cortar um círculo diâmetro de 4 mm.

ve_title "> 4. células endoteliais de semeadura em um Neovascular Permissivo Hidrogel

Nota: As células endoteliais podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes, incluindo a diferenciação de células estaminais ou progenitoras. Aqui, são utilizadas células HUVEC.

1. Use qualquer hidrogel permissiva (fibrina, géis de colagénio), enquanto o tempo de reticulação é suficientemente curto para permitir que as células permanecem viáveis. Nota: Aqui, um gel de hialuronano (HA), com base reticulados com uma ponte de dissulfureto é utilizado.
2. Prepare o hidrogel de HA, de acordo com o protocolo da empresa.
3. Recolher as células endoteliais e dispersam-se numa solução de uma única célula utilizando tripsina 1x. Nota: Accutase ou dissociação celular Tampão também poderia ser utilizada para a dispersão de células individuais.
4. Desactivar a enzima tripsina, utilizando uma quantidade igual de inibidor de tripsina de soja (que é importante que as células não entram em contacto com o soro) ou 10% de FBS em PBS, recolhendo a solução / células para um tubo de 15 ml.
5. CONT as células, e calcular o volume necessário para as dimensões de emenda (previamente quantificada). Nota: Para um patch 4 milímetros, aqui de 2 milhões de células endoteliais são usados.
6. Extrato de 2 milhões de células, e coloque em um novo tubo de 15 ml.
7. Giram em (228 xg) por 5 min.
8. Aspirar o sobrenadante, deixando as células como um sedimento num tubo cónico.
9. Misturar os materiais líquidos de HA e de gelatina numa proporção de 1: 1 ração. Em seguida, adicionar 80% do volume total dentro do tubo cónico contendo o sedimento.
10. Ressuspender as células endoteliais na mistura 1: 1 HA / Gelatina
11. Colocar as células em suspensão na mistura de HA / gelatina para a base de matriz fibrosa a partir do Passo 2.
12. Adicionar 1/5 (20 por cento) do volume total desejada do agente de reticulação
13. Incubar durante 1 hora a 37 ° C.

5. Isolamento de Folhas Celulares

1. Retirar as placas tratadas com PNIPAAm 35 milímetros contendo as células a partir do incubador e colocar num capuz de cultura de células emRT.
2. Aspirar rapidamente o meio das células, e adicionar 2 ml de 6% de gelatina normal que foi aquecido a 37 ° C.
3. Enquanto que a gelatina está ainda quente, coloque a estrutura de metal em que a gelatina, submergindo-a abaixo da superfície da gelatina normal (Filme 1).
4. Coloque a totalidade da placa em gelo durante 5 a 7 minutos, permitindo que a gelatina endureça.
5. Após 7 min, uma espátula para separar cuidadosamente os bordos de gelatina do lado da placa, e em seguida utilizar uma pinça para levantar a estrutura de metal da placa Nota: A gelatina 6%, e a folha de célula deve levantar com a estrutura.
6. Mover a lâmina da célula para o prato e colocar na parte superior do conjunto de matriz de hidrogel de base fibrosa, ajustando cuidadosamente a estrutura no topo da construção. Nota: O lado apical da camada de células ainda estará na posição superior.
7. Adicionar 2 ml de meio morno (37 ° C).
8. Incubar S / N permitindo que a folha de células para aderirem à superfície do hidrogel.
9. Remover tele grade metálica após a solução aquece (aproximadamente 1 hora), ou no dia seguinte.

Resultados

O diagrama de fluxo (Figura 1) mostra o método geral para fazer o penso multicamadas. Folhas de células são separadas da placa tratada PNIPAAm por baixar a temperatura abaixo de 32 ° C. Em seguida, a camada de células é colocada em cima do hidrogel reticulado contendo as células endoteliais semeadas na matriz fibrosa subjacente (Figura 1). As placas pré-tratados termossensíveis, também podem ser utilizados para criar as camadas de células. Superfícies topológicas especiais ...

Discussão

Os passos críticos no protocolo incluem: revestimento das superfícies das placas com o polímero thermoresponsive e manipular as folhas de células após o arrefecimento das placas. Como as células diferentes apresentam diferentes propriedades físicas, como adesividade, o tempo de elevação deve ser otimizado para cada tipo de célula diferente. O segundo, e mais importante desafio componente deste protocolo, centra-se na manipulação da camada de células, um aspecto crítico dos métodos para a montagem do tecid...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / live dye
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexane	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2	Lonza	CC-4149	Smooth Muscle Media
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Human Venous Endothelial Cells
HyStem	Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsin	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Specific Equipment
Filter paper	Ahlstrom	6310-0900
Buchner Funnel	Sigma Aldrich	Z247308
UpCell Plates	Nunc	2014-11
UV light	Jelight Company	UVO Cleaner Model No.42