Isolamento e Preparação de Paredes Celulares Bacterianas para Análise Composicional por Cromatografia Líquida de Ultra Desempenho

Resumo

A parede celular bacteriana é composta de peptidoglycan, uma rede macromolecular de fios de açúcar cruzados por peptídeos. A Cromatografia Líquida Ultra Performance fornece alta resolução e throughput para novas descobertas da composição peptidoglycan. Apresentamos um procedimento para o isolamento das paredes celulares (sacculi) e sua posterior preparação para análise via UPLC.

Resumo

A parede celular bacteriana é fundamental para a determinação da forma celular durante o crescimento e divisão, e mantém a integridade mecânica das células diante das pressões turgor várias atmosferas em magnitude. Através das diversas formas e tamanhos do reino bacteriano, a parede celular é composta de peptidoglycan, uma rede macromolecular de fios de açúcar cruzados por peptídeos curtos. A importância central do peptidoglycan para a fisiologia bacteriana está por trás de seu uso como alvo antibiótico e motivou estudos genéticos, estruturais e biológicos celulares de como ele é fortemente montado durante o crescimento e divisão. No entanto, investigações extensas ainda são necessárias para caracterizar plenamente as principais atividades enzimáticas na síntese peptidoglycan e na composição química das paredes celulares bacterianas. A Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) é um poderoso método analítico para quantificar diferenças na composição química das paredes de bactérias cultivadas sob uma variedade de condições ambientais e genéticas, mas sua produção é muitas vezes limitada. Aqui, apresentamos um procedimento simples para o isolamento e preparação de paredes celulares bacterianas para análises biológicas de peptidoglycan via HPLC e Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), uma extensão do HPLC que utiliza bombas para fornecer pressões ultra-altas de até 15.000 psi, em comparação com 6.000 psi para HPLC. Em combinação com a preparação de paredes celulares bacterianas apresentadas aqui, os injetores de amostra de baixo volume, detectores com altas taxas de amostragem, volumes amostrais menores e tempos de execução mais curtos de UPLC permitirão alta resolução e throughput para novas descobertas de composição peptidoglycan e biologia celular bacteriana fundamental na maioria dos laboratórios biológicos com acesso a um ultracentrifuge e UPLC.

Introdução

O objetivo do método aqui descrito é isolar paredes celulares bacterianas intactas (sacculi) e digerir o peptidoglycan (PG) de modo que a Cromatografia Líquida Ultra Performance (UPLC) possa ser usada para fornecer informações como a identidade dos componentes do muropeptídeo e suas concentrações, o comprimento médio dos fios glicanos e a fração do material envolvido em crosslinks entre fios. Para uma discussão detalhada das espécies de bioquímica e muropeptídeos de PG, existem várias excelentes revisões que descrevem a estrutura pg e seu papel na infecção, resistência, morfogênese e crescimento^1-6. A Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) para análise pg foi inicialmente desenvolvida por Glauner e Schwarz na década de 1980, e mais recentemente foi aprimorada e aplicada extensivamente nos laboratórios de Miguel de Pedro e Waldemar Vollmer. Métodos anteriores utilizaram análise de aminoácidos ou cromatografia de papel, técnicas demoradas e tediosas que não produzem avaliações precisas ou completas de componentes da parede celular.

