In situ compressão de carga e de imagem não invasivos Correlative do Osso-Ligamento periodontal de dentes fibrosa Joint

Resumo

Neste estudo, será discutido o uso de um dispositivo de carga acoplada situ com tomografia de raios de micro-X calculado para biomecânica fibrosos. Leituras experimentais identificáveis ​​com uma mudança total na biomecânica incluem: 1) força reacionária versus deslocamento, deslocamento de dentes ou seja, dentro do alvéolo e sua resposta reacionária do carregamento, 2) tridimensional (3D) de configuração espacial e morfometria, ou seja geométrica relação do dente com o alvéolo, e 3) mudanças nas leituras 1 e 2, devido a uma mudança no eixo de carga, ou seja, cargas concêntricas ou excêntricas.

Resumo

Este estudo demonstra um protocolo de testes de novas biomecânica. A vantagem deste protocolo inclui a utilização de um dispositivo de carregamento em situ acoplados a um microscópio de alta resolução de raio-X, permitindo assim a visualização dos elementos estruturais internos sob cargas fisiológicas simulados e condições de humidade. Espécimes experimentais incluirá ligamento periodontal osso intacto (PDL) de dentes articulações fibrosas. Os resultados irão ilustrar três características importantes do protocolo, como eles podem ser aplicados a biomecânica nível órgão: 1) força reacionária versus deslocamento: deslocamento do dente dentro do alvéolo e sua resposta reacionária do carregamento, 2) tridimensional (3D) configuração espacial e morfometria geométrica: relação do dente com o alvéolo, e 3) mudanças nas leituras 1 e 2, devido a uma mudança no eixo de carga, ou seja, a partir de concêntrica a cargas excêntricas. A eficácia do protocolo proposto será avaliada por acoplamento te mecânicaleituras picada a morfometria 3D e biomecânica global da articulação. Além disso, esta técnica vai enfatizar a necessidade de equilibrar as condições experimentais, as cargas especificamente reacionários antes de adquirir tomografias de articulações fibrosas. Deve notar-se que a proposta de protocolo é limitada a testes de amostras ex vivo sob condições, e que o uso de agentes de contraste para visualizar a resposta mecânica do tecido mole pode levar a conclusões erradas sobre tecidos e órgãos de nível biomecânica.

Introdução

Vários métodos experimentais continuar a ser utilizado para investigar a biomecânica de articulações diartrodiais e fibrosas. Métodos específicos para a biomecânica do órgão de dente incluem o uso de medidores de tensão ^1-3, métodos de fotoelasticidade ^{4, 5,} Moiré interferometria ^{6, 7,} eletrônico padrão speckle interferometria ⁸ e correlação de imagens digitais (DIC) ^9-14. Neste estudo, a abordagem inovadora inclui não-invasivo através de raios-X para expor as estruturas internas de um conjunto fibroso (tecidos mineralizados e suas interfaces que consistem em zonas mais suaves, e uma interface de tecidos, tais como ligamentos) com cargas equivalentes para as condições in vivo. Um dispositivo de carregamento situ acoplados a um microscópio de micro-raios-X serão utilizados. O tempo de carga e as curvas de deslocamento de carga será recolhida como o molar de interesse dentro de um rato hemi-mandíbula recém-colhida é carregada. A mobjetivo ain da abordagem apresentada neste estudo é enfatizar o efeito da morfologia tridimensional do dente-osso, comparando as condições em: 1) sem carga e quando carregado, e quando 2) carregado de forma concêntrica e excêntrica. Eliminando a necessidade para os espécimes de corte, e para realizar experiências em órgãos inteiros intactos em condições de humidade para permitir a máxima preservação do estado de stress em 3D. Isso abre uma nova área de investigação para compreender os processos dinâmicos do complexo em vários cenários de carga.

