Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Resumo

De alta resolução de imagem intravital com melhor contraste de até 120 mM profundidade em linfonodos de camundongos adultos é conseguido através espacialmente modular o padrão de excitação de um multi-focal microscópio de dois fotões. Em 100 microns de dimensão medimos resoluções de 487 nm (laterais) e 551 nm (axial), evitando, assim, os limites de espalhamento e difração.

Resumo

Monitoramento de comunicação celular por microscopia multi-fotão-tecido profundo intravital é a chave para a compreensão do destino das células imunes dentro amostras de tecido grosso e órgãos de saúde e doença. Ao controlar o padrão de varredura em microscopia multi-fotão e aplicar algoritmos numéricos apropriados, desenvolvemos uma abordagem listrado-iluminação, o que nos permitiu alcançar 3 vezes melhor resolução axial e melhor relação sinal-ruído, ou seja, o contraste, em mais de 100 mM de profundidade de tecido dentro dispersores tecido de órgãos linfóides, em comparação com microscopia multi-fotão padrão. A velocidade de aquisição, bem como de fotobranqueamento e fotoenvelhecimento efeitos foram semelhantes à técnica de foto-multiplicador baseado no padrão, ao passo que a profundidade da imagem era ligeiramente inferior devido à utilização de detectores de campo. Usando a abordagem de risca-de-iluminação, somos capazes de observar a dinâmica de depósitos de complexos imunes nas células dendríticas foliculares secundárias ̵1; sobre o nível de algumas moléculas de proteínas nos centros germinais.

Introdução

Microscopia de varredura a laser de dois fótons (TPLSM), com as suas vantagens para a geração de imagens de tecidos profundos relacionados ao infravermelho excitação pulsada ultra-curto ^1, revolucionou nossa visão sobre os processos vitais em um nível de uma única célula, revelando motilidade e interação de vários padrões subconjuntos de células em animais vivos ^2-5. No entanto, a tecnologia atual ainda é insuficiente para explicar os mecanismos da função de órgãos e disfunção como um pré-requisito para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, uma vez que torna únicas informações esparsas sobre a base molecular da resposta celular nos tecidos na saúde e na doença. A tecnologia actual permite apenas uma janela espaço de algumas centenas de microns, devido ao espalhamento da onda e os efeitos de distorção da frente sobre a resolução espacial e de sinal-para-ruído ^6, que são particularmente evidentes no tecido altamente compacta de animais adultos. Esses efeitos de distorção da frente de dispersão e onda são devido a uma uma grande heterogeneidaded distribuição anisotrópica de o índice de refracção no tecido, conduzindo a um primeiro passo para uma profundidade deterioração depende da resolução espacial 3D e finalmente para a perda total do sinal proveniente de fotões de excitação balísticos, ou seja, a perda de relação de sinal-para-ruído. Em termos de aplicações de tecido profundo biomédicas biotecnocientíficas e, isso significa que a tecnologia atual não é capaz de revelar de forma inequívoca a comunicação celular, porque pobre resolução levaria a interações falsamente positivos enquanto que a diminuição da relação sinal-ruído faria com que o sistema a ignorar alguns interações entre as estruturas fracas.

A fim de detectar de forma inequívoca interações celulares de uma forma dinâmica, uma resolução espacial muito melhorado é necessário profundo no interior do tecido. As técnicas Nanoscopia poderosos atualmente introduzidas com base em algoritmos numéricos especiais, por exemplo, abordagens estrutura de iluminação, sobre o esgotamento do primeiro estado animado, por exemplo, STED, RESOLFT, ou na localização molécula, por exemplo, dSTORM, PALM, encontraram muitas aplicações em células fixas, bem como em culturas de células vivas ^7. No entanto, a fim de estender esses aplicativos para cortes de tecidos, tecidos vivos e organismos ainda precisamos superar as dificuldades técnicas graves. Dois fotões de excitação STED com diferentes comprimentos de onda, bem como com um único comprimento de onda (sw2PE-STED) para a excitação e a emissão estimulada tem sido aplicado para melhorar a resolução lateral em fatias de cérebro ou em ^oito matrizes artificiais com células embutidas ^9, respectivamente, ao mesmo resolução axial como TPLSM padrão. Usando um fotão STED, a dinâmica das espinhas dendriticas pode ser trabalhada na superfície do córtex cerebral (até 10-15 microns de dimensão) de um rato vivo Thy1 EGFP com uma resolução de 67 nm, ^10. Uma ferramenta versátil para a biologia do desenvolvimento é fornecida pela microscopia estruturada-iluminação multifocal, que fornece duas vezes melhorado 2Dresolução. No entanto, esta técnica só pode ser utilizada em organismos com baixa propensão de espalhamento de luz, como embriões de peixe zebra ^11. Ainda, nenhuma destas técnicas pode ser aplicado no tecido altamente espalhamento de animais adultos em várias centenas de micrómetros, que são modelos cruciais para a investigação biomédica e clínica de doenças com inicio após o nascimento.

