Captura de glicopeptídeos de Superfície Celular Proteômica

Resumo

As proteínas de superfície são biologicamente importantes e amplamente glicosilada. Apresentamos aqui uma abordagem de captura de glycopeptide para solubilizar, enriquecer e deglycosylate estas proteínas para análise proteômica baseada LC-MS fáceis.

Resumo

Proteínas de superfície celular, incluindo as proteínas da matriz extracelular, participam em todos os principais processos e funções celulares, tais como o crescimento, a diferenciação e proliferação. A caracterização detalhada destas proteínas fornece informações ricas para a descoberta de biomarcadores, a identificação do tipo de célula, e seleção-alvo da droga, bem como ajudando a avançar a nossa compreensão da biologia celular e fisiologia. Proteínas de superfície, no entanto, colocam desafios analíticos significativos, devido à sua inerente baixa abundância, alta hidrofobicidade, e pesadas modificações pós-traducionais. Aproveitando a glicosilação em proteínas de superfície predominante, apresentamos aqui uma abordagem de captura de glicopéptido de alto rendimento, que integra as vantagens de vários meios N-glycoproteomics existentes. Nosso método pode enriquecer os glicopeptídeos derivados de proteínas de superfície e remover seus glicanos para proteômica fáceis utilizando LC-MS. A N-glycoproteome resolvido compreende a informação de identidade e quantidade de proteína, bem como os seus locais de glicosilação. Este método foi aplicado a uma série de estudos em diversas áreas, incluindo o cancro, as células estaminais, e a toxicidade da droga. A limitação do método reside na fraca abundância de proteínas de membrana de superfície, de tal modo que uma quantidade relativamente grande de amostras é necessária para esta análise em comparação com estudos centrados em proteínas citosólicas.

Introdução

Proteínas da superfície da célula interagir com o ambiente extracelular e transmitir sinais a partir do exterior para o interior de uma célula. Assim, estas proteínas, incluindo proteínas de matriz extracelular, desempenham papéis críticos em todos os aspectos da biologia celular e fisiologia variando de proliferação, o crescimento, a migração, a diferenciação de envelhecimento e assim por diante. Proteínas de superfície de funcionar interagindo com outras células, proteínas e pequenas moléculas ^1-3. Caracterização molecular de proteínas da superfície celular, é de grande interesse, não só para os biólogos, mas também para as empresas farmacêuticas, mais do que 60% ​​da droga são dirigidos a proteínas da superfície da célula ^4.

Espectrometria de massa em tandem (MS), com a sua sensibilidade superior, precisão e rendimento para a identificação de proteínas e peptídeos, tem sido uma ferramenta poderosa para estudos de proteômica globais ^5,6. No entanto, as proteínas de superfície representam desafios significativos para proteômica baseada em MS, comoa maioria das proteínas de superfície existe em baixas quantidades, e com modificações pesados. As regiões que atravessam a membrana das proteínas de superfície de torná-los hidrófobos; este é especialmente o caso de proteínas transmembrana multipass. É, portanto, difícil de dissolver as proteínas de membrana em soluções aquosas, sem a ajuda de um detergente; no entanto, o uso de detergentes geralmente suprime o desempenho de HPLC e MS ^1,7,8 na identificação de proteínas. Portanto, as proteínas da membrana foram mal caracterizado em proteômica baseada LC-MS diretos.

A glicosilação é uma das modificações pós-tradução mais importantes e abundantes que ocorrem em proteínas da superfície das células ^9. A enorme complexidade e heterogeneidade dos glicanos dificultar sinal de ¹⁰ MS 'peptídeos. No entanto, vários métodos proteomic usaram esta modificação única para enriquecer as proteínas de superfície e para remover as porções de açúcar a partir de proteínas antes da análise por LC-MS. Estes métodos incluem baseada em lectina de captura por afinidade e ¹¹ à base de ácido de captura ¹² ou químico bórico à base de hidrazida, bem como separações cromatográficas hidrofílicos ^8,13. A remoção dos glicanos transforma as proteínas da membrana de proteínas e regulares drasticamente simplifica a caracterização MS. Porque glicosilação também ocorre em proteínas secretadas que têm alta solubilidade em contraste com a membrana proteínas, muitos métodos glycoproteomic são otimizados para proteínas solúveis, e tendem a ter menor seletividade glycopeptide e sensibilidade ao ser implantado para a membrana proteínas ^8,14. Outros métodos também existe para o enriquecimento, em particular, as proteínas da superfície celular, tais como aqueles utilizando ultracentrifugação ¹⁵ e estratégias de rotulagem ^16. Uma comparação detalhada entre o nosso método e outros métodos existentes para a caracterização de proteínas de membrana foi realizada recentemente ^17, e os resultados indicaram que o método pode executar igualmente bem, se nãomelhor, do que todos os métodos de comparação proteómica membrana, mas com maior simplicidade.

