Monitorando a competição de subespécies em uma população de células bacterianas por cocultivação de cepas fluorescentes rotuladas

Resumo

As bactérias podem acumular mutações prejudiciais ou benéficas durante a vida. Em uma população de células indivíduos que acumularam mutações benéficas podem rapidamente superar seus companheiros. Aqui apresentamos um procedimento simples para visualizar a competição de intraespécies em uma população de células bacterianas ao longo do tempo usando indivíduos rotulados fluorescentes.

Resumo

Muitos microrganismos, como bactérias, proliferam extremamente rápido e as populações podem atingir altas densidades celulares. Pequenas frações de células em uma população sempre têm mutações acumuladas que são prejudiciais ou benéficas para a célula. Se o efeito fitness de uma mutação fornece a subpopulação com uma forte vantagem de crescimento seletivo, os indivíduos desta subpopulação podem rapidamente superar e até eliminar completamente seus companheiros imediatos. Assim, pequenas alterações genéticas e acúmulo de células que adquiriram mutações benéficas podem levar a uma mudança completa do genótipo de uma população celular. Aqui apresentamos um procedimento para monitorar a rápida expansão clonal e a eliminação de mutações benéficas e prejudiciais, respectivamente, em uma população celular bacteriana ao longo do tempo por cocultivação de indivíduos fluorescentes rotulados da bactéria modelo Gram-positivo Bacillus subtilis. O método é fácil de executar e muito ilustrativo para exibir competição intraespécie entre os indivíduos em uma população celular bacteriana.

Introdução

As bactérias do solo são geralmente dotadas de redes regulatórias flexíveis e amplas capacidades metabólicas. Ambas as características permitem que as células ajustem suas vias catabólicas e anabólicas para competir com seus companheiros e outros microrganismos pelos nutrientes, que estão disponíveis em um determinado nicho ecológico¹. No entanto, se as bactérias não conseguem se adaptar ao seu ambiente, outros mecanismos podem explicar a sobrevivência de uma espécie. De fato, como muitas bactérias se proliferam rapidamente e as populações podem atingir altas densidades celulares, subpopulações podem ter mutações benéficas acumuladas espontaneamente que fornecem às células uma vantagem de crescimento seletiva e, portanto, aumentam sua aptidão. Além disso, hotspots mutacionais e mutagênese adaptativa induzida pelo estresse podem facilitar a evolução de uma bactéria mal adaptada^2,3. Assim, o acúmulo de mutações e crescimento sob seleção contínua é a origem da enorme diversidade microbiana, mesmo dentro do mesmo gênero^4,5. Como na natureza, a modelagem de genomas bacterianos também ocorre em laboratório devido ao cultivo contínuo em seleção. Isso é exemplificado pela domesticação da bactéria Gram-positive B. subtilis, que é usada mundialmente em pesquisa básica e na indústria. Na década de 1940, a subtilis foi tratada com raios-X prejudiciais ao DNA, seguido pelo cultivo sob uma condição específica de crescimento⁶. As mutações que se acumularam nas bactérias durante sua domesticação são responsáveis pela perda de muitas características de crescimento, ou seja, a cepa de laboratório B. subtilis 168 perdeu a capacidade de formar colônias complexas^7,8.

Hoje em dia, para as bactérias modelo mais bem estudadas Escherichia coli e B. subtilis,uma variedade de ferramentas poderosas está disponível para manipular geneticamente seus genomas a fim de abordar questões científicas específicas. Às vezes, a inativação de um gene de interesse causa um grave defeito de crescimento, que é então claramente visível no meio de crescimento padrão⁹. Em contraste, mutações que causam um fraco defeito de crescimento e, portanto, apenas afetam ligeiramente o condicionamento físico da cepa são muitas vezes ignoradas. No entanto, em ambos os casos a incubação prolongada e a passagem das cepas mutantes por várias gerações geralmente resultam no acúmulo de mutantes supressores que restauraram o fenótipo da cepa dos pais^2,9. A caracterização dos mutantes supressores e a identificação das mutações que restauraram o defeito de crescimento da cepa mutante dos pais é uma abordagem muito útil que permite a elucidação de processos celulares importantes e muitas vezes novos^10,11.