A análise uplc pode ser facilmente implementada em qualquer laboratório de pesquisa básica que tenha acesso a um ultracentrifuge e UPLC. O método UPLC que apresentamos abaixo isola saccultos completos, fornecendo informações quantitativas e abrangentes sobre todas as espécies químicas nelas. Este método produz quantificação precisa de todos os muropeptídeos em uma população de bactérias, tudo dentro de uma corrida UPLC de 20 minutos. A implementação desse método envolve apenas habilidades básicas de laboratório, sem investimento financeiro significativo em materiais. Para executar as etapas deste método, os pesquisadores só precisam ser qualificados em pipetting, preparação de tampões e enzimas, e ajuste do pH, tornando-o acessível a uma ampla gama de disciplinas científicas. A escolha das enzimas utilizadas neste protocolo depende da espécie de bactéria a ser analisada; o protocolo descrito aqui é útil para Escherichia coli, e tem sido geralmente encontrado como adequado para isolar saccultos de outros organismos Gram-negativos. Recomenda-se consulta à literatura na aplicação deste método a bactérias Gram-positivas; nestas espécies, a purificação do sacculus tem sido tradicionalmente mais difícil. Em particular, este método pode ter que ser alterado em termos de escolha enzimática e tempo de digestão para acomodar as paredes mais grossas e polímeros acessórios, como ácidos teicóicos de bactérias Gram-positivas. A primeira enzima neste protocolo corta a lipoproteína da membrana externa (como a lipoproteína de Braun, ou Lpp) apego ao peptidoglycan, liberando assim todos, exceto o peptídeo C-terminal di-(ou tri-) do Lpp da parede celular. Esta etapa é necessária ao examinar enterobactérias, mas muitas outras bactérias Gram-negativas não têm equivalentes de Lpp, e portanto essa etapa pode ser ignorada. Uma segunda enzima especificamente se acovarda após o componente ácido murâmico do peptidoglycan, solubilizando a subunidade descaramento que forma a espécie muropeptídeo. Para fornecer uma avaliação precisa da arquitetura do PG, deve-se tomar cuidado ao digerir os saccultos para evitar o decote das pontes cruzadas ou qualquer outra parte da haste de peptídeo.

Embora as composições químicas de peptidoglycan de mais de 100 cepas de ~40 espécies bacterianas tenham sido analisadas pelo HPLC, nenhuma análise foi realizada com a tecnologia UPLC. Além disso, trabalhos anteriores caracterizaram peptidoglycan a partir de apenas uma pequena fração do domínio bacteriano, em parte limitado pelo rendimento do HPLC. Portanto, a disseminação desse método para o maior número possível de pesquisadores, e a implementação em plataformas UPLC, será fundamental para conduzir estudos fisiológicos da grande fração de espécies bacterianas cujo peptidoglycan ainda não foi categorizado.

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Protocolo

1. Cultivar culturas bacterianas em 2,5 ml de mídia durante a noite

Culturas de diluição de 1:100 em 250 ml de mídia fresca e crescem para OD₆₀₀ de 0,7-0,8. Prepare uma solução de 6% de sulfato de dodecyl de sódio (SDS) na água.

ATENÇÃO: O pó SDS é perigoso - evite inalar pó SDS; usar uma máscara sobre o nariz e a boca.

2. Dia 1 - Culturas Bacterianas Lysing é Realizada ao longo de um dia e durante a noite

1. Enquanto culturas diluídas estão crescendo, configure um banho de água fervente em um prato quente em um béquer 1 L. Uma vez que a água esteja fervendo, aliquot 6 ml de 6% SDS em tubos de polipropileno de 50 ml, adicione uma pequena barra de agitação a cada tubo, fixe as tampas do tubo na mão apertada, coloque tubos no banho de água e ligue mexendo a 500 rpm na placa quente.
2. Colher as culturas de 250 ml a 5.000 × g por 10 minutos à temperatura ambiente e resuspend as pelotas em 3 ml de mídia ou 1x salina tamponada com fosfato. Suspensões lentamente de células pipetas em tubos de 50 ml com SDS fervente de 6% para lise das células (concentração final de 4% SDS) enquanto os tubos estão submersos no banho de água fervente, e recuem as tampas para a mão apertada. As suspensões celulares devem ser rapidamente transferidas para SDS fervente uma vez resuspendidas. Mudanças ambientais abruptas devem ser evitadas, pois isso poderia causar alteração errônea da estrutura da paredecelular.
3. Cubra o banho de água fervente e deixe as células ferverem por 3 horas, verificando o nível de água periodicamente e reabastecendo o banho de água quando necessário. Depois de 3 horas, desligue o elemento de aquecimento da placa quente, e continue mexendo durante a noite a 500 rpm.