Independentemente da aproximação usada para calcular a forma da frente de onda de difração limitada, ou seja, a função de contagem de pontos (PSF), concentrando-se depois através de uma lente, a largura do PSF ao longo do eixo óptico (resolução axial) é, pelo menos, três vezes maior do que a largura PSF perpendicular ao eixo óptico (resolução lateral) ^12. Acene distorções da frente de diferentes ordens quantificados por coeficientes de Zernike modificar consideravelmente a forma da frente de onda da onda eletromagnética focado na geração de imagens de tecidos profundos levando a muito maiores PSFs, especialmente ao longo da ópticaal eixo ^13-15. Assim, tanto as leis de difração e os efeitos de distorção da frente de onda apontar para a resolução ao longo do eixo óptico, como o fator limitante na geração de imagens de tecidos profundos. Considerando que as técnicas Nanoscopia concentrar em contrariar os limites da difração só, uma tecnologia que melhora a resolução axial e contraste por contrariar tanto difração e efeitos de distorção de onda-frente é necessária para alta resolução de imagens intravital. Idealmente, esta técnica deve ser igualmente rápido o suficiente para permitir o monitoramento da dinâmica celular.

A correção em tempo real das aberrações do PSF e perda de contraste usando óptica adaptativa em TPLSM tem sido amplamente estudado e melhorado na última década ^13,14,16-18 e, portanto, é a melhor escolha atualmente disponível levando a uma melhor gestão da excitação balístico fótons ^14. Ainda assim, devido ao fato de que a maior onda de correção frente abordagens utilizadas na óptica adaptativa são iterativos e que have ser repetido para pequenas áreas (poucos 10 x 10 um ^2), devido à grande heterogeneidade do índice de refracção no tecido, a velocidade de aquisição é significativamente menor do que o necessário para a motilidade das células de imagiologia e de comunicação. Além disso, o limite físico em ótica adaptativa melhorou TPLSM ainda é determinada por difração.

Modulação espacial de iluminação (SPIN) e modulação temporais no lado de detecção (pá) foram teoricamente proposto para ser aplicada a microscopia de varrimento de laser para melhorar a resolução. A sua aplicação prática em imagens intravital ainda precisa ser demonstrado ^19.

Tomados em conjunto, há uma alta demanda para o desenvolvimento de tecnologias que melhoram a resolução de imagem de tecidos profundos em animais adultos vivos. Neste trabalho, nós conseguimos modulação espacial do padrão de excitação, controlando o processo de digitalização em multi-feixe de risca-de-iluminação multi-fotão de laser-smicroscopia de conservas (MB-SI-MPLSM) ^20. Ao contrário do que as abordagens de iluminação estruturada, em que a secção de excitação travessa é espacialmente modulados, usamos apenas o processo de digitalização para alcançar a modulação espacial da excitação. Ao expandir a excitação de um comprimento de onda mais longo, que são capazes de melhorar a resolução espacial e relação sinal-ruído em tecidos profundos de dispersores tecido (por exemplo, do nó de linfa, o caminho livre de espalhamento de 47 mM ^6), independentemente da óptica sinal não-linear que detectar, por exemplo, de fluorescência, geração de segundo harmônico ou outra freqüência mistura fenômeno. Usando essa abordagem em comprimentos de onda de excitação de até 900 nm, somos capazes de dinamicamente imagem estruturas de proteína celular na escala de algumas moléculas em centros germinativos dos linfonodos do mouse. Assim, podemos visualizar melhor a interacção entre as unidades de antigénio transportando na superfície das células foliculares dendríticas e células B no processo de sondagem do antigen durante a resposta imunitária de órgãos linfóides secundários.

