Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Resumo

PCR combinada com a análise de fusão de alta resolução (HRMA) é demonstrado como um método rápido e eficiente para a genotipagem de peixe-zebra.

Resumo

Zebrafish é um poderoso sistema modelo para o estudo de vertebrados desenvolvimento, modelagem de doenças, e realizar a triagem de drogas. Recentemente, uma variedade de ferramentas genéticas foram introduzidas, incluindo várias estratégias para induzir mutações e gerar linhagens transgênicas. No entanto, o rastreio em larga escala é limitada pelos métodos de genotipagem tradicionais, que são consumidoras de tempo e de trabalho intensivo. Aqui nós descrevemos uma técnica para analisar genótipos zebrafish por PCR combinada com análise de alta resolução de fusão (HRMA). Esta abordagem é rápida, sensível e de baixo custo, com menor risco de artefatos de contaminação. A genotipagem por PCR com HRMA pode ser usado para embriões e peixes adultos, incluindo protocolos de triagem de alto rendimento.

Introdução

Peixe-zebra (Danio rerio) é um sistema de modelo animal vertebrado amplamente utilizado para estudos de desenvolvimento e modelagem de doenças. Recentemente, várias tecnologias transgênicas e mutação foram desenvolvidos para zebrafish. Técnicas de transgenia rápidos, geralmente com base em um sistema de transposon Tol2 ^1, foram combinados com melhores opções de clonagem para uma montagem múltipla fragmento de DNA ^2. Nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e de transcrição nucleases efectoras activadores do tipo (TALENS) têm sido utilizadas para direccionar loci em ambas as células somáticas e germinais em peixes-zebra ^3,4. Estas técnicas podem gerar de forma eficiente animais geneticamente modificados, com alta freqüência de criação e transmissão de mutação germinal ^3,4.

Apesar destes avanços, técnicas de genotipagem tradicionais em zebrafish limitar o poder das ferramentas de mutagênese e transgenia. PCR, seguida por electroforese em gel, por vezes combinados com DISSEMINAÇdigestão enzimática n, é amplamente utilizado para detectar a modificação do genoma, mas é demorada e menos sensível à identificação de pequenas inserções ou deleções. Ensaios de sonda TaqMan têm altos custos iniciais e requerem otimização cuidadosa. A sequenciação de produtos de PCR pode levar vários dias e não é prática para a triagem em grande escala. Análise do polimorfismo de fragmentos de restrição (RFLP) só pode discriminar SNPs que afetam um número limitado de sítios de reconhecimento de enzimas de restrição.

A análise de alta resolução de fusão (HRMA), um tubo fechado, o método de análise pós-PCR, é um método recentemente desenvolvido que é rápido, sensível, pouco dispendioso, e passíveis de rastreio de grandes números de amostras. HRMA pode ser utilizado para detectar SNPs, mutações e transgenes ^5-7. HRMA é baseada em desnaturação térmica de ADN de cadeia dupla, e cada fragmento amplificado de PCR tem um único dissociação (derreter) característica ^5. As amostras podem ser discriminados devido to a sua composição de nucleótidos diferente, teor de GC, ou comprimento, tipicamente em combinação com um corante fluorescente que se liga somente o ADN de cadeia dupla ^8. Assim, HRMA pode distinguir diferentes genótipos com base nas diferentes características de fusão-curva. Porque HRMA utiliza reagentes de baixo custo e é um processo de pós-PCR de etapa única, que pode ser usado para as estratégias de alto rendimento. HRMA é não destrutiva, de modo que após a análise dos produtos de amplificação de PCR podem ser usados ​​para outras aplicações. HRMA foi aplicado em muitos organismos e sistemas, incluindo linhas celulares, ratos e seres humanos ^9-11. Seu uso foi recentemente descrito no peixe-zebra para detectar mutações induzidas por nucleases dedo de zinco (ZFNs) e Talens ^6,12,13.

Neste artigo, descrevemos como executar HRMA baseado em PCR em zebrafish embrionárias e adultas (Figura 1). Este protocolo é adequado para a detecção de SNPs, os transgenes e mutações, incluindo simudanças ngle de pares de bases, inserções ou exclusões.

