Estudo da migração celular em Canais microfabricados

Resumo

Um método quantitativo para estudar a migração espontânea de células em um microambiente confinado unidimensional é descrito. Este método tira vantagem de canais microfabricados e pode ser utilizado para estudar a migração de grande número de células em condições diferentes nas experiências individuais.

Resumo

O método descrito aqui permite o estudo de migração celular sob confinamento numa dimensão. Ele baseia-se no uso de canais microfabricados, que impõem um fenótipo de células polarizadas por constrangimentos físicos. Uma vez que os canais internos, as células têm apenas duas possibilidades: seguir em frente ou para trás. Esta migração simplificada em que a direcionalidade é restrito facilita o rastreamento automático de células e extração de parâmetros quantitativos para descrever o movimento celular. Estes parâmetros incluem a velocidade da célula, mudanças de direcção e pausas durante o movimento. Microcanais também são compatíveis com a utilização de marcadores fluorescentes e são, portanto, adequados para estudar a localização de organelos e estruturas intracelulares durante a migração celular em alta resolução. Finalmente, a superfície dos canais podem ser funcionalizados com diferentes substratos, permitindo que o controlo das propriedades adesivas dos canais ou o estudo de haptotaxia. Em resumo, o sistema de here descrito destina-se a análise da migração de grandes números de células em condições em que tanto a geometria e a natureza bioquímica do ambiente são controlados, facilitando a normalização e reprodutibilidade de experiências independentes.

Introdução

A migração é uma função celular complexa que é importante para diversos processos fisiológicos em organismos multicelulares, incluindo o desenvolvimento, respostas imunitárias, e a regeneração de tecidos. Além disso, certas situações patológicas, tais como a invasão do tumor e metástases dependem de motilidade celular ^1. Por estas razões, a migração celular tornou-se um importante campo de estudo no contexto de investigação fundamental e de translação. In vivo, a maioria dos tecidos são caracterizado por uma matriz extracelular rica e elevada densidade celular. A migração celular, por conseguinte, em condições fisiológicas, ocorre num ambiente confinado complexo. Classicamente, muito provavelmente devido a razões históricas e limites técnicos, a migração de células foi estudada em sistemas 2d plana que não se reproduzem muitas das propriedades ambientais encontradas em tecidos, tais como o confinamento. Além disso, os factores como a adesão de células, que são essenciais para a motilidade em 2D, foram recentemente mostrou não ser necessariamente necessária para a migração in vivo, ou dentro geles, o que sugere que os mecanismos que governam a locomoção das células em 2D e em outros ambientes são distintos ^2. Vários sistemas têm sido desenvolvidos para imitar as propriedades do complexo de tecidos, o mais famoso géis de colagénio, sendo que visam recapitulando as propriedades da composição da matriz extracelular ^3. Aqui propomos microcanais como método complementar simples que permite a migração de células de estudo em uma dimensão em um ambiente confinado.

Neste sistema, as células migram ao longo de microcanais em que eles entram espontaneamente. Células migratórias então adquirir a forma dos canais, que adopta uma geometria tubular que provavelmente reforça a sua polaridade. O movimento linear das células dos canais permite o seguimento automático de células e a extracção de parâmetros quantitativos obtidos em experiências. Do ponto de vista técnico, este sistema é fácil e flexível. O coating das paredes do canal pode ser manipulado, o tamanho e a forma dos canais pode ser adaptado, e um grande número de células pode ser analisada em experiências individuais. Este sistema pode também ser ampliado para realizar a análise de tela intervalo médio de moléculas envolvidas na motilidade celular. O protocolo aqui descrito foi normalizado utilizando células dendríticas (DC) como um modelo celular. Estas células são a chave para o sistema imunitário que eles participam na iniciação e manutenção de respostas imunitárias específicas ^4. In vitro, DCs foram mostrados para migrar espontaneamente em ambientes confinados, e são, portanto, um bom modelo para estudar a motilidade celular em microcanais ^5,6 . Importante, este sistema pode ser ampliado para analisar a migração de qualquer outro tipo de células móveis, como os linfócitos T, neutrófilos, células de tumor ou ^7-9.

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Protocolo

Importante: Este protocolo assume que o molde contendo a forma para os microcanais desejados já foi feita. Outras informações sobre a preparação do molde já foi publicado em ^{10 de.} Este protocolo também assume que DCs medula óssea cultura é conhecido.

1. Chip Fabrication

1. Misture o óleo de PDMS e agente de cura em um 10:1 de peso em um copo de plástico. Misturar os dois compostos completamente.
2. Lançai a mistura ao longo dos microcanais rolamento do molde. A altura total deve estar compreendida entre 0,5-1 cm.
3. Remova as bolhas de ar em uma redoma de vácuo durante 1 hora.
4. PDMS endureça no molde, colocando este último num forno durante 2 horas a 65 ° C.
5. Uma vez que o PDMS é, à temperatura ambiente, cortado um pedaço grande em torno da estrutura, com uma lâmina de bisturi e retire-a a partir do molde (Figura 1A).
6. Faça furos onde as células serão injetadas (tipicamente 2 mm) e redimensionar o PDMScom uma lâmina cirúrgica para ajustar o tamanho de pratos com fundo de vidro em que a migração serão avaliados (Figura 1B). Antes de prosseguir, remover o pó residual do prato usando lente papel de limpeza. Isto favorece a ligação de PDMS de vidro descrito na etapa 1.10.
7. Limpe o chip redimensionada PDMS contendo os canais por degola e descamação fita adesiva nas laterais da estrutura.
8. Sonicar os pedaços PDMS 30 segundos em 70% de etanol para remover as poeiras e as pequenas partículas de PDMS. Seque-os rapidamente depois soprando ar limpo.
9. Ative os PDMS (estruturas para cima) e placas de cultura de ar (ou oxigênio) o tratamento de plasma durante 30 segundos a 300 mTorr.
10. Coloque ambas as superfícies ativadas em contato para ficar permanentemente os PDMS ao substrato. Se necessário, utilizar uma pinça metálica para pressionar ligeiramente por cima do PDMS de forçar o contacto entre o polímero e o vidro do prato (Figura 1C).
11. Incubar o chip no forno a 65 ° C for 1 hr para fortalecer a ligação.