Para ajudar os pesquisadores a utilizar este método, detalhamos aqui um protocolo geral. Este método integra várias vantagens de estratégias glycoproteomics existentes e é concebido especificamente para glicoproteínas de membrana, no entanto, o método funciona igualmente bem para as proteínas secretadas. As características deste método incluem: 1) uma solubilização completa de proteínas de membrana, 2) um enriquecimento de glicopéptidos em vez de glicoproteínas para eliminar o potencial impedimento espacial quando se utiliza um substrato de captura de sólidos, 3) a utilização da química de hidrazida para formar ligações covalentes entre glicopéptidos e o substrato de captura, de modo a que os glicopéptidos ligados tolera lavagens rigorosas para alta glycoselectivity, e 4) a capacidade de realizar o processo de captura de todo em um tubo para a perda de amostra reduzida ea duração do procedimento encurtado. Depois de implementar este método para estudar uma variáveledade de amostras biológicas, incluindo células e tecidos, observou-se uma selectividade elevada (> 90%) às glicoproteínas ^8,17,18.

Protocolo

1. Colheita Membranas

1. Adicionar tampão hipotónico (10 mM Tris-HCl, 10 mM de KCl, 1,5 mM MgCl _2, pH 8,0) com o cocktail inibidor de protease para um agregado de células (~ 10 ⁸ células) e incuba-se durante 15-30 minutos em gelo. Lyse as células por fazer passar a amostra através de agulhas de seringas (5-10 passagens) ou homogeneizar a amostra por um homogeneizador Dounce (15-30 AVC). Use um hemocitômetro e coloração azul de tripan para verificar a eficiência da lise.
2. Obter a fracção microssomal por uma centrifugação diferencial do ligado em 3000 gx 15 min e em seguida a 100.000 gx 2 hr. A primeira centrifugação obtém uma pelete que é a fracção nuclear, e a subsequente centrifugação do sobrenadante gera um segundo sedimento, que é a fracção microssomal que contém a membrana plasmática, bem como organelos ligados à membrana ^8. O sobrenadante final é a fracção citosólica. Guarde as frações microssomais em freezer -80 ° C para mais analysé como se indica a seguir.

2. Dissolve, desnaturação e Digest Proteínas da Membrana

1. Dissolve-se a fracção microssomal no tampão de desnaturação (Tris 40 mM, EDTA 10 mM, 10 mM de TCEP, 0,5% Rapigest, pH 8) e depois incubar a solução a 100 ° C durante 10 min.
2. Arrefece-se a solução aquecida até à temperatura ambiente, adicionar ultra-alta pureza ureia em pó a uma solução de 8 M de concentração final e incubar a amostra a 37 ° C durante 30 min.
3. Adicionar solução de estoque de iodoacetamida à amostra de 15 mM de concentração final, e incubar a solução no escuro durante 30 min à temperatura ambiente para alquilar os tióis livres na amostra. Adicionar solução de estoque de DTT para a amostra a uma concentração final de 10 mM e incuba-se a solução durante mais 10 min à temperatura ambiente para extinguir o excesso de iodoacetamida.
4. Dilui-se a solução obtida com 10x tampão de Tris 40 mM a pH 8, e, subsequentemente, adicionar tripsina à amostra a uma razão de 01:20 trypsin para a proteína total. Manter a reacção de digestão durante a noite num forno de 37 ° C para assegurar o fim da reacção.
5. Terminar a digestão por acidificação da solução de amostra para pH 1 com HCl, uma condição que também divide o detergente, ou seja Rapigest. Degradar o Rapigest a 37 ° C durante 1 hora, e remover a precipitação desenvolvido por centrifugação.
6. Limpar o sobrenadante que contém péptidos de amostra por um cartucho C-18 de extracção em fase sólida (SPE) e secar a amostra obtida por speedvac.
7. Realizar uma análise de SDS-PAGE de amostras antes e depois de digestão com tripsina para confirmar a eficiência da digestão.

