Nanopodia - finas, Projeções frágil membrana com papéis em Movimento Celular e intercelulares Interações

Resumo

Nanopodia são canais de membrana fina, mas frágeis, que se estendem até 100 mm de líder frente ou à direita traseira de um celular e sentir o ambiente celular. Fixação directa a 37 ° C, lavagem suave, e evitar os solventes orgânicos como o etanol, metanol, ou de acetona e de Triton X-100 a concentrações mais elevadas são necessárias para observar estas estruturas celulares.

Resumo

As células aderentes em cultura manter um estado polarizado para apoiar o movimento e interações intercelulares. Nanopodia são finas, alongadas, em grande parte de actina F-negativo-projeções de membrana em células endoteliais e de câncer que podem ser visualizadas através de TM4SF1 (Transmembrane-4-L-seis-família-1) técnica de imunofluorescência. Cachos TM4SF1 em 100-300 diâmetro mM TMED (TM 4SF1 e nriched micro d omains) contendo 3 a até 14 individuais TM4SF1 moléculas. TMED estão dispostas de forma intermitente ao longo nanopodia com um espaçamento regular de 1 a 3 TMED por μ m e ancorar firmemente nanopodia a matriz. Isso permite nanopodia estender mais de 100 μ m do líder frente ou à direita traseira de células endoteliais ou tumorais polarizadas, e faz com que os resíduos de membrana para ser deixado para trás em matrix quando a célula move-se para longe. TMED e nanopodia ter sido ignorado por causa de sua extrema fragilidade e sensibilidade à temperatura. Lavagem de rotina e fixação romper a estrutura. Nanopodia são preservadas por meio da fixação directa de paraformaldeído (PFA) a 37 ° C, seguida por uma breve exposição a 0,01% de Triton X-100 antes da coloração. Nanopodia abrir novas perspectivas na biologia de células: eles prometem para reformular a nossa compreensão de como as células perceber seu ambiente, detectar e identificar outras células à distância, iniciar interações intercelulares em contacto estreito, e dos mecanismos de sinalização envolvidos no movimento, proliferação e celular -celulares comunicações. Os métodos que são desenvolvidos para estudar nanopodia TM4SF1 derivados podem ser úteis para estudos de nanopodia que se formam em outros tipos de células através da agência de tetraspanins clássicos, nomeadamente a CD9 onipresente expressa, CD81 e CD151.

Introdução

Durante a polarização para o movimento, as células animais estender uma variedade de dinâmicas, saliências da membrana de suas superfícies, incluindo filopodia, lamellipodia, fibras de retração, e babados ^1. Recentemente adicionado a esta lista foram nanopodia, um tipo recém-reconhecido de fina (100-300 m de diâmetro), a projeção da membrana alongada (até 50-100 mM de comprimento) que oferecem canais de membrana para a extensão das estruturas de F-actina como filopodia e fibra de retracção, e que coraram positivamente com TM4SF1 (Transmembrana-4-L e seis-família-1) em células endoteliais e de tumor de células cultivadas ^2,3.

TM4SF1 é uma proteína com topologia tetraspaninas semelhante que foi originalmente conhecido como um antigénio das células tumorais antes de ⁴ a descoberta de que a molécula é um biomarcador de células endoteliais, que desempenha um papel essencial na proliferação de células endoteliais e migração de ^2,3. Imunofluorescência revelou que TM4SF1 está localizada a perinucvesículas Lear e para a membrana plasmática, e é enriquecido em TM 4SF1 e nriched micro omains d (TMED). TMED âncora nanopodia à matriz e presente em um padrão em faixas regularmente espaçadas de 1-3 comprimento TMED / mM de nanopodia. Nanopodia normalmente se estendem desde principal frente de uma célula e à direita traseira durante a polarização celular para o movimento. Devido à natureza aderente firme de TMED, nanopodia são incapazes de retrair de volta para dentro da célula, uma vez que se move para longe; resíduos nanopodia abandonados traçar, assim, o caminho do movimento celular. Nanopodia fornecer canais de membrana para a extensão F-actina e retração, e são locais de interações intercelulares e comunicações ^2,3. Essas características significam que nanopodia proporcionar uma oportunidade única de estudar os mecanismos subjacentes a montagem F-actina durante a polarização celular, sensor de celular do ambiente, a determinação do caminho e direção do movimento celular e interações intercelulares umnd comunicações.