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Protocolo

Instalação Multi-feixe para Striped-iluminação TPLSM

A configuração usada aqui é um multi-feixe de dois fótons microscópio de varredura a laser especializado, como descrito anteriormente ^6,20. O sistema encontra-se ilustrada na Figura 1. Esta abordagem pode ser aplicada a outros microscópios de varrimento laser de dois fotões, que são capazes de sincronizar aquisição câmara com o movimento dos espelhos galvoscanner, mesmo que eles só são capazes de realizar a verificação de feixe único . Neste caso, a desvantagem será uma velocidade de aquisição de menor, no entanto, semelhante à velocidade de aquisição em TPLSM baseado no PMT padrão. Para atingir a qualidade ideal medida em resolução e contraste estão em causa, com o menor fotodegradação e fotoenvelhecimento e aquisição mais rápida, é recomendável considerar as seguintes etapas de ajuste da configuração:

1. Verifique a potência do laser do laser Tisa: verifique a 100%, compare com os valores originais de fábrica e previonós próprios leituras e usá-lo como ele é, se um comprimento de onda de excitação na faixa 700-1,000 nm é necessária.
2. Teste a indicação de controle remoto para o Ti: Sa divisor de feixe, verifique ou seja 0% e 100% configurações. Se houver uma viga remanescente Tisa em 100%, em seguida, verificar e redefinir a posição nula motor de passo. O Ti: Sa divisor de feixe consiste em uma baixa ordem λ / 2 prato e um polarizador, que divide os feixes de laser perpendicularmente polarizados em caminhos perpendiculares: um feixe é direcionado para o microscópio para a excitação, o outro é usado para bombear o paramétrico óptico oscilador (OPO). Ao rodar automaticamente a placa de λ / 2, um ajustamento contínuo do Ti: Sa e poder OPO, respectivamente, é conseguido.
3. Ajuste o OPO para o comprimento de onda desejado e medir a potência de saída. Se a energia é muito baixo (com um 4 W Ti: Sa laser em 800 nm, a pessoa deve ser capaz de obter 0,8-1 W de feixe OPO em torno de 1,050-1,100 nm) otimizar o comprimento de onda de bombeamento e verifique as configurações do diae espelho e do cristal se espalharam. Escolha seus valores recomendados ideal, muitas vezes disponíveis como tabelas ou gráficos e, em seguida afinar-los até que a OPO ressoa na saída do comprimento de onda desejado e os aumentos de potência.
   1. Se o poder ainda é baixo, ajustar os dois espelhos acessíveis do OPO com os quatro botões de ajuste do espelho acessíveis. Faça este passo muito lentamente e em movimentos muito pequenos, alternando entre a frente e finais espelhos.
4. Verifique se o Ti: Sa e / ou OPO vigas acertar os espelhos de entrada na posição adequada, central.
   1. Use um pedaço de papel branco (não muito brilhante ou refletindo!) E um visualizador de infravermelho para observar o feixe OPO eo de maior comprimento de onda Ti: vigas de Sá.
      1. Usar óculos de protecção ao trabalhar com NIR Ti: vigas SA (geralmente até 720-750 nm é visível para a pessoa média).
   2. Ajustar a potência (s) de laser tão baixa quanto possível para o processo de alinhamento, de modo a mimizar lesões oculares potencial.
   3. Sempre mantenha luzes ambiente da sala, por isso que a pupila do olho é restrito.
   4. Tenha em mente que a potência do laser é de atenuadores que consistem de um prato e polarizadores λ / 2, que não estão em vigor ainda quando o Ti-controlado bem: feixe de Sa-entra na cabeça de leitura!
5. Verifique se o diafragma ponto de entrada é atingido no meio pelo Ti: Sa e / ou OPO feixe; se não, ajustar os últimos dois espelhos antes de o feixe de laser entra na cabeça de leitura.
   1. Use o espectador IR e um pequeno pedaço de papel branco (mas não brilhante / reflexiva!).
   2. Sempre fechar o diafragma, a entrada para o microscópio, de modo que a posição do feixe de laser pode ser considerado de forma mais precisa. Importante: Não se esqueça de reabrir o diafragma antes de prosseguir para a etapa 6!
6. Ajuste o caminho da luz a laser feixe refletido no microscópio em conformidade. Faça isso em pequenos segmentos e realizar iterativo raio-waLKing.
   1. Verifique a todo o percurso da luz, se a saída de luz da lente objectiva não é adequada.
   2. Verifique sempre o caminho da luz quando se utiliza o sistema pela primeira vez depois de um longo período inativo, uma grande reparação, qualquer substituição de elementos ópticos, ou se houver suspeita de problemas de existir com a saída.
7. Certifique-se de que todas as superfícies ópticas ativas são limpos, especialmente que eles estão livres de poeira! Se as superfícies são cobertas com uma camada de pó, a frente de onda distorcida é mesmo antes de entrar na lente objectiva e o feixe de laser resultante nunca irá proporcionar uma imagem nítida da amostra!
