Avaliando a progressão do ciclo celular de tronco neurais e as células progenitoras no desenvolvimento do cérebro do rato após estresse genotóxico

Resumo

A administração de dois análogos de timidina, EdU e BrdU, em ratinhas grávidas permite a análise da progressão do ciclo celular em células progenitoras neurais e no cérebro do rato embrionário. Este método é útil para determinar os efeitos do stress genotóxico, incluindo a radiação ionizante, durante o desenvolvimento do cérebro.

Resumo

Os neurónios do córtex cerebral são gerados durante o desenvolvimento do cérebro a partir de diferentes tipos de células estaminais e progenitoras neurais (NSPC), que formam um epitélio pseudo alinhando os ventrículos laterais do cérebro embrionário. Estresses genotóxicos, como a radiação ionizante, têm efeitos altamente deletérios sobre o cérebro em desenvolvimento relacionado com a alta sensibilidade do NSPC. A elucidação dos mecanismos celulares e moleculares envolvidas depende da caracterização da resposta a danos no ADN destes tipos particulares de células, o que requer um método preciso para determinar a progressão NSPC longo do ciclo celular no tecido danificado. Aqui é mostrado um método baseado em sucessivas injeções intraperitoneais Edu e BrdU em camundongos grávidas e ainda a detecção destes dois análogos da timidina em cortes coronais do cérebro embrionário. EdU BrdU e ambos são incorporados no ADN das células em replicação durante a fase S e são detectados através de duas técnicas diferentes (ou azidaum anticorpo específico, respectivamente), que facilitam a sua detecção simultânea. EdU e coloração BrdU são então determinados para cada núcleo NSPC em função da sua distância a partir da margem do ventrículo numa região padrão do telencéfalo dorsal. Assim, esta técnica de marcação dupla permite distinguir células que progrediu ao longo do ciclo celular das que ter activado um checkpoint do ciclo celular, levando à paragem do ciclo celular em resposta ao dano do DNA.

Um exemplo de experimento é apresentado, no qual EdU foi injetado antes da irradiação e BrdU imediatamente após e análises realizadas no âmbito da 4 h após a irradiação. Este protocolo apresenta uma análise precisa da resposta de dano de DNA aguda de NSPC em função da fase do ciclo celular em que eles foram irradiadas. Este método é facilmente transponível para muitos outros sistemas, a fim de determinar os efeitos de um tratamento específico sobre a progressão do ciclo celular em tecidos vivos.

Introdução

Durante o desenvolvimento do cérebro embrionário, de neurónios de projecção do córtex cerebral são gerados na zona ventricular, um epitélio pseudo composto de diferentes tipos de estaminais neuronais e células progenitoras (NSPC) que reveste os ventrículos laterais. Entre NSPC, as células gliais radiais (RGC), que servem como células estaminais neurais, sofrer migração nuclear interkinetic (INM): eles realizam a mitose na superfície do ventrículo e da fase S no limite basal da zona ventricular (VZ) ^{1, 2,3.} Eles podem dividir ou simetricamente para gerar dois RGC ou assimetricamente para gerar um RGC e um neurônio ou uma célula intermediária progenitor (IPC) ^{4, 5.} IPC migrar para uma camada sobrejacente proliferando chamada zona subventricular (SVZ), onde depois de uma última divisão simétrica geram dois neurônios de projeção imaturos ^6-8. Ao contrário do RGC, o IPC não sofrem INM (revisado em ^9). Neurônios recém-gerados Migrcomeu radialmente ao longo das fibras radiais através da zona intermediária (IZ) para chegar ao seu destino final na placa cortical (CP) ^{10, 8.} O timing perfeito de todos estes eventos é essencial para um desenvolvimento cortical correta. Por exemplo, o interruptor de proliferação a diferenciação de populações progenitoras neurais é controlada pela duração da fase G1 ^{11, 12.} O prolongamento da fase G1 assim correlaciona com a diferenciação celular.