Devido à natureza altamente hidrofóbico de TMED ea natureza membranoso fina e frágil de nanopodia, um cuidado especial deve ser tomado a fim de preservar TMED e nanopodia. A destruição de nanopodia e remoção de TMED por métodos comuns de laboratório é uma possível razão para que apenas sessenta e três publicações apareceram na TM4SF1 desde a sua primeira descoberta, em 1986, ¹ e para a total falta de conhecimento de TM4SF1 enriquecimento em 100-300 mM microdomínios em superfície das células até que o relatório de TM4SF1 em células endoteliais em 2009 ^2.

Métodos convencionais vulgarmente imunocoloração utilizar solventes orgânicos como o etanol, metanol, acetona ou para fixar as células e utilizar de 0,1% ou mais elevada a concentração de Triton X-100 a permeabilizar as células ^5. Estudos descritos aqui implementados três grandes mudanças para o método convencional para revelar TMED e nanopodia: (i) usar 37 ° C PFA 4% e corrigir as células em um 3776; incubadora C, (ii) aplicar suave temperatura ambiente de lavagem PBS, e (iii) utilizar a menos de 0,03% de Triton X-100 apenas brevemente para permeabilizar as células antes da adição do anticorpo primário, tal como Triton X-100 0,03% maior do que irá extrair TM4SF1.

Todos tetraspanins formar microdomínios sobre a membrana da célula ⁶ e alguns colocalize com TMED em endoteliais e células tumorais ^2,3. Como tetraspanins como CD9, CD81, CD151 e são ubiquamente expressas, o protocolo de coloração descrito aqui pode ser estendida a muitos tipos de células diferentes que carecem TM4SF1 para os estudos de função nanopodia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Cultura de Células em colágeno revestido Disk Vidro

1. Coloque os discos de vidro (12 mm de diâmetro) em uma jarra de vidro (4 oz) e autoclave para esterilizar os discos.
2. Colocar 25 ml de etanol a 70% em um tubo Falcon de 50 ml e coloca-se numa capa de cultura de células. Esta solução pode ser reutilizada várias vezes até que o nível da solução baixa para 20 ml.
3. Coloque uma pinça afiada com um ponto extra fino no etanol 70% por 5 minutos antes de usá-lo para lidar com o disco de vidro.
4. Cuidadosamente remover a pinça para fora do tubo e fechar a tampa, em seguida, colocar gentilmente a pinça de etanol tratada na parte superior do tubo de ar seco, durante 2 min. Não permita que a ponta da pinça para tocar qualquer coisa no capô.
5. Use as pinças esterilizadas para pegar um disco de vidro estéril fora da jarra de vidro e coloque-o em um poço da placa de 24 poços de cultura de células. Repita até que o número desejado de poços foi preenchido com discos.
6. Coloque 500 mL de solução de colágeno bovino (50 ng / mL) em cada cavidade que contém um disco de vidro e coloque-a num banho a 37 ° C, 5% de CO ₂ célula incubadora de cultura durante pelo menos 30 min. Não há mal nenhum em um período de incubação mais longo.
7. Colheita (HUVEC Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana) ou PC3 (células de tumor da próstata) que já foram cultivadas em placa de 150 mm de cultura de células por meio de tripsinizao e bloqueiam a actividade da tripsina utilizando o seu meio de cultura completo. Recolher as células para um tubo Falcon de 15 ml.
8. Conte o número de celular e certifique-se a viabilidade é superior a 90%.
9. Agregar as células por centrifugação a 200 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante.
10. Utilizar o meio de cultura para diluir as células a 10 ⁵ células / ml. Coloque as células no gelo.
11. Aspirar o colagénio no capuz de cultura de células e colocar suavemente a 500 ul de suspensão celular a cada cavidade em que os discos de vidro foram pré-revestidos com colagénio. 5 x 10 ⁴ células / cavidade da placa de 24 poços, vai dar 60% confluency para HUVEC e 30% de confluência de células PC3. Nota: adicionar mais suspensão de células para uma maior densidade de células.
12. Cultura as células em um 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, ou 24 horas para rastrear as atividades nanopodia e passagem celular. Normalmente, as células irá anexar ao disco de vidro nos primeiros 30 min, em seguida, começar a se polarizar e migrar na primeira hora, e realizar interações intercelulares e divisão celular nas horas seguintes.