   1. Se necessário, limpe os espelhos com um pedaço de papel dobrado lente, umedecido com etanol ou isopropanol.
8. Verificar que o feixe de chegada de volta para o espelho, que está localizada directamente por cima do espelho de entrada na extremidade do compressor de impulsos baseado em prisma, depois do percurso da luz é definido. A partir daqui, o raio é refletido into o multiplexador feixe (BM).
9. Verificar se o feixe de laser atinge a membrana, que está localizado na entrada do multiplexador feixe, imediatamente antes da placa λ / 2, mudando a polarização do feixe de laser para se adequar aos requisitos de uma banda larga de 50% de transmissão e 50% de reflexão dentro da BM.
   1. Em primeiro lugar, a fechar o diafragma de modo a que a posição do feixe pode ser julgado com mais precisão e efectuar viga curta entre os dois diafragmas, ou seja, a de a entrada no microscópio e o outro na entrada BM. Para outros microscópios de varredura de feixe único do diafragma deve ser colocado na entrada no xy-scanner.
   2. Se o feixe não atingir o centro da abertura fechada para baixo, ajustar o espelho acima mencionado, colocada directamente em frente da entrada do diafragma BM. Importante: Não se esqueça de reabrir o diafragma antes de prosseguir para a etapa 10.
10. Com o diafragma reaberto, verificar se o feixe de laser atinge os espelhos BM emseu ponto médio. Use uma tira estreita de papel, de modo a não bloquear uma outra parte do complexo-luz caminhos da BM!
11. Verifique se o feixe atinge o meio dos espelhos de saída: Espelho superior para polarização paralela "P", espelho de fundo para perpendicular polarização "S". Se não, ajuste o espelho de entrada antes do BM.
12. Verifique se o "S" e "P" feixe polarizado permite que grupos de entrar no cubo polarizador e se sobrepõem de forma adequada na entrada no xy-scanner. Ir estes passos no caso de um microscópio de varredura de feixe único é usado.
13. Verifique se a luz do laser passa centralmente a digitalização e as lentes de tubo e fica no meio da lente objetiva 'avião de volta focal. Importante: este passo tem de ser feito com o feixe de laser na posição central, não estão em posição de estacionamento!
    1. Substitua a lente objetiva com uma ferramenta com o objetivo ("olho de boi") e verifique se o feixe de laser atinge o alvo no meio, e se ailuminação é mesmo.
    2. Se este parece ser o caso, fechar a abertura antes do BM e verificar se um padrão de interferência circular aparece, com um círculo preto no meio (mínimo de interferência).
       1. Ajuste o espelho de entrada, se houver uma mudança significativa em relação ao centro do olho do touro.
14. Agora substitua o olho do touro com uma lente objetiva, por exemplo, com uma lente de imersão em água 20X.
    1. Verifique o campo de luz de saída com um pedaço de papel branco. Este deve ser brilhante, uniforme e posicionado centralmente.
    2. Medir a potência de saída: em 100% OPO com 100% de bombeamento Ti: Sa (4 W), deve-se obter aprox. 100-150 mW após a lente de 1,100 nm (no microscópio utilizado aqui). Poderes de laser mais baixas não serão suficientes para a realização de multi-feixe SI-TPLSM. Para a digitalização de feixe único SI-TPLSM, 5-10 mW são suficientes. O feixe de laser deve permanecer na posição central sem ser scanned!
15. Se realizar MB-SI-TPLSM, alinhar os espelhos na BM como segue:
    1. Coloque uma amostra homogénea fluorescente, por exemplo, um deslizamento de fluorescência vermelha, no palco e focar o feixe de laser dentro da amostra, mas perto da superfície superior (ou seja, perto da lente frontal da objectiva).
    2. Definir o microscópio para o modo multi-feixe e escolher o número de feixes, no inicio, de preferência, apenas um raio, e a polarização, por exemplo, "P".
       1. Encontre o feixe de laser pela imagem do slide fluorescente: definir o obturador "P" abrir e executar a câmera CCD continuamente enquanto focando o feixe.
       2. Certifique-se de que o feixe está na posição central, e que o scanner está desligado. Certifique-se que o feixe não é digitalizado!
       3. Encontre o feixe de olhar para um ponto brilhante perto do centro do chip da câmera.
       4. Concentre-se o feixe até o local é o mais brilhante e mais nítida, ou seja, o plano de imagem deo microscópio corresponde à posição da câmara de chip; A redução da potência do laser de modo a que o local não está saturado. Com um sistema bem alinhados, isto significa que a energia do laser tem de estar perto mínimo quando se trabalha no modo de um feixe (cerca de 0,6 mW de potência de laser deve funcionar).
       5. Se o local é significativamente fora do centro, movê-lo para mais perto do centro, ajustando o espelho na frente do BM (ou do scanner para a digitalização de feixe único).