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Protocolo

1. Preparação de DNA

1. Preparar tampão de lise de ADN: 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% de Tween 20, 0,3% de NP40. Adicionar fresco proteinase K para uma concentração final de 1 mg / mL, no dia da utilização ^12.
2. Coleção de tecidos:
   1. Para o adulto clipe fin fish:
      1. Anestesiar peixe: Coloque o peixe em 0,004% solução (tricaina) MS-222. Espere até que o movimento de emalhar diminui.
      2. Coloque os peixes em uma pilha de 5-10 Kimwipes e cortar um pequeno pedaço da barbatana caudal, cerca de 2-3 mm, com uma lâmina de barbear estéril.
      3. Colocar rapidamente o peixe em um tanque rotulado com água fresca para a recuperação; rotular cuidadosamente tanto o tanque e correspondente tubo que contém o clipe de fin. Troque a água e alimentar os peixes todos os dias.
      4. Pegue o clipe fin com uma ponta de pipeta estéril e transferi-lo para um tubo preenchido com 100 mL tampão de lise de DNA.
      5. Descarte a ponta da pipeta, e descartar a lâmina de barbear em um recipiente apropriado.
   2. Por cauda embrião clipe:
      1. Coloque embriões em 0,004% solução (tricaina) MS-222. Espere 2 min.
      2. Corte um pedaço da cauda com uma pinça sob um microscópio de dissecação.
      3. Coloque a cauda para um tubo rotulado cheio com 30 uL de tampão de lise de ADN.
      4. Rapidamente colocar o embrião para um tubo contendo 100 jil de 4% de paraformaldeído.
      5. Tubos etiqueta com embriões e seus tubos de cauda correspondentes.
      6. Armazenar os tubos com embriões a 4 ° C durante a noite para a fixação.
      7. Limpar os fórceps usando água Milli-Q e Kimwipes entre cada embrião para minimizar a contaminação.
   3. Para embriões inteiros:
      1. Coloque embriões em 0,004% solução (tricaina) MS-222. Espere 2 min.
      2. Colocar 1-5 embriões num tubo cheio com 100 ul de tampão de lise de ADN. Dechorionation não é necessário.
3. Digestão do DNA
   Incubar os tubos com o tecido (ou nadadeira da cauda clips ou embriões) a 55 ° Cpara 4 horas até durante a noite ^12.
4. Desativar o Proteinase K
   Tubos de calor a 95 ° C durante 15 minutos ^12. DNA deve ser utilizado para a PCR imediatamente ou armazenada a -20 ° C durante até 3 meses.

2. PCR

1. Projeto Primers manualmente ou por software de desenho de primer (por exemplo Lightscanner Primer Projeto Software-Biofire). Os produtos de PCR para HRMA são geralmente de 50-200 pb, os produtos de PCR para a detecção de SNP pode ser menor, tipicamente 50-80 pb.
2. PCR
   1. Realizar a reacção de PCR em um de 96 poços ou de 384 poços da placa.
   2. Utilizar 10 mL volume total: 4 ul de mistura principal LightScanner (0,1 L quente iniciar a Taq-polimerase AB, tampão, dNTP 0,2 mM, cloreto de magnésio 2 mM, 1x e corante de ligação a ADN de cadeia dupla fluorescente), 5 pmol de cada iniciador, e 1 uL de ADN genómico extraído de modelo de barbatana adulto ou 3 ul de DNA genómico a partir de cauda embrionária ^13.
   3. Amostras de cobertura com 30 mL de óleo mineral.
   4. Cobrir a placa com um selo adesivo opticamente transparentes.
   5. Optimizar PCR condições de ciclismo típicos, são condições de 95 ° C durante 5 min, e 30 ciclos de 10 seg a 95 ° C, 25 seg a 60 ° C, 30 seg a 72 ° C, terminando com 95 ° C durante 30 seg e arrefecida a 15 ° C.
   6. Armazene PCR placas a 4 ° C ou continuar diretamente para HRMA.
   7. Confirmar nosso produto de PCR por análise do seu tamanho utilizando electroforese em gel de agarose durante a optimização inicial de PCR e, se indicado, por sequenciação do produto de PCR.