Estamos interessados no controle da homeostase glutamato em B. subtilis¹². Semelhante a E. coli, B. subtilis responde à perturbação da homeostase glutamato (ou seja,bloco na degradação do glutamato²) pelo acúmulo de mutantes supressores. As alterações genômicas nesses mutantes supressores que foram adquiridos por mutação espontânea foram demonstradas para restaurar rapidamente a homeostase glutamato^9,13. Portanto, não é de surpreender que a adaptação de B. subtilis a uma condição específica de crescimento durante a domesticação da bactéria seja espelhada na síntese enzimática e nas atividades enzimáticas evoluídas, que estão envolvidas no metabolismo do glutamato¹². Tem sido sugerido que a falta de glutamato exógeno no meio de crescimento durante o processo de domesticação foi a força motriz para o surgimento e fixação do gene dehidroase de glutamato enigmático (GDH) gudB^CR na cepa laboratorial 168^2,14. Esta hipótese é apoiada pela nossa observação de que a quantidade reduzida de atividade de GDH na cepa laboratorial fornece às bactérias uma vantagem de crescimento seletiva quando o glutamato exógeno é escasso². Além disso, o cultivo de uma cepa B. subtilis, sintetizando o GDH GudB, na ausência de glutamato exógeno resulta no acúmulo de mutantes supressores que inativaram o gene gudB ². Obviamente, a presença de um GDH catabolicamente ativo é desvantajosa para a célula porque o glutamato produzido endógenamente que poderia ser usado para o anabbolismo é degradado para amônio e 2-oxoglutarate(Figura 1). Em contraste, quando o glutamato é fornecido pelo meio, uma cepa B. subtilis equipada com atividade GDH de alto nível tem uma vantagem de crescimento seletiva sobre uma cepa que sintetiza apenas um GDH funcional. É razoável supor que a atividade gdh de alto nível permite que as bactérias utilizem o glutamato como segunda fonte de carbono, além de outras fontes de carbono fornecidas pelo meio² (ver Figura 1). Assim, a atividade GDH afeta fortemente o condicionamento físico das bactérias, dependendo da disponibilidade de glutamato exógeno.

Aqui apresentamos um método muito ilustrativo para monitorar e visualizar a competição intraespécie entre duas cepas de B. subtilis que diferem em um único lócus no cromossomo(Figura 2). As duas cepas foram rotuladas com os genes YFP e CFP codificando os fluoroforos YFP e CFP, e cocultivadas em diferentes condições nutricionais. Através da amostragem ao longo do tempo e emplacando diluições apropriadas em placas de ágar, os sobreviventes em cada uma das culturas poderiam ser facilmente monitorados usando um microscópio de fluorescência estéreo comum. O procedimento descrito neste artigo é fácil de realizar e adequado para visualizar a rápida expansão clonal e eliminação de mutações benéficas e prejudiciais, respectivamente, em uma população celular ao longo do tempo.

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Protocolo

1. Preparação de Placas de Ágar, Mídia de Cultura, Criostocks e Pré-Culturas

1. Prepare a mídia de crescimento e os reagentes necessários (ver tabela de materiais e reagentes).
2. Listrar as cepas B. subtilis (por exemplo. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) e BP52 (rocG⁺ gudB⁺ ame::P_gudB-cfp) expressando um e dois GDHs ativos,^{respectivamente) 2} que serão usados no experimento de competição em placas de ágar médio sp para obter colônias únicas. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
3. Pegue colônias simples e tubos de cultura estéril inoculados contendo meio líquido de 4 ml LB. Cresça as bactérias durante a noite a 28 °C e 220 rpm.
4. Cresça culturas durante a noite a 28 °C para evitar que as células lise ou esporulam.
5. Meça a densidade óptica das culturas em um comprimento de onda de 600 nm (OD₆₀₀) usando um espectrofotômetro padrão.
6. Se as culturas atingiram um OD₆₀₀ de 2.0, misture 0,75 ml das culturas com 0,75 ml de uma solução estéril de 50% de glicerol em tubos de reação de 1,5 ml. O OD₆₀₀ final deve ser 1.0 para obter criostocks contendo cerca de 10⁸ células/ml.
7. Armazene os tubos a -80 °C.
8. Faça três pré-culturas de cada cepa rotulada com os genes de fluoróforo de codificação cfp e yfp. Inocular as pré-culturas (tubos de cultura estéril contendo meio líquido de 4 ml LB) com células de 1 μl a partir de -80 °C criostocks. Incubar as culturas durante a noite a 28 °C e 220 rpm.