       6. Quando também alinhar a outra polarização, ou seja, "S" do feixe, agora mudar para o modo 2-beam, abra o obturador "S" e verifique a posição do feixe (apenas um feixe pode ser visto que apenas o botão do obturador "S" está aberto ).
       7. Quando terminar, mudar para o modo de 4 feixes e usar o modo de polarização "P" (shutter "P" aberto). Agora, dois beamlets aparecerá.
       8. Organize as duas beamlets ser perfeitamente paralelos à borda inferior de vista da câmera, e pô-los a ser de 2,8 mM de intervalo.
          1. Se eles não estão alinhados corretamente, ajuste o primeiro espelho da BM.
          2. Nunca alinhar o parafuso no meio, em vez usar os dois parafusos periféricos para mover o espelho até que os dois feixes são 2,8 hum distante e perfeitamente dispostas horizontalmente.
       9. Agora mude para o modo de 8-beam na polarização "P", e ajuste o segundo espelho BM (também sem o ponto vermelho) até as 4 beamlets são eqüidistantes de 2,8 um, e estão dispostos paralelamente à borda inferior da imagem.
       10. Repetir em 16 - e modo de 32-feixe, ajustando os 3 º e 4 espelhos BS, respectivamente. É importante para os beamlets ser equidistante porque SI-algoritmos, o mais simples de ser o algoritmo min-max (HiLo), são baseadas nesta suposição.
16. Substitua a amostra uniformemente fluorescente com um heterogênea estruturada, por exemplo, raízes Convallaria cross-manchadas.
    1. Vá para a posição de estacionamento do feixe de excitação, which geralmente é colocado em grandes valores das coordenadas do scanner, por exemplo, (10.000; 10.000).
    2. Digitalizar uma imagem (multi-feixe) com a câmera CCD. Verifique se a imagem aparece nítida, uniforme, e em linha reta.
    3. Ajuste a câmera se a imagem aparece girado: torcer o corpo da câmera axial em torno do eixo vertical com a mão (seja gentil!) Até que a imagem é esticado.
17. Inicie o xy-scanner para controlar o processo de verificação para gerar o padrão de excitação, ou seja, imagem listrado.
    1. No caso da verificação de multi-feixe, mover o espelho y-scanner, ou seja. perpendicular à linha beamlet, de modo a gerar uma imagem listrado quadrática.
    2. Se o campo de visão gerado como descrito no passo 17.1. é muito pequena, estender a rotina de varrimento, movendo o espelho x-scanner para uma posição de assegurar que o feixe de linha-let é dobrado e as beamlets são equidistantes ao longo de toda a linha. Repita o movimento exatodo espelho y scanner após o espelho x scanner é movido para gerar a imagem listrado maior.
    3. No caso de varredura de feixe único, alterne o movimento espelho y-scanner com x-scanner de movimento espelho várias vezes em posições equidistantes - definidos pelo cientista - para gerar a imagem listrado desejado.
    4. Certifique-se usar para o movimento do espelho y-scanner de um comando para a velocidade constante (redução de aceleração / desaceleração) e para o x-scanner de espelho, um de velocidade máxima (aceleração máxima / desaceleração).
18. Automaticamente adquirir e guardar a imagem listrado com a câmera (campo-detector). Portanto, sincronizar a câmera com o scanner e usar o scanner como o gatilho mestre.
19. Repetir a obtenção de imagens listradas (protocolo de varrimento descrito no Protocolo 17), movendo o espelho x scanner em posições diferentes, como se segue:
    1. Escolha passos repetição suficiente eo comprimento do passo adequado entreduas imagens subsequentes listradas para cobrir a distância entre os dois beamlets consecutivos (neste caso 2,8 um e um passo dos espelhos de scanner iguala 25 nm); pode ser aconselhável permitir um pouco de sobreposição, isto é, um adicional de 0,3-0,4 ^ m.
    2. Defina o x-mudança para um valor que corresponda ao limite de resolução lateral no comprimento de onda dado. Como um exemplo, usando 10 passos do espelho x scanner por turnos e 12 ou 13 turnos levar a melhor axial e resultados de resolução laterais neste sistema. Verifique com um slide estruturada, por exemplo, Convallaria raízes slide, os números funcionam melhor no sistema que está sendo usado.
    3. Optimizar estes dois valores até que a imagem se torna mais nítida Convallaria: utilizar a ferramenta de perfil de linha nas imagens SI calculados e comparar a largura dos perfis de linha (que é o sinal de fluorescência a partir de paredes celulares Convallaria).
    4. Adquirir cada imagem listrado sincronizado com o movimento do scanner e guardá-lo em separado, por exemplo, como TIFF ou arquivos binários.
20. Abra um conjunto completo de imagens listradas como matrizes, ou seja, matriz 3D, na rotina de avaliação e usar o algoritmo min-max ou um algoritmo de Fourier-transform para gerar uma matriz 2D de alta resolução SI-imagem. Os algoritmos foram previamente descritos em pormenor ^20.