3. HRMA

1. Placas de calor
   1. Coloque a placa em um sistema de análise de fusão.
   2. Abra o software (Software LightScanner Chame-IT 2.0).
   3. Placas de calor 60-95 ° C.
   4. Crie um novo arquivo de armazenamento de dados.
2. Analisar dados HRMA (Figura 2).
   Várias etapas de análise são possíveis. Mostramos o conjunto mais comumente usado de dados manipulations.
   1. Definição de subconjunto
      Clique na aba subconjunto. Selecione os poços com amostras.
   2. Normalização
      1. Selecione a guia Normalize no painel à esquerda. Para eliminar variação de fluorescência, posicionar manualmente a dupla linha paralela na pré-(inicial) e pós regiões (final) derreter como ilustrado (Figura 2C, pontas de seta) e normalizar os sinais de fluorescência premelt e pós-fusão de todas as amostras a 1 e 0 , respectivamente ^14.
      2. Ajustar o posicionamento das linhas de modo que a região de fusão é, na região entre as linhas de pré-e pós-melt, mas não seleccionado. Em geral, quanto menor Min e Baixa Max (e Superior Min e Max superior) linhas de temperatura deve ser colocado cerca de 1 ° C à parte.
      3. Escolha posições de temperatura para a normalização de tal forma que todas as amostras têm (100%) de fluorescência máxima ou total para a região premelt e mínima ou nenhuma (0%) de fluorescência para a região pós-fusão (da melhor forma posvel). A normalização deve resultar em uma linha quase horizontal na parte de fluorescência máxima de 1 que se estende até ao ponto de fusão e, em seguida, uma linha quase horizontal a partir do ponto de fusão na fluorescência mínima de 0, não deve haver níveis de fluorescência acima ou abaixo de 1 0 . Por exemplo, na figura 2C, normalizar as curvas premelting usando gamas de temperatura de 79-80 ° C.
   3. Agrupamento / Clustering
      Distinguir os genótipos com base na sua temperatura de fusão (Figura 2C, caixa verde). Selecione Agrupamento.
      1. Selecione autogroup na lista de seleção Padrões na seção Agrupamento.
      2. Selecione Normal ou Alta para a fusão de perfis com transições individuais ou várias transições, respectivamente, na lista de seleção de sensibilidade na seção Agrupamento.
      3. Selecione ComputeGrupos na seção Agrupamento.
      4. Vá para o menu Arquivo e clique em Salvar para salvar os resultados.

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Resultados

O protocolo pode ser realizada durante um único dia ou separada em passos ao longo de vários dias (diagrama de fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1). Extracção de ADN é seguida pela análise de fusão e de produtos de amplificação de PCR. As temperaturas para a fusão do fragmento amplificado dependerá do tamanho e conteúdo GC, mas geralmente iniciar e as temperaturas finais de 50 ˚ C e 95 ˚ C são adequados (Figuras 2A e 2B). Uma vez que a fusão é rea...

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Discussão

PCR combinada com HRMA é uma tecnologia poderosa para a genotipagem do peixe-zebra. As vantagens desta abordagem são a sua velocidade, robustez, e a sensibilidade para detectar mesmo mutações pontuais. O protocolo de todo, a partir de aleta-grampo análise para derreter-curva, pode ser realizada em menos de oito horas, por um único indivíduo. Além disso, a técnica é tratável através de rastreio de alto rendimento; não requer a utilização de brometo de etídio, e é selada por todas as etapas de PCR e de an...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates	Bio-Rad Laboratories	HSP9665	www.bio-rad.com
Microseal 'B' Adhesive Seals	Bio-Rad Laboratories	MSB1001	www.bio-rad.com
96-well LightScanner Instrument	BioFire	LSCN-ASY-0040	www.biofiredx.com
LightScanner Software with Call-IT 2.0	BioFire		www.biofiredx.com
High-resolution Melting Analysis 2.0	BioFire		www.biofiredx.com
LightScanner Primer Design Software	BioFire		www.biofiredx.com
Vector NTI Software	Invitrogen		www.invitrogen.com
Tricaine
Paraformaldehyde