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Resumo

Cocultura amebas é um sistema de cultura de células usando as amebas aderente para crescer selectivamente patogénios intracelulares capazes de resistir as células fagocíticas, tais como amebas e macrófagos. Representa, portanto, uma ferramenta-chave para descobrir novos agentes infecciosos. Enriquecimento amebas permite a descoberta de novas espécies de amebas e das suas bactérias intracelulares específicos.

Resumo

Patógenos intracelulares como legionella, micobactérias e organismos Chlamydia-como são difíceis de isolar, porque eles geralmente crescem pouco ou nada em meios seletivos que são normalmente utilizados para cultivar bactérias. Por esta razão, muitos destes patógenos foram descobertos apenas recentemente, ou na sequência de surtos importantes. Estes patógenos são frequentemente associados com amebas, que servem como-célula hospedeira e permitir a sobrevivência eo crescimento das bactérias. Pretendemos aqui para dar uma demonstração de duas técnicas que permitem o isolamento e caracterização de patógenos intracelulares presentes em amostras clínicas e ambientais: a co-cultura amebas eo enriquecimento amebas. Cocultura amebas permite a recuperação de bactérias intracelulares, inoculando a amostra investigada para um relvado amebas que podem ser infectadas e lisadas por bactérias intracelulares presentes na amostra. Enriquecimento amebas permite a recuperação de amebas presente numa amostra clínica ou ambiental. ThÉ possível levar à descoberta de novas espécies de amebas, mas também de novas bactérias intracelulares crescem especificamente nestas amebas. Juntas, essas duas técnicas ajudam a descobrir novas bactérias intracelulares capazes de crescer em amebas. Devido à sua capacidade para infectar as amebas e resistir a fagocitose, estas bactérias intracelulares também pode escapar a fagocitose pelos macrófagos e, assim, ser patogénico para eucariotas superiores.

Introdução

Antes do advento de diagnóstico molecular, os microrganismos presentes em nichos ambientais ou em amostras clínicas foram frequentemente detectado cultivando-os em diferentes meios selectivos, principalmente em agar em pratos de Petri. O fenótipo das colónias de bactérias e a sua actividade metabólica depois deixada classificação bacteriana ao nível da espécie. Caldo também pode ser usado para aumentar a sensibilidade de detecção. No entanto, ambas as técnicas não permitem a recuperação de bactérias que crescem lentamente ou não em todos nestes meios. Esta é a razão pela qual abordagens moleculares são tão amplamente utilizados hoje em dia. No entanto, a detecção de ADN não fornece nenhuma pista sobre a viabilidade das bactérias. Além disso, ao contrário da cultura, as abordagens moleculares não resultar numa estirpe que pode ser ainda caracterizada.

Estudar patógenos que crescem pouco em meios sólidos ou que as células precisam para crescer é complicado. A maioria destes "difícil crescer" bactérias são intr exigenteacelular bactérias, muitas vezes descoberto e caracterizado seguinte grandes surtos como era o caso de Legionella pneumophila. Esta bactéria foi marcado após um surto que ocorreu durante uma convenção da Legião Americana. Tal como muitos como 182 pessoas foram infectadas e 29 morreram devido a uma pneumonia grave 1,2. Mais tarde, foi demonstrado que as amebas foram os anfitriões naturais desta bactéria e que a sua presença nas redes de hotel do sistema de ar-condicionado e água esteve na origem do surto da doença a chamada do Legionário 3.

Amebas estão presentes em todo o mundo e foram isolados do solo, do ar, da água e da mucosa nasal de voluntários humanos (revisada em 4). Essas amebas "vida livre" são geralmente dividindo de forma autônoma no ambiente, mas ocasionalmente pode invadir hospedeiros permissivos 5. Alimentação Amebas em vários microorganismos através de fagocitose e digestão lisossômico subseqüente por hydrolases 6. Muitas bactérias intracelulares facultativos ou obrigatórios são capazes de resistir a digestão e, assim, infectar e se dividir em amebas como por exemplo bactérias ou micobactérias relacionadas com Chlamydia Legionella, (revisto em 7 e 8). Amebas de vida livre provavelmente representam um importante reservatório potencial de bactérias intracelulares que ainda não foram descobertos. Isso levou nosso grupo a implementar em Lausanne duas técnicas principais, chamados de co-cultura amebas e enriquecimento amebas, o que permitiu diferentes grupos para isolar vários novos microrganismos intracelulares obrigatórios a partir de várias amostras ambientais 9-15.