3. Captura glicopéptido

1. Dissolve-se os péptidos limpas no tampão (acetato de sódio 100 mM, pH 5,5) de acoplamento. Adicionar periodato de sódio na solução de péptido com uma concentração final de 10 mM durante 30 min no escuro, à temperatura ambiente. Isto irá oxidar os grupos cis-diol em glicanos de aldeídos, Que permitem que os glicanos a par com a resina através de química hidrazida. Extingue-se o excesso de periodato de sulfito de sódio a uma concentração final de 20 mM e pH 5 durante 10 minutos à temperatura ambiente.
2. Introduzir resina derivatizada com hidrazida para a solução de péptido com uma razão de 1:4 (resina de solução) para acoplar glicopéptidos à resina. Incubar a reacção a 37 ° C durante 1-2 dias com a rotação de ponta a ponta para o acoplamento completo.
3. Remover os péptidos não ligados por lavagem da resina duas vezes com 1 ml de cada um dos seguintes: água DI, 1,5 M de NaCl, 80% de metanol e acetonitrilo. Finalmente, lava-se a resina 3x com 1 ml de NH ₄ HCO ₃ a 100 mM, pH 8 para trocar o tampão do sistema de NH ₄ HCO ₃ a 100 mM.
   1. Recolhe-se o sobrenadante e as lavagens para a análise de péptidos não ligados (opcional).
4. Soltar os N-glicopéptidos a partir da resina por PNGase F numa incubação durante a noite a 37 ° C com umn fim-de-final da rotação. Recolha os peptídeos liberados por centrifugação e lavagem acetonitrila 80%. Seca-se a solução obtida no Speedvac para análise por LC-MS.

4. Fraccionamento adicional (opcional)

Para simplificar ainda mais a complexidade da amostra, fracionar as N-glicopeptídeos obtidos. Por exemplo, dissolver-se os péptidos secos em 10 mM de formato de amónia, pH = 3 com 20% de acetonitrilo e utilizar de permuta catiónica forte (SCX) de cromatografia para fraccionar os péptidos. Seca-se o eluente obtido, e, em seguida, analisar as fracções de péptido obtidas por inversão de fases LC-MS ^8,17,18.

5. Limpeza de N-glicopeptídeos Lançado (Opcional)

Se levantar preocupações para o potencial de contaminação dos péptidos, redissolver os péptidos secos em ácido fórmico a 0,1% e usar uma coluna SPE MCX para limpar ainda mais os péptidos antes de fase reversa A análise por LC-MS.

Nota: Os parâmetros de busca de banco de dados.

Durante a clivagem selectiva de N-glicopéptidos fora da resina, PNGase F converte a asparagina ligada de N-glicanos de um ácido aspártico. Portanto, existe um deslocamento de massa de 0,9840 Da dos libertadas N-glicopéptidos. Para identificar com precisão estes péptidos, esta modificação pode ser adicionada para os parâmetros de pesquisa juntamente com modificações comuns, tais como o carbamidomethylation de cisteína e à oxidação do que a metionina.

Resultados

Uma carta do procedimento experimental fluxo representativo é resumido na Figura 1. A rotulagem e as novas medidas de fracionamento são opcionais e os detalhes estão descritos em uma publicação recente ^18. Uma outra opção é para analisar os péptidos não modificados, que não reagem com a resina. As vantagens da análise dos péptidos não modificados incluem a identificação potencial de peptídeos e proteínas não glicosiladas, tais como claudinas nas junções apertadas; uma van...

Discussão

Aqui apresentamos uma estratégia de captura de glycopeptide para perfilar as proteínas da superfície celular. O método pode ser aplicado para estudar as proteínas segregadas, tal como aqueles em sangue, assim como em outros fluidos corporais, ou em meios de cultura de células.

O sucesso do método que se baseia na digestão completa de amostras; por conseguinte, uma caracterização de SDS-PAGE da eficiência da digestão é necessário, especialmente para a análise pela primeira vez ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamide	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Sodium periodate	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz hydrazide gel	Bio-Rad	153-6047
Trypsin	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge	Waters	WAT054955
Oasis MCX cartridge	Waters	186000252
Protease inhibitor coctail	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Sodium sulphite	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
α-1 trypsin	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumin	Sigma	A5503
Conalbumin	Sigma	C0755