Estresse genotóxico, como radiação ionizante, o desenvolvimento do cérebro severamente prejudicar (revisado em ^13). Nós e outros autores mostraram que NSPC são altamente propensos a apoptose induzida por radiação ^{14, 15,16.} As radiações ionizantes induzir rupturas dos filamentos de DNA duplo que são os danos mais graves para células em proliferação. Um componente essencial da resposta a danos do DNA (DDR) em células de ciclismo é a ativação de pontos de controle do ciclo celular nas transições G1 / S ou G2 / M ou durante Sfase (intra-S checkpoint) ^17-21. Eles bloqueiam a progressão do ciclo celular para dar tempo para a reparação de danos ao DNA ou eliminação de células muito danificadas. Consequentemente, a morte celular, bem como a progressão do ciclo celular retardada pode alterar o desenvolvimento do cérebro em resposta à exposição a radiação ionizante ^22-24. Era, portanto, interessante para desenvolver um método para avaliar a activação de checkpoints do ciclo celular em NSPC no cérebro do rato embrionário irradiado.

A progressão do ciclo celular é normalmente seguido usando a incorporação de um análogo da timidina, 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU). BrdU é incorporado durante a fase S do ciclo celular, quando o ADN está a replicar. A utilização de um anticorpo contra BrdU permite posteriormente a detecção de células que estavam na fase S durante o pulso de BrdU.

Um análogo da timidina romance, 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) é detectada por um azida fluorescente. As diferentes maneiras de detectar EdU e B RDU não reagem de forma cruzada ^25, permitindo a detecção simultânea de ambos os análogos de timidina, a qual é útil para o estudo da progressão do ciclo celular. Normalmente, as células são pulsadas com EdU primeiro e, em seguida, pulsadas com BrdU, em que o tempo entre as duas incorporações dura duas horas ^{25, 26.} A adição de BrdU em meios de cultura contendo EdU resulta preferencialmente incorporação de BrdU no ADN com a exclusão de EdU, enquanto que a adição simultânea de EdU ²⁵ com BrdU equimolar ou equimolar metade para os meios de comunicação provoca apenas a incorporação de BrdU ^27. Isto simplifica o protocolo de marcação dupla, eliminando as etapas de lavagem que são normalmente necessários para a remoção da etiqueta a partir do primeiro meio de cultura antes da adição da segunda etiqueta. Este também é de um interesse especial para o estudo in vivo, em que os passos de lavagem não são possíveis, para determinar o momento preciso da entrada na fase S ou saída da população de células.

t "> Recentemente, um método de rotulagem de duplo pulso em cérebro embrionário do rato usando EdU e BrdU ^{23, 24,22} foi desenvolvido para analisar a progressão do ciclo celular e INM de NSPC no útero após a irradiação. Além disso, tem sido demonstrado que, durante fase S, células de camundongo replicar primeiro as regiões eucromatina e, em seguida, a heterocromatina pericêntrica ^28,29,30. Curiosamente, heterochromatin pericêntrica de diferentes cromossomos agrupados em núcleos interphasic para formar focos heterocromática também conhecido como chromocenters e facilmente detectável pela coloração DAPI como focos brilhante. Portanto, os diferenciais Edu e BrdU colorações de eucromatina e chromocenters nos ajudou a analisar com mais precisão a progressão da fase S de NSPC.

Este método permitiu a demonstração da aparente falta de G1 / S checkpoint em NSCP ^22-24, o que é bastante surpreendente, pois o ponto de verificação é suposto ser crítico para a estabilidade do genoma. Vários experimental desenhos com base em várias combinações de edu e BrdU pulsos foram utilizados para analisar a progressão do ciclo celular, no telencéfalo ventral e dorsal. Aqui, damos um exemplo de protocolos para permitir o estudo do dano ao DNA aguda da NSPC no primeiro 4 horas após a irradiação em utero de embriões E14.5 do mouse.

Protocolo

1. Procedimentos com animais

Este protocolo foi desenvolvido em conformidade com as directivas da Comunidade Europeia do Conselho de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE) e foi aprovado pelo nosso comitê institucional sobre bem-estar animal (CETEA-CEA DSV IDF).