Ratos Imunização e Preparação para Imagem intravital

Os experimentos com animais foram aprovados pelos comitês estaduais apropriadas para bem-estar animal (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) e foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos (animais experimento licença G0153/08) atuais.

21. A indução de uma resposta do centro germinativo no nódulo linfático poplíteo e preparação do campo de imagem foi realizada como se descreveu antes ^4. Purifica-se as células B a partir de baços de imunomagneticamente B1-8 ^{+ / +} Jκ ^{- / -}e as células B de B1-8 ^{+ / +} Jκ ^{- / -} GFP ⁺ ratinhos.
22. Injectar por via intravenosa 3 x 10 ⁶ células específicas NP-B com uma pureza de> 95%, utilizando ⅛ B1-8 ^{+ / +} Jκ ^{- / - +} GFP não fluorescente e ⅞ B1-8 ^{+ / +} Jκ ^{- / -} em C57BL / 6 receptores .
23. Um dia após a transferência de células imunizar os recipientes com 10 mg de NP-CGG (nitrofenil-globulina de galinha ɣ) emulsionado em adjuvante completo de Freund (CFA) no bloco de alimentação posterior direita.
24. Fragmentos de anticorpos Fab etiqueta anti-CD21/CD35 com éster ATTO590-succinimidilo.
    1. Para realçar a rede de células dendríticas foliculares (CDF) dentro do centro germinal in vivo, injectam 10 ug de fragmentos Fab marcado com fluorocromo na almofada da pata traseira direita dos ratos 12-24 horas antes da análise é realizada intravital.