Desde amebas são fagócitos profissionais que pastam em bactérias, uma bactéria capaz de resistir a fagocitose e crescer dentro destes protistas também pode colonizar fagócitos humanos e ser patogênico para seres humanos. Este efeito foi parcialmente demonstrada para algumas bactérias relacionadas com a Chlamydia, como Waddlia chondrophila. W. chondrophila pode crescer não apenas em amebas, mas também em vários tipos de células, tais como células de mamíferos epiteliais, macrófagos, e linhas celulares de peixe 16-18. A co-cultura amebas também parece relevante para a detecção de bactérias intracelulares em amostras clínicas 19,20, incluindo fezes que são fortemente contaminados com diferentes espécies de bactérias 21.

Aqui nós descrevemos as principais etapas de co-cultura amebas e enriquecimento amebas, incluindo (a) tratamento de amostras ambientais e clínicas, (b) o crescimento de amebas em mídia axênicas e em um gramado bacteriano de Escherichia coli e (c) a seleção e caracterização de bactérias intracelulares.

Protocolo

1. Amebas Coculture

1.1 Preparação da amostra

  1. Amostra ambiental
    1. As amostras de água
      Filtra-se a amostra de água (500 ml a 1 litro), por meio de uma membrana de 0,22 de tamanho de poro. Em seguida, agitar a membrana nos ameba salinas PAS médias de página (120 mg de NaCl, 4 mg de MgSO4 • 7H 2 O, 4 mg de CaCl 2 • 2H 2 O, 142 mg de Na 2 HPO 4, e 136 mg de KH 2 PO 4 em 1 L de água destilada).
    2. As amostras sólidas
      Ressuspender as amostras sólidas como amostras do solo de areia e de amostras semi-sólidos tais como lamas activadas em água destilada ou PBS e filtrá-las através de uma membrana de 0,22 de tamanho de poro. Em seguida, agitar a membrana em PAS.
    3. As amostras altamente contaminadas com amebas e protozoários endógeno
      Primeiro sedimentar as amostras por centrifugação a baixa velocidade (180 xg) for 10 minutos ou filtra-se por uma membrana de 5 um de tamanho de poro. Além disso processar o sobrenadante (respectivamente filtrado), como descrito em 1.1.1.
      Nota: Outras técnicas de descontaminação pode ser usado para descontaminar mais amostras ambientais: Aquece-se a amostra a 50 ° C durante 30 min ou tratar com soluções ácidas ou básicas 14.
  2. Amostra clínica
    Processe amostras clínicas, dependendo de suas propriedades físico-químicas. Filtrar ou centrifugar líquidos para remover grandes impurezas. Ressuspender as amostras sólidas. Para usar tecidos, triturá-los, por exemplo, usando um homogeneiser dounce ou contas de vidro, e lisar as células para libertar as bactérias intracelulares.

1.2 Amebas preparação

  1. Preparação Caldo
    Prepare as seguintes mídias: a mídia rica contendo peptona, extrato de levedura e glicose (PYG; 100 g de protease peptona, 10 g de extrato de levedura, 4,9 g de MgSO4 • 7H 2O, 5 g de citrato de sódio • 2H 2 O, 0,1 g de Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O, 1,7 g de KH 2 PO 4, 1,97 g de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 g de glicose, e 0,295 g de CaCl 2 em 5 L de água destilada) e um meio não-nutritivo tais como PAS para espécies de Acanthamoeba.
  2. Cultura de amebas
    1. Cultive amebas (preferencialmente Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 ou A. polyphaga Linc-AP1) a 25 ° C em frascos de cultura de células contendo 30 ml de meio PYG.
    2. Recolher as amebas, por agitação vigorosa do balão e centrifugar a suspensão de células durante 10 min a 1500 x g. Lava-se a pelete duas vezes com meio PAS. Contar as células num diapositivo Kova e ajustar o volume para se obter uma suspensão de 5 x 10 5 células por ml.
    3. Transferir a suspensão de amebas em microplacas. Use 1 ml por poço para 12 - e 24-wplacas ell, 500 ul para placas de 48 poços e 300 ul para placas de 96 poços. Incubar a microplaca durante pelo menos 2 horas a 25 ° C. Isto permite que a sedimentação e a fixação do amebas para o fundo de cada poço.

