Transferência de Embrião Utero-tubária e vasectomia no Rato Modelo

Resumo

Transferência de embrião tubário utero-usa a junção útero-tubária como uma barreira para impedir a saída de embriões que podem ocorrer quando se realiza a transferência uterina. Machos vasectomizados são obrigados a obter destinatários pseudográvidas para transferência de embriões. Ambas as técnicas são discutidas.

Resumo

A transferência de embriões pré-implantação de uma fêmea de aluguel é um passo necessário para a produção de ratos geneticamente modificados ou para estudar os efeitos das alterações epigenéticas originou durante o desenvolvimento pré-implantação em desenvolvimento e adulto fetal subseqüente saúde. A utilização de uma técnica de transferência de embriões eficaz e consistente é importante para aumentar a geração de animais geneticamente modificados e para determinar o efeito de diferentes tratamentos sobre as taxas de implantação e sobrevivência a termo. Embriões no estádio de blastocisto são normalmente transferidos por transferência uterina, realizando um furo na parede uterina para introduzir a pipeta de manipulação de embriões. O orifício realizado no útero não fechar após a pipeta foi retirada, e os embriões podem saída para a cavidade abdominal devido à pressão positiva do útero. A punção também pode produzir uma hemorragia que prejudica a implantação, bloqueia a pipeta de transferência e pode afetar o embrião development, especialmente quando os embriões são transferidos sem zona. Consequentemente, esta técnica muitas vezes resulta em taxas de sobrevivência de embriões de baixa muito variáveis, e em geral. Evitar estes efeitos negativos, transferência de embrião tubário utero-aproveitar a junção útero-tubária como uma barreira natural que impede a saída do embrião e evitar a perfuração da parede uterina. Machos vasectomizados são necessários para a obtenção de destinatários pseudográvidas. Uma técnica para realizar a vasectomia é descrito como um complemento para a transferência de embriões útero-tubária.

Introdução

A transferência de embriões é provavelmente o procedimento cirúrgico mais realizado no modelo de mouse. Esta técnica é essencial para a obtenção de descendentes de embriões sujeitos a técnicas de manipulação in vitro e, por conseguinte, constitui um passo necessário para o desenvolvimento de modelos geneticamente modificadas através de injecção pronuclear, a transdução lentiviral, ou a formação de quimeras. Além disso, a técnica permite o estudo dos efeitos sobre o desenvolvimento de diversos insultos que ocorrem durante o desenvolvimento pré-implantação. O uso de técnicas de reprodução artificial ¹ ou a exposição a concentrações anormais de diferentes substâncias ou metabólitos ^{02 de maio} afetar o desenvolvimento do embrião, resultando em falhas de implantação ou de placentação e efeitos a longo prazo na prole. A técnica de transferência de embriões confiável e reprodutível é crucial para testar os possíveis efeitos negativos do tratamento experimental na implantação e desenvolvimento fetal em um homem consistentener.

Embriões de pré-implantação de murino pode ser transferido para uma fêmea receptora, quer para o oviduto através da ampola de 0,5 dias post coitum (DPC) destinatários pseudográvidas (transferência oviduto ^3,4) ou no útero de 2,5 dpc pseudo-destinatário (transferência uterina) ^5,6 dependendo do seu estágio de desenvolvimento. Os embriões na fase de blastocisto, tal como aqueles utilizados para gerar ratinhos quiméricos através da injecção de células estaminais embrionárias pluripotentes ou induzidos, são usualmente transferidas por transferência uterina. Blastocistos pode também ser transferido para o oviducto de um recipiente de 0,5 dpc, mas constitui um teste menos fisiológico para disruptores de desenvolvimento, porque o embrião sofre diapausa e tem 2 dias para se recuperar a partir do insulto antes da implantação ocorra. Transferência uterina envolve perfurar a parede uterina com uma agulha fina, a fim de gerar uma abertura que permite o acesso de uma pipeta de manipulação do embrião no lúmen uterino. Ambora esta técnica pode produzir bons resultados, a sobrevivência a prazo (ou seja, a percentagem de embriões transferidos que se desenvolvem a um filhote de cachorro) é geralmente baixa e imprevisível ^7,8.

O punção da parede uterina implica alguns efeitos secundários prejudiciais. Em primeiro lugar, o miométrio é um tecido altamente vascularizado e seu punção muitas vezes resulta em uma pequena hemorragia. O sangue pode bloquear a pipeta de transferência de embriões ou invadir o lúmen do útero causando a morte embrionária e / ou falhas de implantação. Isto é particularmente relevante quando os embriões são transferidos sem zona, como as células do sangue e detritos pode anexar os blastômeros. Em segundo lugar, a abertura realizada não vedar depois os embriões foram transferidos, de modo que possa fluir para trás através do orifício e ser expulso para a cavidade abdominal, quando uma muito grande volume foi introduzir no útero. A transferência do embrião útero-tubária aqui descritas tomar vantagem da junção útero-tubária para entregar o embryos no útero, sem a necessidade de perfurar a parede uterina e assim evitar as suas consequências adversas ^9.