2. Cocultivação de Bactérias, Coleta de Amostras e Armazenamento de Amostras

1. Prepare recentemente 100 ml C-Glc e CE-Glc meio mínimo (ver tabela de reagentes e materiais), e transfira 20 ml de cada meio em frascos de shake estéreis de 100 ml.
2. Pegue 0,1 ml das préculturas que foram cultivadas durante a noite, dilui-as com 0,9 ml de lb médio em um cuvette de 1,5 ml, e determine o OD₆₀₀.
3. Para o experimento de competição, pegue essas pré-culturas das diferentes cepas que têm um OD₆₀₀ semelhante entre 1,0-1,5.
4. Para obter populações de células mistas, diluir as células das préculturas que tinham o OD₆₀₀ adequado para um OD₆₀₀ de 0,05 em 20 ml C-Glc e CE-GLC meio mínimo suplementado em frascos de shake de 100 ml. Para o experimento de competição, as duas cepas devem ser misturadas em uma proporção de 1:1.
5. Pegue 10 ml de amostras dos frascos, transfira-as para tubos plásticos de 15 ml, colmeia as células por centrifugação por centrifugação por 10 minutos a 4.000 x g em uma centrífuga superior de mesa padrão e descarte o supernascedor.
6. Resuspenque as células em 0,5 ml de meio LB fresco, e transfira as células para um copo de reação estéril de 1,5 ml. Adicione 0,5 ml de glicerol 50% estéril, misture a suspensão por um rigoroso vórtice e armazene as amostras em um congelador de -80 °C até um novo tratamento.
7. Incubar as células que são deixadas nos frascos de shake por até 24 horas a 37 °C e 220 rpm. Mantenha os frascos de agitação no escuro para evitar o branqueamento fotográfico dos fluoroforos.
8. Pegue mais amostras de 0,1 ml após 7 horas e 24 horas de crescimento. Meça e observe o OD₆₀₀ de diluições de 1:10 (em C-Glc ou CE-Glc médio mínimo) das amostras.
9. Pegue a quantidade apropriada de células de cada cultura para fazer criostocks que têm um OD₆₀₀ de 1.0. Armazene as amostras a -80 °C até um novo tratamento.

3. Tratamento amostral, chapeamento e incubação para análises quantitativas

1. Depois de coletar todas as amostras, descongele os criostocks e dilua as células em uma solução salina de 0,9% (ver tabela de reagentes e materiais) até 10^-3.
2. Placa 0,1 ml das diluições de 10^-3 em placas de ágar médio sp e distribuir as células usando pipetas de vidro estéreis.
3. Incubar as placas durante a noite a 37 °C no escuro até que colônias únicas tenham aparecido.

4. Contando os Sobreviventes por Microscopia de Fluorescência Estéreo para Análise Quantitativa

1. Divida a parte inferior da placa de ágar com uma caneta preta em quatro partes para uma melhor orientação enquanto conta os sobreviventes sob o microscópio de fluorescência estéreo.
2. Coloque a placa de cabeça para baixo sob o microscópio e coloque as colônias em foco usando a fonte de luz fria.
3. Uma vez que as colônias estejam em foco, mude para o conjunto de filtros apropriado para CFP para visualizar as células sobreviventes da cepa rotulada cfp. Conte os sobreviventes desta cepa rotulando as colônias com uma caneta e note o número.
4. Remova as etiquetas com etanol e mude para o conjunto de filtros YFP para visualizar as células sobreviventes da cepa rotulada por yfp. Conte os sobreviventes novamente rotulando as colônias com uma caneta e note o número.

5. Tratamento amostral e Microscopia para Análises Semiquantitativas

1. Para figuras ilustrativas, local 10 μl da diluição de 10^-4 (aproximadamente 100 células) do passo 3.1 em uma placa de ágar SP (ver Figura 3).
2. Incubar as placas durante a noite a 37 °C no escuro até que colônias únicas tenham aparecido.
3. Coloque a placa de Petri sem tampa sob o microscópio e coloque o local em foco usando a fonte de luz fria.
4. Tire fotos dos pontos para figuras ilustrativas. Escolha um tempo de exposição adequado para tirar as fotos das colônias com a fonte de luz fria.
5. Sem mover a placa, mude para o conjunto do filtro CFP, ajuste o tempo de exposição e tire uma foto. Faça o mesmo com o conjunto de filtros YFP e guarde as imagens para análises posteriores.