1.3 Coculture

  1. Inoculação da amostra
    1. Inocular a placa a partir de 2.3.3, com uma série de diluições da amostra a partir de 1.1 ou 1.2, geralmente com 10 vezes diluições em série, começando com 100 ul de amostra não diluída.
    2. Centrifugue a microplaca a 1.800 xg durante 10 min para sedimentar no relvado amebas os microrganismos potencialmente presentes na amostra. Isso aumenta o contato e fagocitose de microorganismos por amebas.
    3. Incubar as placas durante 45 min a 25 ° C e lava-se três vezes com PAS, substituindo o meio com PAS fresco. Adicionar 1 ml por poço de PAS com ou sem adição de antibióticos (estreptomicina, penicilina, gentamicina e / ou vancomicina), dependendo das bactericidaespécies ai que são procurados.
    4. Incubar a microplaca a 32 ° C numa atmosfera húmida de evitar enquistamento do amebas. Observe cada poço diariamente com um objetivo 20X para detectar a presença de bactérias invasoras e lise amebas.
    5. No caso da lise, realizar uma subcultura em amebas fresco inoculando 100 ul de co-culturas a uma monocamada de cerca de 10 5 amebas / cm 2. Para isolar especificamente uma determinada espécie bacteriana, também inocular ágar específico projetado para estas bactérias (ou seja, ágar BCYE para Legionella spp.).
    6. Na ausência de lise, tomar 100 ml de co-culturas de quatro a sete dias após a primeira inoculação e inocular uma cultura fresca amebas de 900 ul numa placa de 24 poços. Se a lise rápida das amebas é observada sem a proliferação de bactérias, vírus pode estar presente. Neste caso, filtrar o sobrenadante a 0,22 mM e utilizar a suspensão foi filtrada para infectar amibas fresco.

1.4 isolamento e caracterização de bactérias

  1. Coloração bacteriana
    Realize coculturas diretamente em lamínulas em microplacas de 24 poços. Remover o meio e realizar coloração ou imunofluorescência.
    1. Coloração Romanowsky Modificado
      1. Deixe o lamela seca. Mergulhe a lamela cinco vezes na solução fixadora (2 mg / L Fast Green em metanol).
      2. Imergir a lamela cinco vezes em que a solução de coloração (1,22 g / L Eosina L em tampão fosfato pH 6,6)
      3. Finalmente, mergulhe a lamela 5 vezes na solução de coloração II (1,1 g / L tiazina em tampão fosfato pH 6.6).
      4. Lavar a amostra com água destilada. Deixe secar e observar ao microscópio.
    2. Coloração de Ziehl-Neelsen
      1. Deixe o lamela seca. Cobrir a amostra com Ziehl fucsina. Aqueça o corante com uma chama até vapores aparecer.
      2. Arrefece-se à temperatura ambiente durante pelo menos 5 mine enxágüe com água destilada. Cobrir a amostra com uma solução de ácido clorídrico a 3%, em isopropanol durante 2 minutos e lavar com água destilada.
      3. Capa para 30 seg com azul de metileno e enxágüe com água destilada. Deixe secar e observar ao microscópio 22.
    3. Coloração Gimenez
      1. Prepara-se uma solução estoque de fucsina básica através da mistura de 100 ml de 10% de fucsina básica (10 g de fucsina básica em 100 ml de etanol a 95%), 250 ml de 4% de fenol aquoso e 650 ml de água destilada. Incubar a 37 ° C durante 48 horas antes da utilização.
      2. Deixe o lamela secar e fixar por passagem através de chama. Cobrir a amostra com fucsina básica recentemente filtrada (4 ml de solução de estoque de fucsina básica em 10 ml de 0,1 M de tampão fosfato de sódio, pH 7,45) durante 2 min.
      3. Lavar a amostra com água e incubar em verde malaquita (0,8% em água destilada) por 10 segundos. Enxágüe novamente com água e repita a coloração verde malaquita. Enxágüe novamente com água. Deixe o lamela seca, mount-lo, e observar ao microscópio 23.
    4. Imunofluorescência
      1. Fixar a lamela por incubação em metanol durante 5 min ou com paraformaldeído a 4% durante 10 min.
      2. Lavar três vezes com PBS e incuba-se durante 2 horas em solução de bloqueio (5% BSA, 0,1% de saponina em PBS) à temperatura ambiente.
      3. Incubar a lamela por 1 hora em solução contendo anticorpos produzidos contra o microorganismo de interesse bloqueio.
      4. Lavar novamente três vezes em PBS e incubar durante 1 hora com um anticorpo secundário dirigido contra o anticorpo primário e ligada a um fluoróforo. Lavar três vezes com PBS, montar a lamela e observa por microscopia de fluorescência.
  2. A detecção de ADN por PCR
    Extrair DNA de 100 a 200 ul de cocultura amebas. Detectar microorganismos com primers universais visando o gene 16S rRNA ou primers específicos para as espécies de interesse, como micobactérias 24, Legionella 25 ou membros da Chlamydiales 26.