As fêmeas receptoras pseudográvidas utilizados para transferência de embriões são obtidos por monta natural com machos vasectomizados ^8. As secreções seminais produzidos por um macho estéril, que são necessários para o útero para se tornar receptivo para os embriões transferidos. Para obter um recipiente, um máximo de duas fêmeas de 8 semanas a 6 meses de idade, são colocados com um macho vasectomizado na parte da tarde. Na manhã seguinte, as fêmeas são verificadas quanto a presença de um tampão de cópula vaginal, um grupo de proteínas coaguladas do fluido seminal masculino. Como acasalamento ocorre geralmente durante a meia-noite, o dia de detecção do conector vaginal é considerado 0,5 dpc. Embora machos vasectomizados podem ser adquiridos a partir de alguns vendedores, o procedimento cirúrgico aqui descrito é relativamente fácil e não necessita de quaisquer instrumentos adicionais do que o necessário para a transferência de embriões.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal Care e Use Comittees Beltsville Área (BAACUC 11-015), de acordo com o USDA Animal Care e Use Guidelines.

1. Anestesia e Analgesia (comum para ambos os procedimentos cirúrgicos)

1. Pesar o mouse e colocar os seguintes anestésicos e analgésicos em duas seringas de 1 ml com 27 agulhas L:
   1. A cetamina (0,1 mg / g: 0,01 ml / g de uma solução a 10 mg / ml) e xilazina (0,01 mg / g: 0,005 ml / g de uma solução a 2 mg / ml).
   2. A buprenorfina (0,1 mg / g: 0,01 ml de uma solução 0,01 mg / ml).
2. Imobilizar o mouse por pegar a nuca de seu pescoço, como perto das mandíbulas quanto possível, com o polegar eo dedo indicador e segurando a cauda entre os dedos mínimo e anular.
3. Injetar mistura cetamina-xilazina por via intraperitoneal. A fim de evitar a perfuração de órgãos internos, segure o mouse comsua cabeça um pouco abaixo do nível dos seus quadris (Figura 1A)
4. Injetar buprenorfina subcutânea na nuca do pescoço espera entre o polegar eo dedo indicador (Figura 1B).
5. Deixe o rato na gaiola (limpo e sem qualquer outro animal) em um palco quente.
6. Uma vez que inconsciente, para verificar a ausência de reflexo pé traseiro (marcado por toe pitada). Aplicar pomada para evitar o ressecamento do olho e para verificar a ausência de reflexo palpebral (Figura 1C).
7. Este protocolo fornece um plano de anestesia cirúrgica para um mínimo de 30 minutos, suficiente para realizar os procedimentos descritos abaixo (Protocolos 2 e 3). Se forem necessários tempos mais longos, uma injeção adicional de cetamina + xilazina com a metade da dose descrita na 1.1.1 pode ser aplicado depois de 30 min. A mudança no padrão de respiração para uma mais rápida e irregular um indica o loss do plano de anestesia adequada.