Neste estudo, os métodos para a biomecânica testes PDL dentro de um conjunto fibroso intacto de uma ratazana Sprague Dawley, um conjunto considerado como um sistema modelo de bioengenharia óptima será detalhado. Experimentos irá incluir a simulação de cargas da mastigação em condições hidratados, a fim de destacar três características importantes do conjunto como eles se relacionam com a biomecânica do nível do órgão. Os três pontos incluem: 1) força reacionária versus deslocamento:deslocamento do dente dentro do alvéolo e sua resposta reacionária do carregamento, 2) tridimensional (3D) de configuração espacial e morfometria: relação geométrica do dente com o alvéolo, e 3) mudanças nas leituras 1 e 2, devido a uma mudança na eixo de carga, ou seja, a partir de concêntrico para cargas excêntricas. Os três leituras fundamentais da técnica proposta pode ser aplicado para investigar a natureza adaptável de articulações em vertebrados, quer devido à mudança das exigências funcionais, e / ou doença. Mudanças nas leituras acima referidas, nomeadamente a correlação entre as cargas reacionários com deslocamento, e resultando em tempo de carga e carga-deslocamento curvas reacionárias em diferentes taxas de carregamento pode ser aplicada para destacar as mudanças globais em biomecânica. Eficácia do protocolo proposto será avaliado pelo acoplamento de leituras de testes mecânicos para morfometria 3D e biomecânica globais do conjunto.

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Protocolo

Alojamento dos animais e eutanásia: Todos os animais utilizados neste demonstração foram alojados em condições livres de patógenos, de acordo com as diretrizes do Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC) e do Instituto Nacional de Saúde (NIH).

Fornecer animais com ração hard-pellet padrão e água ad lib. Eutanásia animais através de um método de duas etapas de asfixia dióxido de carbono, toracotomia bilateral, de acordo com o protocolo padrão da UCSF aprovado pelo IACUC. Realizar testes biomecânicos nas 24 horas após o sacrifício dos animais, para evitar a degradação do tecido.

1. Preparação e dissecção de um rato mandíbula ou maxila

1. Retirar mandíbulas de ratos por meio do corte do tecido gentilmente anexos e tecido muscular membranosas preservando toda a mandíbula, incluindo o processo e o processo coronoide condilar (Figura 1) ^15.
2. Hemimandíbula separados de carroefully cortando o tecido fibroso da sínfise mandibular com uma lâmina de bisturi.
   Nota: Os processos de coronárias e do côndilo e ramo da mandíbula (Figura 1) deve ser removido se obstruir fisicamente testes biomecânicos do 2 ^º molar.
3. Corte os incisivos, sem expor a câmara pulpar, para não dificultar o carregamento do molar.

2. Preparação de amostras para in situ à compressão de carga (Figura 2)

1. Imobilizar a amostra sobre um topo de aço, utilizando um material que é significativamente mais duro do que o espécime experimentais antes de colocá-lo em um dispositivo de carregamento em situ (Figura 2A).
   Nota: polimetilmetacrilato (PMMA) foi utilizado para imobilizar a amostra em estudo e este excesso, se algum, foi removido usando um explorador dental.
2. Alinhe a superfície oclusal do molar (s) de interesse paralelo com o disco de amostra AFM de metal usando uma borda reta em ambosaviões (ou seja, mesial-distal e vestíbulo-lingual).
3. Criar uma calha com um instrumento contundente ao redor dos molares.
   Nota: Este espaço deve servir como um "fosso" para conter o excesso de líquido e manter a hidratação do tecido durante o carregamento em situ.
4. Preparar a superfície do dente ao construir-se para concêntrica (Figura 2B) ou excêntrico (Figura 2C) usando uma carga composta dental. Gravar a superfície do dente de interesse com o gel de ácido fosfórico a 35% na superfície oclusal de 15 seg.
5. Lavar o produto corrosivo abundantemente com água desionizada e secar a superfície usando uma seringa de ar / água ou um recipiente de ar comprimido. Com um explorador, espalhe uma gota de o agente de ligação em cúspides abertas em uma camada fina. Cure o composto com uma luz de cura dental.
   Nota: Todas as etapas que envolvem compósitos deve ser realizada sem a luz direta de uma lâmpada. Tais condições seriam indesejavelmente acelerar o processo de polimerização, e could evitar a colocação adequada do composto. Iluminação do quarto é aceitável.
6. Retire o excesso de agente de ligação a partir de dentes adjacentes com um bom bisturi ou lâmina de barbear.
7. Coloque compósito dentário fluida na superfície após a preparação da superfície e espalhá-lo dentro de ranhuras do molar (s) de interesse, utilizando um explorador dental.
8. Exponha o composto à luz de cura dental para 30 seg.
9. Moldar um acúmulo oclusal de cerca de 3-4 mm usando uma resina composta dental, a partir do plano oclusal do molar (s) de interesse e cura luz por 30 segundos.
10. Reduzir o início da formação de compósito com uma superfície plana paralela ao permitir que um regime de carga consistente em todos os espécimes, usando uma régua e um dispositivo manual de alta velocidade.
    Nota: Durante o teste biomecânico, outras amostras devem ser armazenadas em tris-fosfato de solução tamponada (TBS) com 50 mg / ml de penicilina, estreptomicina e ^15.