2. Enriquecimento de amebas

2.1. A preparação das amostras

Ressuspender amostras sólidas e semi-sólidos em PAS em vortex. Centrifugar a suspensão a baixa velocidade (180 xg) durante 10 min. Isso permite que o enriquecimento de amebas de vida livre na pelota. O sobrenadante pode ser utilizado para co-cultura amebas e o sedimento de enriquecimento amebas 21.

2.2. Preparação Médio

  1. Adicionar 1,5 g de agar a 100 mL de PAS e autoclave o meio de 15 min a 121 ° C. Despeje o meio quente em placas de Petri e deixar solidificar à temperatura ambiente.
  2. Grow Escherichia coli (ATCC 25922) em meio LB ou tioglicolato de caldo durante a noite a 37 ° C. Lavar as bactérias duas vezes com PBS e re-suspender-los em meio PAS. Diluir 10x no PAS e espalhar 2-3 ml desta diluição em uma placa de ágar PAS e deixe secar.

2.3. Inoculação da amostra

Adicionar uma gota de amostra (ou de um pedaço de filtro) de um lado da placa e deixe fluir por cima da placa de Petri de modo a formar uma linha no centro do prato.

2.4. Crescimento de amebas e subcultura amebas

  1. Observe a placa de Petri diária. Se uma frente de migração amebas é detectado, cortar um pequeno pedaço de agar na frente de migração e inocular um novo prato NNA Petri cobertas com uma camada de E. coli.
  2. Repetir o reinoculação várias vezes, dependendo da pureza da amostra, a fim de ter uma cultura pura de uma dada estirpe amebas.

2.5. Amebas e bactérias caracterização

  1. Raspe as células e ressuspender-los em PAS.
  2. Extrair DNA e determinar a identidade de amebas e / ou endosimbiontes bacterianas por PCR e sequenciação (amplificação de rRNA 16S por bactérias, resp. RRNA 18S por amebas e sequenciação, por exemplo).
  3. Use essas células raspadas no PAS para inocular amebas fresco e realizar uma co-cultura amebas para detectar bactérias possivelmente presentes na amostra.

Resultados

Utilizando co-cultura amebas e enriquecimento amebas, toda uma gama de bactérias do ambiente e / ou patogénicos foram descobertos (Tabela 1).

Co-cultura de amebas foi utilizada pelo nosso grupo e outros, para analisar amostras ambientais, estações de tratamento de água e sistemas de distribuição de água. Uma ampla gama de microorganismos pode ser isolado, com esta técnica. As bactérias mais comuns isoladas por co-cultura amebas são membros do gênero Mycobacte...

Discussão

Co-cultura de amebas e enriquecimento amebas são métodos eficientes que permitiram o isolamento de muitas novas espécies de bactérias e amebas. Os resultados obtidos com estes métodos confirmam a presença ubíqua de ambos amebas e bactérias resistentes ameba do ambiente, e mais interessante em redes de água feitos pelo homem, que são considerados para ser controlada por meio de tratamentos químicos tais como a cloração e ozonização. Co-cultura de amebas e enriquecimento amebas são ferramentas essenciais p...

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos Pr. Bernard La Scola para conselhos técnicos úteis e interessante discussão sobre co-cultura amebas e enriquecimento amebas. Agradecemos também o Dr. Vincent Thomas por sua ajuda na implementação da técnica em nosso laboratório.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Glucose monohydrateMerck, Darmstadt, Germany108342
0.22 μm pore size membraneMerck Millipore, Darmstadt, GermanySCVPU11RE
proteose peptoneBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ211693
yeast extractBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ212750
Cell culture flasksBecton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ353135
Kova slideHycor, Indianapolis, IN87144
cell culture microplatesCorning Inc, Corning, NY3524
Diff-Quik staining kitSiemens Healthcare diagn., Munich, Germany130832
Ziehl fuchsinFluka, St-Louis, MI21820
basic fuchsinSigma, St-Louis, MI857843
PhenolSigma, St-Louis, MIP1037Corrosive and mutagenic
malachite green oxalateFluka, St-Louis, MI63160
Paraformaldehyde 16% solutionElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA15710
SaponinSigma, St-Louis, MI84510

Referências

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