2. Vasectomia

1. Use um macho com uma performance de acasalamento comprovado.
2. Esterilizar instrumentos cirúrgicos, limpar as superfícies onde a cirurgia será realizada e limpe-os com álcool 70%.
3. Realizar anestesia como anteriormente descrito (Protocolo 1), verificando se há perda de reflexos.
4. Posicione o mouse em uma fase quente, retire a pele com tosquiadeiras elétricas da área ventral entre duas linhas imaginárias transversais colocados 0,5 centímetros e 2,5 cm acima do pênis (Figura 2A).
5. Higienizar a área raspada, limpando seqüencial com 10% de iodo povidona e 70% de etanol.
6. Posicione o mouse na posição supina, com a cauda em direção ao cirurgião e cubra com uma toalha estéril com um buraco de expor a área depilada. Iluminar a área cirúrgica.
7. Realize a 10-15 mm incisio pele longitudinaln na linha média do abdome, a cerca de 1 cm acima do pênis. Segure a pele com fórceps vestir serrilhados e depois cortar com uma tesoura (Figuras 2A e 2B).
8. Realizar uma incisão longitudinal 5-10 mm na linha alba. Segurar o músculo com microdissecting fórceps serrilhados e cortados com tesouras (Figura 2C).
9. Agarre o bloco adiposo testicular de um lado com micro dissecação fórceps serrilhados e puxe-o para expor testículo, canal deferente e epidídimo. Canal deferente está localizado medial para o testículo e é um tubo livre claramente distinguíveis (não ligado à parede do testículo como o epidídimo) com um vaso sanguíneo que corre ao longo de um lado (Figura 2D).
10. Segurando o canal deferente com dissecação serrilhada micro fórceps, fórceps vestir chama até que eles ficam vermelhos (Figura 2E ), e então usá-los para cortar e cauterizar os vasos deferentes, em dois pontos de uma só vez (Figura 2F). O corte deve remover uma porção de cerca de 5 mm e deixar duas extremidades cauterizados claramente separadas (Figura 2G).
11. Mova o testículo, epidídimo e ducto deferente de volta para a cavidade abdominal.
12. Continuar a partir do passo 9 na outra testículo.
13. Suturar o músculo com um ou dois pontos de colchão horizontais feitas com 5/0 sutura absorvível (Figura 2H).
14. Sutura da pele com um ou dois cortadores de ferida (Figura 2I).
15. Identificar o vasectomizado (brinco, tatuagem dedo ...), mova-o da gaiola colocada em uma fase quente e observar até que ele se recupera da anestesia (consciente e manter decúbito esternal). A injeção subcutânea 0,5-1 ml de solução salina quente melhora a reperação. Anote as possíveis incidências ocorridas durante a transferência de vasectomia, adicionar antibióticos para a água potável.
16. Clips ferida pode ser removido 10 dias após a vasectomia com um removedor ferida clipper ou um par de fórceps de dentes. O macho vasectomizado estará pronto para acasalar 2 semanas após a cirurgia.
17. Teste a infertilidade do homem vasectomizado por acasalamento com fêmeas férteis antes de usá-lo para obter os destinatários.