1. Injeções com edu / BrdU e irradiação de E14.5 camundongos grávidas (Figura 2A).
   1. Prepara-se uma solução de EdU a 1 mg / ml e de BrdU em 5 mg / ml em PBS. Realizar uma injecção intra-peritoneal (IP) de 100 ul de solução de edu utilizando uma agulha de 25 G em ratas grávidas. 1,5 h mais tarde, os ratinhos irradiar (irradiação total do corpo), a 0 Gy, ou 2 Gy (0,6 Gy / min). Imediatamente depois, injectar (IP) de 200 ul de solução de BrdU utilizando uma agulha G 25, nas ratas grávidas.
2. Preparação de cortes coronais de cérebros embrionárias.
   1. Em 1 hora ou 4 horas após a irradiação, eutanásia os ratos grávidas por dióxido de carbono.
   2. Abra a cavi abdominalty mais de três centímetros por meio de tesoura. Separa-se os dois cornos uterinos do resto do útero por corte de ambas as extremidades os chifres. Transferir os cornos uterinos em uma placa de Petri contendo PBS 0,6% de glucose. Abra os cornos uterinos com a pinça, a fim de isolar os embriões. Retire o saco amniótico de cada embrião usando uma pinça.
   3. Dissecar cabeças embrionários com fórceps e corrigi-los por imersão em 4% de paraformaldeído (PFA, pH = 7,4) O / N a 4 ° C.
   4. Lavar cabeças embrionárias em PBS durante pelo menos uma noite a 4 ° C. Cabeças pode ser mantido em PBS, durante vários dias.
   5. Incorporar cabeças em parafina usando um processador de infiltração de vácuo, tal como indicado na Tabela 1. Cabeças incorporação também pode ser realizada sob um capuz químico para etanol e um banho de xilema e depois num forno de 65 ° C para os banhos de parafina.
   6. Prepare 5 mícrons cortes coronais de espessura com um micrótomo.
   7. Montar em lâminas de microscópio revestidas com polilisina.
   8. Slides pode ser mantido à temperatura ambiente (RT) durante vários meses.

2. Edu / BrdU Coloração

1. Desparafinização e antígeno desmascaramento
   1. Retire a parafina as seções do cérebro em parafina por imersão das lâminas em 3 banhos de tolueno por 5 min.
   2. Re-hidratar durante 3 min em dois banhos de cada soluções de concentrações decrescentes de etanol, como se segue: 100% de etanol, etanol a 95%, etanol a 70%, e 5 min em H ₂ O. As lâminas podem ser mantidos em água desionizada durante vários horas.
   3. Ferver as fatias durante 10 min em solução de citrato (10 mM, pH 6), e em seguida, incuba-se água desionizada, durante 5 min.
2. Coloração EdU
   1. Realizar a detecção EdU de acordo com o protocolo do fabricante. Permeabilizar as células com 0,5% de triton X-100 em PBS durante 10 min.
   2. Prepare aditivo tampão 1X EdU diluindo a solução 10X em água desionizada. Esta solução deve ser preparado e usado no mesmo day.
   3. Prepare EdU cocktail reação, incluindo EdU Alexa Fluor 488 azida. É importante adicionar os ingredientes seguintes pela ordem indicada na Tabela 2, de outro modo, a reacção não prosseguirá optimamente. Use o cocktail reação EdU dentro de 15 minutos de preparação.
   4. Remover o tampão de permeabilização (passo 2.1.1), em seguida, lavar duas vezes com PBS.
   5. Adicionar 150 mL de EdU cocktail reação, colocar uma lamela e incubar por 30 min no escuro à temperatura ambiente.
   6. Remover o cocktail reacção EdU, em seguida, lavar uma vez com PBS.
3. Coloração BrdU
   1. Preparar tampão de saturação com 7,5% de soro de cabra e 7,5% de soro fetal bovino em PBS. Adicionar 150 ul de tampão de saturação em fatias de cérebro, colocar uma lamela, e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente para bloquear o anticorpo não-específico de ligação.
   2. Retirar as lamelas. Adicionar 150 mL de rato anti-BrdU anticorpo primário diluído em 1/300 em tampão de saturação, colocar uma lamela e incubar O /N a 4 ° C.
   3. Retirar as lamelas, em seguida, lava-se 3 vezes em PBS.
   4. Adicionar 150 ul de anticorpo de cabra anti-ratinho-Alexa594 anticorpo secundário diluído a 1/400 no tampão de saturação, colocar uma lamela, e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente.
   5. Retirar as lamelas, em seguida, lavar uma vez com PBS.
   6. A coloração nuclear: adicionar 150 uL de 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em 1 ug / ml em PBS, colocar uma lamela e incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente.
   7. Monte slides em meio de montagem.