6. Análise de dados

1. Use softwares como o Excel para análises quantitativas de dados. Com base nas colônias contadas, calcule a porcentagem de colônias amarelas e azuis em relação ao número total de colônias, que estão fixadas em 100%.
2. Use os números calculados para criar um diagrama de barra empilhado (ver Figura 4 e Figura 5). Use um programa de processamento de imagens como o Adobe Photoshop para construir fotos mescladas das fotos tiradas dos diferentes pontos. Alternativamente, o software ImageJ disponível livremente, pode ser usado http://rsbweb.nih.gov/ij/ para processamento de imagens.
3. Abra as imagens de um ponto que foram tiradas com o conjunto de filtros CFP e o conjunto de filtros YFP. Otimize o contraste e o brilho para reduzir qualquer fluorescência de fundo da mídia.
4. Vá a uma das fotos e selecione todas. Copie a foto e cole-a na outra foto.
5. Use a função "esquiva de cor" para mesclar as imagens ou sobrepor as imagens fluorescentes usando a guia canais. Imagens mescladas das colônias de diferentes mídias e diferentes pontos de tempo representam o crescimento das diferentes cepas dentro da cultura líquida.

7. Dicas específicas: Experimento do interruptor de corante e cocultivação de cepas isogênicas rotuladas com cfp e yfp

A expressão de qualquer um dos dois genes codificadores de fluoróforos em B. subtilis pode influenciar o condicionamento físico e, portanto, a taxa de crescimento das bactérias. Portanto, recomenda-se realizar os seguintes experimentos, a fim de excluir que a eliminação de uma cepa concorrente da população celular durante o cultivo é simplesmente devido a um efeito negativo do fluorohore:

1. Repita todo o experimento e cocultivamente rotulado cepas (por exemplo, a cepa anteriormente rotulada cfpé agora rotulada com o gene yfp e vice-versa). Embora inversos, os resultados obtidos devem ser comparáveis à observação anterior de que uma cepa tem uma vantagem de crescimento seletiva sobre a outra cepa.
2. Repita todo o experimento e cocultivato cepas isogênicas rotuladas com yfp e cfp (por exemplo, BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) e BP41(rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-cfp)). Estimar o efeito negativo de qualquer um dos dois fluoroforos na aptidão das bactérias seguindo a composição da população celular ao longo do tempo.

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Resultados

O método aqui descrito foi aplicado com sucesso para visualizar a competição de intraespécies em uma população celular constituída por cepas de B. subtilis que foram rotuladas com os genes CFP e YFP codificando os fluoroforos CFP e YFP, respectivamente. Como mostrado na Figura 3,o método pode ser usado para visualizar a competição de intraespécies de forma muito ilustrativa. Ao detectar as amostras em pequenas áreas, a composição clonal da população celular torn...

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Discussão

Vários métodos foram desenvolvidos para analisar a aptidão competitiva das bactérias¹⁶. Em muitos casos, as bactérias foram rotuladas com diferentes fitas de resistência a antibióticos¹⁷. Semelhante à nossa abordagem, a rotulagem das células com fitas de resistência a antibióticos permite a avaliação da aptidão competitiva das bactérias durante a cocultivação em condições de crescimento definidas. Além disso, este método pode ser usado para determinar a aptidão competitiva das ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746
Agar	Difco, USA	214010
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714
CaCl2	Roth, Germany	5239
Glucose	Applichem, Germany	A3617
Glycerol	Roth, Germany	4043
K2HPO4•3H2O	Roth, Germany	6878
KCl	Applichem, Germany	A3582
KH2PO4	Roth, Germany	3904
KOH	Roth, Germany	6751
MgSO4•7H2O	Roth, Germany	P027
MnCl2	Roth, Germany	T881
MnSO4•4H2O	Merck Millipore, Germany	102786
NaCl	Roth, Germany	9265
Nutrient broth	Roth, Germany	X929
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712
Tryptone	Roth, Germany	8952
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445
Yeast extract	Roth, Germany	2363
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000
Freezer (-20 and -80 °C)	-	-
Fridge (4 °C)	-	-
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	-
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Germany	3340000
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9
Powerpoint program	Microsoft, USA	-
Office Excel program	Microsoft, USA	-	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	-
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP Medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4•7H2O
1 g KCl
15 g agar for solid SP medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB Medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
15 g agar for solid LB medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%)			autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
CE-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4•3H2O
16.5 g (NH4)2SO4
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4•4H2O
12.3 g MgSO4•7H2O
add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) Solution
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)	Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)