2. A fixação celular

1. Cada poço terá 500 mL de 4% PFA (paraformaldeído) para fixar as células. Quer comercialmente ou fabricado feito recentemente PFA a 4% pode ser usado. Calcular a quantidade de PFA necessário com base no número de poços preparados, e colocar PFA num tubo Falcon de 15 ml. CUIDADO: paraformaldeído é um cancerígeno.
2. Coloque o tubo de falcon em um estande de isopor que já estava em vigor em 37 ° C incubadora. Deixe o tubo na incubadora por 30 min para a guerram até o PFA para 37 ° C.
3. Coloque uma almofada de aquecimento na capa de cultura e ligá-lo.
4. Retire a placa de cultura de células de 24 poços ea PFA pré-aquecido para fora da incubadora e coloque-o em cima da almofada de aquecimento.
5. Use uma mão para aspirar o meio de um poço, e imediatamente depois use a outra mão para deslizar suavemente 500 mL PFA no poço através da borda também. Para facilitar a aspiração, inclinar a placa de cultura a cerca de 45 °, encostando-o suporte de isopor de modo que é estável a este ângulo. Isto irá facilitar a aspiração e adição de solução de PFA para o bem, sem perturbar as células na cultura. Este é o passo mais importante para preservar a estrutura celular inicial de actividades celulares.
6. Repita o processo até que todos os poços com um disco de vidro receberam PFA. Nota: todas as etapas que precisam mudar de solução pré-existente do poço vai aplicar procedimentos mesma aspiração.
7. Colocar a placa de 37 ° C durante 5 min.
8. Pegue a placa de volta para a capa de cultura e incline contra isopor como descrito no passo 2.5. Use uma mão para transferir suavemente a PFA do poço em um tubo de coleta; use a outra mão para colocar logo em seguida, pelo menos, 500 temperatura ambiente mL PBS no poço. Depois de todos os poços foram lavados, voltar e repetir a lavagem PBS mais uma vez em todos os poços. Esvazie o PFA coletado em um recipiente de resíduos perigosos.
9. Preparar tampão de bloqueio TPI por adição de 2% de soro fetal bovino para PBS. Azida de sódio a 0,04% (diluído a partir de solução-mãe de 20%) é adicionado como conservante. AVISO: A azida de sódio é um composto tóxico. O tampão pode ser armazenado em 4 ° C, durante um longo período de tempo sem a contaminação bacteriana.
10. Com a placa de cultura ainda inclinado contra um suporte, uma vez por cada ciclo de aspiração bem para remover PBS e imediatamente depois adição de 500 ul de tampão de bloqueio de ICC. As células estão prontas para a coloração de imunofluorescência. Se necessário, océlulas fixadas podem ser armazenados num refrigerador 4 ° C durante uma semana sem perda significativa da proteína TM4SF1.

