Correção Deriva de exemplo a seguir 4D confocal tempo-lapso

Resumo

Microscopia de lapso de tempo permite a visualização de processos de desenvolvimento. Crescimento ou deriva de amostras durante a aquisição de imagem reduz a capacidade de acompanhar e medir movimentos celulares durante o desenvolvimento de forma precisa. Descreve-se o uso de open source software de processamento de imagem para corrigir desvio tridimensional da amostra ao longo do tempo.

Resumo

A geração de quatro dimensões (4D) de conjuntos de dados confocal; consistindo de sequências de imagens em 3D ao longo do tempo; proporciona um excelente método para capturar comportamentos celulares envolvidos em processos de desenvolvimento. A capacidade de controlar e seguir os movimentos de células é limitado pelos movimentos das amostras que ocorrem devido à deriva da amostra ou, em alguns casos, o crescimento durante a aquisição de imagem. Células de rastreamento em conjuntos de dados afetados pelo desvio e / ou crescimento irá incorporar esses movimentos em qualquer análise da posição da célula. Isto pode resultar no movimento aparente de estruturas estáticas dentro da amostra. Portanto antes de rastreamento de celular, qualquer amostra de desvio deve ser corrigido. Usando o open source Fiji distribuição ¹ de ImageJ ^2,3 e as ferramentas loci incorporados ^4, desenvolvemos o correto 3D deriva plug-in para remover movimento amostra errônea em conjuntos de dados confocal. Este protocolo compensa efetivamente para a tradução da amostra ou alterações no po focalção, utilizando correlação de fase para registrar cada ponto de tempo de um de quatro conjuntos de dados dimensionais confocal, mantendo a capacidade de visualizar e medir movimentos celulares sobre as experiências de lapso de tempo prolongados.

Introdução

Imagiologia confocal é amplamente usado em biologia celular e de desenvolvimento para seguir os movimentos da célula e alterações na morfologia. Capturar uma série de secções ópticas em diferentes planos focais permite a geração de um modelo tridimensional (3D) de uma amostra, que pode ser estendido em quatro dimensões (4D), criando uma série de lapso de tempo de conjuntos de dados 3D. A geração de conjuntos de dados 4D permite a medição detalhada de movimentos e comportamentos celulares. Em experimentos de lapso de tempo de longo prazo, é comum observar o movimento da amostra. Isto pode ser causado por pequenas imprecisões no controlo da fase de hardware e de posições focais. Enquanto em outros casos, a deriva é um resultado de movimentos induzidos pelo crescimento da amostra ou flexibilidade dentro da mídia de montagem da amostra. Existem métodos para compensar ou limitar esses movimentos, incluindo melhorias nos sistemas com foco de hardware e aumento da rigidez do meio de montagem. No entanto, estas abordagens não pode ser aplicado em muitos casos devido à imagiologia set-se obrigados a fornecer as condições adequadas para a manutenção de amostras e crescimento. Soluções de software de código aberto que existem para a correção de movimento em 2D ao longo do tempo, através do uso das StackReg e TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) ⁵ plugins no ImageJ ou Fiji, mas estes não podem ser aplicada a conjuntos de dados 4D.

Para corrigir o desvio da amostra, temos desenvolvido um plug-in (Correto deriva 3D) para utilizar a plataforma de processamento de imagens de código aberto, Fiji ^1. Nosso plug-in é capaz de realizar o registro de correlação de fase para corrigir movimento que ocorre como resultado da deriva amostra em experimentos de time-lapse tridimensionais. Correlação de fase ⁶ é um método computacional para determinar a tradução eficiente entre as imagens. O plug-in descrito aqui utiliza a biblioteca fase de correlação desenvolvido por Preibisch et al. ^7. Em experiências de multi-canal, o plug-in utiliza um canal para determinaçãone a correção requerida. Esta correcção é aplicada então a quaisquer canais adicionais resultantes, o conjunto de dados de registo do 4D.

No sistema modelo de peixe-zebra é possível realizar imagiologia de lapso de tempo ao longo de um período de várias horas ou mesmo vários dias ^8. Um método comum para a montagem do peixe-zebra é para incorporar o embrião vivo anestesiados em baixo agarose ponto de fusão (0,8-1,5%), restringindo seu movimento ^9-11. Enquanto o movimento é restringido o crescimento da amostra continua a ocorrer, o que resulta em que as células dentro do campo de vista da posição de deslocamento. A fim de seguir o movimento das células dentro do embrião, é necessário em primeiro lugar para corrigir o movimento de toda a amostra. Este protocolo foi desenvolvido com espécimes de peixe-zebra, e tem sido utilizado para o desenvolvimento de imagem somito ^12, mas pode ser aplicada a qualquer conjunto de dados confocal 4D.

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Protocolo

1. 4D Time-lapse experimentos com imagens

As definições utilizadas para aquisição de imagem será diferente, dependendo do equipamento utilizado. A capacidade de microscopia confocal para a secção opticamente uma amostra depende de uma série de factores: o comprimento de onda de excitação, o tamanho do furo de pino, abertura numérica da objectiva, o índice de refracção da amostra e do meio no qual a amostra é incorporado. O tamanho do orifício confocal seleccionado irá determinar a espessura da secção óptica recolhido. Um orifício menor produzirá uma secção óptica mais fina aumentando a resolução do eixo z, mas reduzindo a quantidade de luz captada. Um orifício maior irá aumentar a espessura da secção óptica, reduzindo resolução eixo-z, mas aumentando a quantidade de luz captada.