2. Revestimento de microcanais

1. Activar a toda a estrutura por plasma de ar a 300 mTorr durante 1 min. Isto vai promover a entrada de líquido para dentro dos canais no passo seguinte.
2. Encher rapidamente os orifícios de entrada do chip com fibronectina a 10 ug / ml em água. Outros substratos, tais como PEG podem ser utilizados para modificar a aderência celular para as paredes do canal. Preste atenção que o líquido se espalha por toda a estrutura. Isto pode ser facilmente verificado por olho sob luz normal ou usando um microscópio de campo claro regular.
   NOTA: Em estruturas muito pequenas, nas quais a difusão é mais difícil, a entrada de líquido nos canais podem ser forçados através da colocação da estrutura numa campânula de vácuo durante pelo menos 15 min. Para verificar a eficiência do revestimento de substratos fluorescentes pode ser utilizado (Figura 2).
3. Incubar 1 hora à temperatura ambiente para permitir a adsorção da fibronectina ou qualquer outro revestimento substtaxa para as paredes dos canais.
4. Lavar as estruturas 3x com PBS para remover o substrato nonbound.
5. Após a lavagem, passe para protocolo 3 ou armazenar o chip a 4 ° C para um uso posterior (24 máximo hr).

3. Célula de carga

1. Remover o PBS a partir da placa e preencher o microsistema com meio celular. Deixe-incubar durante 1 hora para saturar os canais com o meio.
   NOTA: Para os experimentos que envolvem drogas como inibidores de molécula, é aconselhável pré-incubar os canais com um meio contendo a droga na concentração correta. Além disso, alguns medicamentos tendem a solubilizar na estrutura PDMS que reduz a concentração eficaz. Algumas soluções têm sido propostas para contrariar este problema ^11-12.
2. Remover DCs flutuantes e recuperar as células semi-aderentes por lavagem com meio de cultura. Contagem de células utilizando um hemocitómetro.
   NOTA: Para imagens de núcleo, uma coloração de Hoechst 33342 pode ser conseguido por no antemãocubating 2 x 10 ⁶ células durante 30 minutos com o corante a 200 ng / ml em meio completo. Lavar duas vezes por centrifugação para remover o excesso de corante, antes de continuar o protocolo.
3. Centrifugar as células a 300 xg durante 5 minutos (o tempo e a velocidade pode ser diferente, dependendo do tipo de célula) e descartar o meio. Dilui-se o sedimento para atingir uma concentração de 20 x 10 ⁶ células / ml.
4. Remover o excesso de meio da placa e esvaziar os orifícios de entrada na estrutura de PDMS usando uma micropipeta. Encha as entradas com 5 mL de solução de células para atingir uma quantidade de 1 x 10 ⁵ células em cada orifício de entrada.
   NOTA: Alta densidade celular é necessária para favorecer o contacto das células com os canais. Baixa densidade celular pode resultar em menor número de células no interior de canais e fracasso da experiência.
5. Incubar o microchip durante 30 min a 37 ° C na incubadora. Adicionar 2 ml de meio completo para o ensaio de prato.
   NOTA: A estrutura inteira PDMS deve be coberto a fim de evitar a secagem das células durante a experiência. Se 2 ml não é suficiente, adicione mais meio para cobrir completamente a estrutura de PDMS.

4. Imagem

1. Limpar a superfície inferior externa dos pratos com tecido de limpeza de lentes antes da colocação das placas sob o microscópio.
2. Para analisar a migração em grande número de células, usar ampliação de 10X e de iluminação de campo numa ampla de CO ₂ e de temperatura equipado de vídeo-microscópio (Figura 3). Para facilitar o rastreamento de pilha, Hoechst coloração e luz UV pode ser usado (veja o passo 3.2). A migração pode ser também analisados ​​usando microscopia confocal a fim de obter maior resolução de estruturas celulares durante a migração.
3. Para a microscopia de lapso de tempo em 10X, escolha uma frequência de tempo de acordo com a velocidade da célula esperada (tipicamente 2 min para as células dendríticas que migram com uma velocidade de 5 mm / min).
   Nota: O protocolo descrito aqui faz not incluem a análise dos parâmetros de migração celular. Alguns pontos são listados na discussão para aconselhar os leitores sobre como proceder para extrair informações a partir de filmes de lapso de tempo.

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Resultados

Em cada experimento, a superfície do PDMS revestido com uma molécula adaptado para o interesse do estudo. Figura 2 mostra os canais revestidos com uma molécula fluorescente, PLL-g-PEG, antes e após a lavagem (passo 2.4). Tal experiência permite o controlo da homogeneidade do revestimento dos canais.

Após o carregamento da célula, microscopia de vídeo pode ser realizada a seguir a migração celular. Figura 3A mostra um exemplo de DC migrando em micro...

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Discussão

Descrevemos aqui um dispositivo composto por microcanais como um método para estudar as propriedades migratórias de grande número de células em experiências individuais. Este sistema experimental imita as restrições ambientais confinados encontradas em tecidos de células migratórias endógenos. No entanto, forçando a migração de uma única dimensão, que facilita o controle automático de células e a extracção da mensuráveis ​​(Figura 5). Também mostram que o nosso dispositivo é co...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2.5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254