3. Dia 2 - Digestões Enzimáticas são realizadas ao longo de um dia

1. Se o SDS tiver precipitado nos tubos de 50 ml durante a noite, coloque o banho de água para ferver por mais 1-2 horas. Ligue um bloco de calor a 60 °C. Prepare um estoque de 1 mg/ml de Pronase E em 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06% w/v NaCl e ative o Pronase E a 60 °C por pelo menos 30 min.
2. Use um conjunto de ultracentrrifuagem a 400.000 × g para girar amostras por 20 minutos à temperatura ambiente, a fim de pellet os polímeros grandes PG e, assim, purificá-los de outros componentes celulares. Remova o supernatante cuidadosamente e, em seguida, resuspenque cada pelota em água ultrapura de temperatura ambiente. NOTA: O volume de resuspensão depende do volume dos tubos ultracentríficos utilizados; use um volume que encha os tubos pelo menos no meio do caminho, mas não excede o volume máximo dos tubos. Repita centrifugação/lavagem até que a água não forme bolhas durante a ressuspensão, indicando que o SDS foi totalmente removido (tipicamente três lavagens). Pare de lavar a pelota se um precipitado branco se formar, pois isso indica que os saccultos estão se agrupando. O clumping não é catastrófico, mas os aglomerados se ligam fortemente ao plástico e aos vidros, causando grande perda de amostras. Neste caso, proceda com o protocolo usando a amostra sacculi desajeitada.
3. Na última etapa de centrifugação/lavagem, resuspenque as amostras em 900 μl de 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06% w/v NaCl e transfira para tubos de 2 ml anteriormente cutucados com furos no topo com uma pequena agulha. Adicione 100 μl de 1 mg/ml ativado Pronase E (100 μg/ml de concentração final) a cada amostra e incubar a 60 °C por 2 horas. Coloque um bloco de calor diferente para 100 °C.
4. Pare a digestão Pronase E adicionando 200 μl de 6% de SDS a cada amostra e ferva as amostras no bloco de calor de 100 °C por 30 minutos. Defina um bloco de calor diferente para 37 °C e faça um estoque de 1 mg/ml de muramidase (mutanolysin) em tampão fosfato de 50 mM (pH 4.9).
5. Como na etapa 3.2, use um conjunto de ultracentrífas a 400.000 × g para girar amostras por 20 minutos à temperatura ambiente e lavar com água ultrapura de temperatura ambiente até que o SDS seja totalmente removido (tipicamente três lavagens). O volume de resuspensão depende do volume dos tubos ultracentríficos utilizados; use um volume que encha os tubos pelo menos no meio do caminho, mas não excede o volume máximo dos tubos.
6. Na última etapa de centrifugação/lavagem, resuspende amostras em 200 μl de tampão fosfato de sódio de 50 mM (pH 4,9). Este volume pode ser ajustado de acordo com a quantidade de peptidoglycan na amostra, podendo ser dependente de espécies. Se houver relatórios previamente publicados de análise do HPLC para as espécies de interesse, esse volume pode ser estimado com base nessas quantitações (uma compilação de estudos HPLC PG pode ser encontrada nas Informações Suplementares de referência⁷). Para outras espécies, a preparação do sacculus pode ser executada até esta etapa e, em seguida, diferentes quantidades de volumes de resuspensão podem ser adicionadas para replicar amostras, a fim de determinar o volume mínimo que permite que o PG permaneça em solução (consulte Discussão para novas estimativas). Se a amostra contiver mais peptidoglycan, aumente o volume de resuspensão; se a amostra tiver pouco peptidoglycan, reduza o volume de ressuspensão para um mínimo de 50 μl.
7. Transfira amostras para tubos de 1,5 ml e adicione 1 mg/ml muramidase para dar uma concentração final de 40 μg/ml. Incubar 6-8 horas ou durante a noite a 37 °C.