Outros fatores a serem considerados durante a coleta de dados 4D antes de correção incluem:

1. Otimizar velocidade de digitalização de remover, ou limite, deriva durante a captura de um único ponto de tempo. Portanto, o tempo necessário para a recolha de imagens deve ser uma pequena fração do intervalo entre os pontos temporais.
2. Perfeitamente estruturas repetitivas, ou grelhas, não são adequados como estruturas de registo, uma vez que não é possível determinar a correcção necessária. Contas aleatoriamente distribuídos ou estruturas irregulares permitirá registro inequívoco.
3. Se o arrastamento da esperada, aumentar a área de leitura e os limites superiores e inferiores de focagem, a fim de garantir que a área de interesse permanece no interior da pilha de imagens.
4. Além de garantir que haja resolução espacial adequada para resolver as estruturas de interesse, definir a taxa de amostragem para fornecer resolução temporal para os eventos dinâmicos em estudo.
   Nota: O tempo entre a imagem pontos temporais devem, portanto, ser pelo menos metade do-intervalo de tempo entre eventos repetidos regulares e diminuir para eventos irregulares.

2. Abrindo o confocal Dataset

O pacote de código aberto Fiji é uma distribuição do programa ImageJ, que contém os plug-ins pré-instalados para realizar inúmeros processos em dados coletados a partir de experimentos de microscopia. O software fornece fácil atualização arquitetura plug-in e inclui uma cópia do correto 3D deriva plug-in usado para esse protocolo. O software suporta a importação de uma vasta gama de formatos de imagem de microscopia de propriedade através da utilização de Bio-Formatos de importação plug-in do Aberto da Microscopia Ambiente.

1. Instale o programa Fiji (http://fiji.sc/Downloads).
2. Carregue o conjunto de dados adquiridos usando o plugin do Importador LOCI Bio-Formatos.
3. Se o conjunto de dados é maior do que a memória alocada para o programa, selecione a opção "Use pilha virtual" dentro da seção de gerenciamento de memória.

3. Correção de Deriva de um objeto 3D em Pós-Processamento

Durante o curso de um lapso de tempo prolongadoexperimentar uma amostra pode mover-se, mesmo quando incorporado. Para corrigir qualquer movimento e para permitir que os eventos de migração fotografada a ser analisada, de pós-processamento de imagens pode ser executada. Todo o processamento pós imagem deve ser claramente descrito na metodologia de qualquer análise derivado deste trabalho.

1. Uma vez que o conjunto de dados foi carregado, execute o plug-in correto deriva 3D.
2. Se houver vários canais de imagem, selecione o canal a ser usado para registrar as imagens. Este deve, idealmente, representam uma estrutura estática dentro da amostra, em vez de quaisquer elementos migratórias ou móveis. No entanto, se isso não for possível o canal com o mínimo de movimento deve ser escolhido.
3. Se a memória RAM disponível no sistema utilizado para esta análise é inferior ao dobro do tamanho do conjunto de dados original, seleccionar a opção de pilha virtual utilização. Isto irá armazenar o hyperstack registrada como uma seqüência de imagens, em vez de salvar o arquivo para a memória RAM.
   1. Selecione uma pasta para o plug-in de saída individual corrigido imaarquivos Ges. Um arquivo de imagem separado será criado para cada canal em cada posição z.
4. O plug-in, em seguida, conduzir uma análise de correlação de fase de pares entre cada ponto de tempo para determinar a necessária correcção que é então aplicada ao conjunto de dados.

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Resultados

No peixe-zebra em desenvolvimento, as células musculares rápidas fundir em fibras multinucleadas das 19 horas após a fertilização (20 - palco somite) ^13. A fim de visualizar o movimento de núcleos e de fusão das células do músculo que efectuados 4D confocal imaging com lapso de tempo utilizando uma estirpe transgénica que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do promotor de actina-α esquelético etiquetar todas músculo As células ¹⁴ e injectado ARN que codifica p...

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Discussão

A nossa capacidade de usar o software de pós-processamento para corrigir desvio da amostra de conjuntos de dados obtidos a partir de experimentos de microscopia de lapso de tempo prolongados é limitado por uma série de fatores. A capacidade para discernir deriva contra movimento migratório de uma amostra é dependente dos marcadores celulares utilizados. Marcadores celulares que são ou amplamente expressas dentro de uma amostra ou não estão envolvidos em eventos migratórios durante a aquisição de imagem propor...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Low gelling temperature agarose	Sigma-Aldrich	A9414-25G
Dumont #4 Forceps	Electron Microscopy Sciences	0208-4-PO
Disposable 3 ml graduated	Samco	212
Polyethylene transfer pipette
9cm bacterial grade Petri dishes	Greiner Bio One	632180
Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing	Bola	S1815-04
Zeiss LSM-710 Confocal microscope	Zeiss
W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective	Zeiss	421452-9600-000