3. Carregando Deriva de dispositivos eRigidez, capacidade material de propriedade de diferenciação, in situ Carregando da fibrosa Joint

1. Fixar o espécime com o acúmulo de compósito sobre a bigorna da fase de carregamento, e de teste para uma carga uniforme, como mostrado na Figura 2B.
2. Coloque um papel de articulação sobre a superfície do compósito, seguido por carregar as amostras para uma carga finita para verificar a existência de carregamento concêntrica ou excêntrica (Figuras 2B e 2C).
3. Coloque Kimwipe TBS-embebido em torno da amostra para garantir a hidratação da amostra. Faça uma calha ao redor da amostra e preenchê-lo com TBS para manter o órgão hidratado durante o exame.
4. Carga de pico de entrada e taxa de deslocamento para o software Deben para comprimir o molar para uma carga de pico desejado a uma taxa de deslocamento após a imobilização do hemimandíbula.
   Nota: as leituras típicas deve incluir uma carga reacionário como o material é comprimido ao longo do tempo (sensibilidade do transdutor de carga = 0,1N). A partir do tempo de carga e tempo de deslocamento, a curva de carga-deslocamento para o material compactado deve ser obtida ^16-18. Utilizando os dados recolhidos a partir dos ciclos de carga, várias propriedades do conjunto pode também ser determinada. A rigidez da junta deve ser calculada tomando o declive da porção linear (cerca de 30% do último dos dados) da fase de carregamento da carga versus deslocamento da curva ^19.

4. Coloração de Tecidos Moles, o PDL, com ácido fosfotúngstico (PTA)

Nota: Para aumentar o contraste de raios-X de atenuação, o PDL devem ser coradas com solução de 5% PTA ^20.

1. Solução de coloração Backfill PTA em uma limpa 1,8 ml carpule de vidro e coloque carpule carregado na seringa.
2. Injectar solução lentamente (5 min / carpule) para o espaço PDL de dentes adjacentes para evitar danos estruturais nos tecidos periodontais circundantes molar de interesse.
   Nota: Os passos acima deve be repete-se até cerca de 5 tubetes anestésicos completos (9 ml) de solução são injectados e deixada fluir para os tecidos circundantes. Os espécimes prepped também pode ser embebido durante a noite em solução de PTA restante (8 horas).

5. Recomendados Configurações de digitalização μ-XCT

Realize m-XCT com as seguintes configurações de digitalização:

Objetivo Ampliação	4X, 10X
	1.800 imagens
Tensão do tubo de raios-X	75 kVp (50 kVp para amostras de PTA manchado)
	8 W
Tempo de Exposição	~ 8-25 seg *
	~ 4 mm (objetiva de 4X), ~ 2 m (objetiva de 10X) **

* O tempo de exposição pode variar com base na geometria e a densidade óptica da amostra e do tubo de raios-X voltage.
** Resolução real de pixels será ligeiramente diferente com base na configuração da fonte, espécime, e detector.

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Resultados

Estimativa de carga dispositivo "backlash", "pushback", rigidez, e deriva do sistema sob uma carga constante

Folga: Entre carga e descarga de porções do ciclo, existe uma pausa de 3 segundos durante o qual engrena inversa dentro do motor antes da verdadeira descarga começa, por exemplo, como o modelo afasta-se da mandíbula superior (Figura 3). Este período é designado por uma folga no sistema, o que represe...

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Discussão

O primeiro passo para estabelecer este protocolo envolveu a avaliação da rigidez da estrutura de carregamento por meio de um corpo rígido. Com base nos resultados, a rigidez foi significativamente mais elevada que permita a utilização do dispositivo de carregamento para mais testes de amostras com valores de rigidez significativamente inferiores. O segundo passo destaque a capacidade de o instrumento para distinguir diferentes valores de rigidez, utilizando duas fases da curva de carga-descarga gerados pela utiliza...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bard Parker Blade	BD	MEDC-001054
AFM metal disk	Ted Pella	16218
Polymethyl methacrylate	GC America	N/A
Uni-Etch	Bisco	E5502EBM
Optibond Solo Plus	Kerr Corp	N/A
Filtek Flow	3M	N/A
Hurculite Ultra	Kerr	34346
Tris buffer	Mediatech Inc.	N/A
Articulating paper	Parkell Inc.
Phosphotungstic Acid	Sigma Aldrich	HT152