3. TM4SF1 Imunofluorescência Coloração de Nanopodia

1. Em cada poço, a substituição de 500 ul de tampão de bloqueio do TPI com um novo tampão de bloqueio contendo 0,01% de Triton X-100 e deixar repousar à temperatura ambiente durante 1 hora. Não utilizar mais elevado do que 0,03% de Triton X-100, uma vez que irá remover TM4SF1 a partir de membranas celulares. PBS células lavadas do passo 2.10 pode ser directamente transferida para o tampão de bloqueio contendo Triton se a coloração está pronto para ser iniciado imediatamente.
2. Dilui-se o anticorpo primário anti-TM4SF1 (ou anti-CD9) a 0,5 ug / ml em tampão de bloqueio de ICC.
3. Em cada poço, remover o tampão de Triton ICC/0.01% e substituí-la com 300 ml da solução de anti-TM4SF1-anticorpo. Incubar 2 horas à temperatura ambiente ou deixar durante a noite a 4 ° C.
4. Lavar cada poço com não menos do que 500 ul de PBS. Repita 3x; cada vez dar a least 5 min do tempo de incubação.
5. Prepara-se uma solução de anticorpo secundário e faloidina em ICC tampão de bloqueio, usando uma diluição de 1000 vezes de Alexa 488 anticorpo secundário marcado de burro anti-ratinho (2 ug / ml de concentração final) e 1.000 x diluição de faloidina (50 ng / mL de concentração final).
6. Remover PBS e adicionar 300 ul da solução de anticorpo secundário e faloidina a cada poço e incubar durante 2 horas ou deixá-lo durante a noite a 4 ° C.
7. Repita os passos de lavagem PBS com pelo menos 5 minutos de incubação por lavagem. Na última lavagem, deixar cada poço em PBS, durante 1 hora.
8. Largar uma única gota (~ 10 mL) de montagem anti-fade mídia sobre uma lâmina de vidro.
9. Dobre a ponta de um 19 G 1 ½ na agulha da seringa de 90 ° pressionando suavemente sobre uma superfície dura. Use uma mão para segurar a agulha dobrado e gentilmente levante um disco de vidro do bem e utilize a outra mão para segurar o disco usando a pinça afiadas.
10. Vire o disco de vidro e# 160; viradas para baixo deixando o contato célula lado os meios de comunicação de montagem na lâmina de vidro. Delicadamente, coloque o disco de vidro e deixe-a secar durante a noite em um lugar escuro à temperatura ambiente.
11. Prossiga para a imagem da imunofluorescência manchado nanopodia, ou armazenar os slides em uma caixa de lâminas a -20 ° C. Os slides permanecerá visível por alguns meses em -20 ° C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Para o Passo 1:

Se as células (como HUVEC e PC3 utilizado neste estudo) são capazes de crescer normalmente, as células irá anexar o disco revestido de colágeno dentro de 30 minutos depois que eles são semeadas, polarizar e tornar-se móvel logo depois, e estender nanopodia à frente do seu caminho de movimento. Figuras 1A e 1B mostram, respectivamente, um polarizado e em proliferação de HUVEC. Figura 2A mostra células PC3 polarizado nu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Nanopodia são finos canais de membrana celular que ligam firmemente à matriz através TMED e pode se estender mais do que 100 mm a partir de uma célula móvel polarizada para sentir o ambiente e mediar interações intercelulares ^2,3. Nanopodia aderir à matriz tão firmemente que os resíduos são deixados para trás, como os movimentos de células de distância (Figuras 1 e 2). Nanopodia assim nos permitem estudar como as células sentir seu ambiente e determinar o camin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass disks	Fisher Scientific	12-545-82	12 mm diameter
Glass jar	Fisher Scientific	02-912-310	Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz
Glass slide	Fisher Scientific	12-544-1	Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides
50 ml Falcon tube	BD Falcon	352070	50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.
15 ml Falcon tube with Styrofoam rack	Corning	430790	Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes
Sharp forceps	Fisher Scientific	13-812-42	Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps
24-well Cell culture plate	BD Bioscience	353047	24-well Cell Culture Plate
150 mm Cell culture plate	BD Bioscience	353025	150 mm cell culture plate
19 G 1 ½ Syringe needle	BD Bioscience	309635	19 G 1 ½
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2701	Decon's Pure Ethanol 200 Proof
Collagen solution	BD Bioscience	354249	Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-053-CI	0.25% Trypsin-EDTA 1x
DMEM	Life Technologies	11965-092	DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS, 10x Solution, pH 7.4
PFA (paraformaldehyde)	Affymetrix	19943 1 LT	4% in PBS
FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	Fetal Bovine Serum
EGM2-MV	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.
Mouse anti-human TM4SF1 antibody	Millipore	MAB3127	Epitope is located in extracellular domain
Mouse anti-human CD9 antibody	BD Bioscience	555370	Epitope is located in extracellular domain
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody	Life Technologies	A-21202	Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)
Phalloidin	Chemicon	90324	Rhodamine-conjugated Phalloidin
Anti-fade mounting media	Life Technologies	P-36931	ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI
70% Ethanol			17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water
10x PBS (make 200 ml)			20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water
20% Triton X-100 (make 20 ml)			4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water
4% NaN3 (make 25 ml)			1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water
50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)			Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS
ICC Blocking Buffer (50 ml)			49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3)
ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)			50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100
HUVEC	Lonza	C2517A	www.lonza.com
PC3	ATCC	CRL-1435	www.atcc.org
Cell culture hood	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet
37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator
Heating pad	K&H Manufacturing	1020	K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com)
Centrifuge	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hemocytometer