3. Transferência de Embrião Utero-tubária

1. Rato mórula ou de blastocisto pode ser transferido por esta técnica a uma fêmea receptora pseudogrï de 2,5 dpc.
2. Prepare embrião pipeta de vidro manipulação:
   1. Polir as pontas dos capilares de vidro, a fim de evitar danificar o suporte da pipeta.
   2. Suavizar uma porção média do capilar de vidro por aquecimento com uma multa chama enquanto um pouco de rotaçãoo capilar com ambas as mãos de forma sincronizada. Uma vez que a secção capilar torna-se macia e maleável (cor vermelho claro), retirá-lo rapidamente do fogo e retire as duas extremidades para reduzir o seu diâmetro externo de 130-150 m.
   3. Aguarde até que o vidro esfriar e depois corte-o levemente marcando a parte estreita com um lápis com ponta de diamante-, pedra abrasiva ou lixa de unha e puxando a partir de ambos os lados. A pausa deve ser limpo e perpendicular
3. Polir a ponta por muito rapidamente em chamas, deixando uma abertura de 100-130 m. Pipetas pode ser armazenado para uso posterior.
4. Quente mídia manipulação de embriões (CZBH ou M2, ver discussão).
5. Esterilizar instrumentos cirúrgicos, limpar as superfícies onde a cirurgia será realizada e limpe-os com álcool 70%.
6. Realizar anestesia como anteriormente descrito (Protocolo 1), verificando se há perda de reflexos.
7. Manter tele mouse em uma fase quente, retire a pele com tosquiadeiras elétricas da área dorsal entre os joelhos e as costelas distal (Figuras 3A e 3B).
8. Higienizar a área raspada, limpando seqüencial com 10% de iodo povidona e 70% de etanol.
9. Mova os embriões da incubadora para a mídia manipulação de embriões pré-aquecido.
10. Mova o destinatário a um estágio quente sob o microscópio estereoscópico e colocá-lo em posição prona lateralmente para o cirurgião (com a cabeça olhando para o lado direito ou esquerdo do cirurgião).
11. Cobrir a área com uma toalha estéril com um furo expondo a área raspada e iluminar a área cirúrgica.
12. Executar de 1 cm transversal incisão (vertical) na pele em um ponto localizado na craniano ⅓ da linha entre a última costela e os quadris eo ⅓ dorsal da linha entre as costas eo abdômen (Figuras 3A and 3B). Segure a pele com fórceps vestir serrilhadas e corte com tesoura (Figura 3C).
13. Uma vez que a pele tenha sido cortado, ovário (vermelho / laranja) ou a almofada adiposa em torno do ovário (branco) pode ser visualizada através da parede do corpo. Realize uma 0,3-0,5 cm transversal (vertical) incisão na parede do corpo sobre o ovário ou almofada adiposo em um local onde a incisão não cortar qualquer grande vaso sanguíneo. Segure o músculo com micro dissecação fórceps serrilhada e corte com tesoura (Figura 3D).
14. Mova o rato para ter a sua cabeça virada para o cirurgião.
15. Carregar a manipulação de embriões pipeta (Figura 3E):
    1. A mídia CZBH subir por capilaridade através da porção estreita da pipeta manipulação até cerca de 5 mm da parte mais larga.
    2. Tome-se uma pequena bolha de ar (0,2-0,5 mm).
    3. Introduzir os embriões (5-10) emuma quantidade mínima de meio (2-4 mm).
    4. Tome-se outra bolha de ar pequeno (0,2-0,5 mm) e uma pequena quantidade de mídia (0,5-1 mm).
    5. Deixe a pipeta de vidro preso no suporte aspirador na boca ou ao dispositivo operado manualmente, pronto para a etapa 3.17.
16. Agarre o bloco adiposo em torno do ovário com micro dissecação fórceps serrilhados e puxe-o para a cabeça do rato para expor o ovário, oviduto, e uma pequena porção superior do útero fora da cavidade abdominal (Figuras 3F e 3G).
17. Segurando o bocal do aspirador na boca, pronto para ser usado, pegue a almofada de tecido adiposo com micro dissecação fórceps serrilhada para mover o oviduto e expor a junção útero-tubária (ou seja, onde o oviduto encontra o útero).
18. Mantendo a junção útero-tubária acessível, tomar pequenas pinças de dissecação micro curvas com a mão esquerda (se destro) e colocá-los logo abaixoa junção útero-tubária agarrando oviduto cerca de 2 mm acima a parte.
19. Segurando a junção útero-tubária com as pequenas pinças de dissecação micro curvas, perfure a seção oviduto perto das pinças com uma agulha de 27 G (Figura 3H).
20. Inserir a manipulação pipeta embrião dentro do orifício efectuada com a agulha e avançar para o útero através da junção útero-tubária (Figuras 3I e 3J). Uma vez que a pipeta passou a junção útero-tubária (figura 3K) que desliza facilmente. Não progredir muito longe dentro do útero para evitar danos endometrial (não mais de 3 mm) e bloqueio pipeta pelos destroços.
21. Solte os embriões no útero, soprando suavemente (Figura 3E). Ambas as bolhas de ar deve passar pelo útero. Alguns meios de comunicação acima da primeira bolhatambém pode ser liberado para o útero, mas evitar a introdução de mais ar, pois pode impedir a implantação.
22. Remova a pipeta logo após embriões foram lançados para dentro do útero.
23. Mova o oviduto e ovário de volta para a cavidade abdominal, agarrando a almofada adiposo.
24. Suturar o músculo com um ponto de colchão horizontal com 5/0 sutura absorvível (Figura 3M).
25. Sutura da pele com um cortador de ferida (Figura 3 N).
26. Continuar a partir do passo 10 no outro lado, se necessário.
27. Identificar o destinatário (brinco, tatuagem dedo ...), mova-o para a sua gaiola (colocado em uma fase quente) e observar até que ele se recupera da anestesia (consciente e manter decúbito esternal).
28. Anotar os possíveis incidentes que ocorrem durante a transferência de embriões e adicionar antibióticos para a água potável. A injeção subcutânea 0,5-1 ml de sali quentesolução ne melhora a recuperação.
29. Clips ferida pode ser removido 10 dias após a transferência de embriões com um removedor ferida clipper ou dois pares de fórceps (Figura 3O). O destinatário pode ser pesado naquele dia para avaliar a gravidez e estimar o número de filhotes. Fornecer material de aninhada ao destinatário 15 dias após a transferência de embriões.

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Resultados

Transferência de embriões útero-tubária fornece um meio para transferir os embriões para o útero evitar algumas das complicações associadas à transferência de embriões uterino ^2,9,10. Na Tabela 1 mostram algum resultado representante obtivemos transferindo blastocistos CD1 submetidos a diferentes tipos de manipulações para destinatários CD1 seguindo o protocolo descrito. A sobrevivência a termo (% dos embriões resultantes em um cão) ou sobrevivência de E15 (no caso de lentiv...

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Discussão

A vasectomia é um procedimento cirúrgico relativamente simples que não envolve grandes dificuldades. Quando saneantes com iodo povidona e etanol ter certeza de que a última lavagem (com etanol) remove iodopovidona, pois pode irritar o peritônio. O acesso ao canal deferente também pode ser alcançado por executar o escroto ou uma incisão no abdómen ^8. Incisão escrotal tem sido recomendado para transversal incisão abdominal devido a incisão menor comparativamente necessário e um pouco melho...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd Laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used; they made narrower drops.