3. Análise

1. Examine seções do cérebro com um microscópio de fluorescência com um objetivo 20X ou um microscópio confocal e adquirir imagens em três canais (488 nm, 594 nm e UV), como separa arquivos.
2. Empilhe as imagens com o software Photoshop.
3. Analisar seções do cérebro em um setor padrão da parede cerebral dorsomedial. Esse sector é de 100 um, na sua dimensão médio-lateral e está dividido em 18 bandejas (ou mais) de 10 μm de altura na sua dimensão radial utilizando uma grelha sobreposta imagens (Figura 1) como previamente descrito ^31.
   1. Alinhar a grade, como o primeiro compartimento está na superfície ventricular, com o seu eixo longo paralelo ao arco ventricular. Então o número da UDE rotulados, BrdU e / ou núcleos picnóticos (correspondendo a núcleos apoptóticos) em cada bin. Numero um núcleo localizado no limite de dois compartimentos do compartimento que contém a sua maior parte, ou no compartimento inferior, quando o núcleo ocupa áreas iguais dentro dos dois compartimentos.
4. A análise estatística.

Analisar, pelo menos, duas fatias corticais por embrião. Repetir experiências em, pelo menos, 3 a partir de embriões de ninhadas diferentes. Os resultados devem ser dadas como erro médio ± padrão da média (SEM). As análises estatísticas são realizadas com Graphpad Prism usando ANOVA de duas vias e vários testes de comparação posthoc Bonferroni.

Resultados

Na experiência descrita na Figura 2, EdU foi administrado 1,5 horas antes da irradiação e BrdU logo após a irradiação. Quatro tipos de células foram então distinguidos nas fatias corticais preparadas a 1 ou 4 horas após a irradiação, de acordo com a incorporação de BrdU quer EdU ou, ambos ou nenhum (Figuras 2A e 2B). Importante, nem EdU nem a incorporação de BrdU alterou o nível de apoptose induzida por radiação (dados não mostrados). Além disso, os ...

Discussão

O delineamento experimental descrito aqui com base na incorporação de EdU 1,5 hr antes da irradiação e incorporação de BrdU imediatamente após a irradiação permitiu a demonstração de que NSPCs são capazes de ativar S e G2 / M, mas não a ponto de verificação G1 / S durante a 1 ^ª hora após a estresse genotóxico no cérebro fetal mouse. Realizamos outros experimentos em que EdU foi injetado em diferentes momentos após a irradiação e BrdU, apenas 1 hora antes de ratos sacrifícios, permitindo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
EdU	Life Technologies	A10044	1 mg/ml
BrdU	Life Technologies	B5002	5 mg/ml
IBL 637	CIS BIO International
Tissu Tek VIP	Leica
Microtome	Leica	RM 2125 RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit	Life Technologies	C10083
Anti-BrdU	GE Healthcare	RPN202	1/300
Goat anti mouse-Alex594	Life Technologies	A11001	1/400
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-01
Polysine slide	Thermo scientific	J2800AMNZ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS	Life Technologies	20012-068
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Microscope BX51	Olympus
Confocal microscope SPE	Leica
Prism software	Graphpad		Version 5.0c
Photoshop software	Adobe