Os seguintes passos devem ser considevermelho para a preparação do linfonodo poplíteo para imagens intravital (dia 8-10 após a imunização):

25. Anestesiar rato por injecção ip de cetamina / xilazina, a quantidade dependendo do seu peso.
26. Teste reflexos para monitorizar a profundidade de anestesia ao longo de todo o período de imagem.
27. Shave perna, costas e flanco direito do rato rigorosa e usar creme Depilating para remover pêlos residual completamente.
28. Fix trocânter maior direito: localizar chip de ósseo com os dedos, coloque uma pequena incisão na pele com uma tesoura até um pequeno branco fascia forma de triângulo aparece.
29. Braçadeira de chips óssea abaixo desta fáscia com pinças pontudas do limitador.
30. Fixe a coluna na área lombar, usando uma pinça dentada.
31. Fix pata traseira direita em limitador e aperte o parafuso.
32. Fita cauda para manter a perna na posição direita.
33. No lado caudal da coxa, criar uma incisão na pele, na área em que a veia ente poplítea proeminenters o tecido, separar a pele do tecido subjacente com uma pinça sem corte e seguir a veia poplítea de proximal para distal.
34. Exponha o linfonodo, usando uma pinça sem corte, para tentar evitar o corte, a fim de proteger os finos vasos linfáticos (manter o linfonodo em PBS durante a exposição).
35. Criar um círculo de graxa de vácuo ao redor do nó de linfa, preencher essa poça com PBS.
36. Coloque tampa deslizante na sua posição e colocar a sonda-termómetro (manter a temperatura a 37 ° C, caso contrário a velocidade das células irá variar dramaticamente).
37. Ao longo da borda superior da lâmina de cobertura adicionar um círculo de graxa vácuo.
38. Coloque a bobina de aquecimento na sua posição sobre a graxa de vácuo, criar um selo de forma semelhante como antes e adicionar água / PBS sobre a lamínula de vidro para mergulhar o objetivo em.
39. Após a imagiologia, o rato é mantido em anestesia, enquanto o aumento das doses de cetamina / xilazina a uma dose letal, seguido por deslocação cervical.

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Resultados

A resolução espacial nos linfonodos

As dimensões da função de ponto de difusão efetivo (EPSF) correspondem à resolução espacial de um microscópio ^12. Medimos essa função tridimensional através da aquisição do sinal de segunda geração harmônicos de fibras colágenas em linfonodos pela nossa MB-SI-TPLSM, em comparação com as técnicas estabelecidas de dois fótons de microscopia de varredura a laser, ou seja TPLSM detecção de campo (por meio de câmeras C...

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Discussão

O objectivo da imagiologia óptica intravital é dinamicamente e funcionalmente visualizar a motilidade celular e interacções, a fim de compreender a função do órgão e tecido na saúde e na doença ^5. A tecnologia mais poderosa para atingir esse microscopia de varredura a laser, multi-fotão, ainda tem que superar as limitações relacionadas com a onda distorções frontais, dispersão, aquisição lenta, fotodegradação e fotoenvelhecimento, que limitam a sua resolução espacial, contraste, bem como...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATTO590 – NSH for coupling	ATTO Tec, Germany	AD-590-35
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590	DRFZ, Berlin		The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+	Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US		Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment	StemmCell Technologies, Germany	19854
Polystyren beads (605), 0.2 µm	Life Technologies, Germany	F8803
Equipment
TriMScope I	LaVision Biotec, Bielefeld, Germany
OPO (manual version)	APE, Berlin, Germany
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II	Coherent, Duisburg, Germany
Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm	Olympus Germany, Hamburg, Germany