4. Dia 3 - Preparação de Amostras para UPLC é realizada no último dia

1. Ligue um bloco de calor a 100 °C. Ferva as amostras sem SDS por 5 minutos para parar a digestão da muramidase. Amostras centrífugas por 10 minutos a 16.000 × g em temperatura ambiente, em seguida, transfira o supernatante (muropeptídeos são agora solúveis) para tubos de vidro de 13 mm x 100 mm. Tente recuperar o máximo de supernasces possível, chegando muito perto da pelota sem perturbá-la.
2. Ajuste o pH adicionando 500 mM de tampão de borate (pH 9) à amostra para uma concentração final de 100 mM tampão de borate. O tampão de borate é compatível com o boroidido de sódio do agente redutor. Adicione 1-2 grãos de boroidido de sódio para reduzir cada amostra e deixe a reação prosseguir por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente. ATENÇÃO: O boroidido de sódio é altamente reativo e perigoso de manusear - evite o contato com a pele (use luvas) e evite o contato com os olhos (use óculos de segurança).
3. Ajuste as amostras para pH 3-4 (o ponto isoelétrico muropeptídeo é ~3,5) com ácido ortofosfórico de 50% v/v usando incrementos de 20 μl até pH 6, medido com papel indicador de pH, em seguida, usando incrementos de 2 μl. ATENÇÃO: O ácido ortofosfórico é corrosivo e perigoso de manusear - evite o contato com a pele (use luvas) e evite o contato com os olhos (use óculos de segurança). A amostra deve borbulhar em resposta à adição de ácido ortofosfórico; quando a amostra pára de borbulhar, isso normalmente indica que um pH de 6 foi atingido. Se não ocorrer borbulhante na amostra, isso pode indicar que a quantidade de boroidido de sódio adicionada era muito pequena. Neste caso, pare de baixar o pH, adicione cuidadosamente um ou dois grãos de boroidido de sódio, deixe reagir por 5-10 min e retome o ajuste de pH.
4. Filtrar a amostra através de um filtro de seringa de 0,22 μm diretamente em um frasco UPLC. Se um precipitado se formar, aqueça o tubo com várias passagens através de uma chama antes de filtrar. Se a amostra não for injetada no instrumento UPLC dentro de um dia, congele a -20 °C durante a noite. As amostras podem ser armazenadas por até um ano a -80 °C. A amostra pode ser descongelada passando por uma chama várias vezes.
5. Injete 10 μl de cada amostra em um instrumento UPLC equipado com uma coluna de fase invertida C18 1,7 μm e um detector de absorvência definido para monitorar 202-208 nm. As amostras são injetadas sequencialmente, mas os recursos do autosampler permitem que até 96 amostras sejam processadas em lote. Use fosfato de sódio de 50 mM (pH 4,35) + 0,4% v/v de azida de sódio para solvente A, e fosfato de sódio de 75 mM (pH 4,95) + 15% v/v de metanol para solvente B. NOTA: Azida de sódio é adicionada para compensar a absorção de 205 nm de metanol para evitar a deriva da linha de base. Defina o fluxo para 0,25 ml/min e use um gradiente linear acima de 25 min para alcançar 100% de solvente B e eluição sequencial de muropeptídeos dentro de 30 minutos. Se a espectrometria de massa for usada para caracterizar muropeptídeos após a UPLC, colete frações do pico de interesse em um coletor de frações e seque as frações usando um evaporador centrífuga.

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Resultados

Utilizando o procedimento descrito na Figura 1,a amostra final deve consistir em pelo menos 200 μl de solução clara que foi filtrada diretamente em um frasco UPLC (etapa 4.4). A separação uplc dos vários muropeptídeos em uma amostra bacteriana baseia-se em sua solubilidade relativa entre a fase móvel líquida e a fase estacionária da coluna. As colunas C18 de fase invertida fornecem uma matriz fortemente hidrofóbica para separar as espécies de muropeptídeos à base de hidroofobidade e tamanho...

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Discussão

Um passo crítico neste procedimento é a etapa 3.1 do segundo dia de preparação da amostra. Se o SDS precipitou durante a noite, ou se as amostras foram armazenadas em 4% de SDS por várias semanas em temperatura ambiente, as amostras devem ser rebovadas por pelo menos 1 hora para ressolar o SDS. Uma causa comum para a precipitação de SDS é o uso de mídia com sais de potássio, por isso o potássio deve ser evitado na mídia, se possível. Como mencionado na seção Resultados Representativos, também é fundament...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase E	Amresco	E629
Mutanolysin from Streptomyces	Sigma-Aldrich	M9901
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452882	Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle
Orthophosphoric acid	Sigma-Aldrich	79607	Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle
Boric acid	Sigma-Aldrich	31146
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Sodium azide is a poison
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0.22 μm syringe filters	Fisher	SLGVR04NL
pH strips (pH range 0-6)	Fisher	M95863
50 ml polypropylene Falcon tubes	VWR	21008-951
13 mm x 100 mm glass tubes	Kimble Chase	60CM13
12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial	Waters	186000327C
Sodium Dodecyl Sulfate	Ambion	AM9820	SDS powder is hazardous
Instrumentation
Waters Acquity UPLC H-Class system, including:
Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN
Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager
Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column
Acquity UPLC PDA Detector
Waters Fraction Collector III
Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler