Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

Resumo

A retina de roedores tem sido reconhecida como uma janela de acesso para o cérebro. Neste documento técnico que proporcionam um protocolo que utiliza o modelo de ratinho de retinopatia induzida por oxigénio para estudar os mecanismos que levam à insuficiência de regeneração vascular dentro do sistema nervoso central após a lesão isquémica. O sistema descrito também pode ser aproveitada para explorar estratégias para promover o crescimento de vasos sanguíneos funcionais dentro da retina e do SNC.

Resumo

A retina roedor é, talvez, o sistema de mamífero mais acessível que a investigar interacção neurovascular dentro do sistema nervoso central (SNC). É cada vez mais reconhecido que várias doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, esclerose múltipla e esclerose lateral amiotrófica apresentam elementos de comprometimento vascular. Além disso, as causas mais importantes de cegueira em populações pediátricas e de trabalho idade (retinopatia da prematuridade ea retinopatia diabética, respectivamente) são caracterizadas por degeneração vascular e insuficiência de rebrota vascular fisiológico. O objetivo deste documento técnico é fornecer um protocolo detalhado para estudar a regeneração vascular CNS na retina. O método pode ser utilizado para elucidar os mecanismos moleculares que conduzem à falha de crescimento vascular após lesão isquémica. Além disso, possíveis modalidades terapêuticas para acelerar e restaurar plexos vasculares saudáveis ​​podem ser exploradas. Achados obtained utilizando a abordagem descrita pode fornecer meios terapêuticos para retinopatias isquêmicas, tais como diabetes ou que de prematuridade e possivelmente beneficiar outros distúrbios vasculares do SNC.

Introdução

Ao longo do desenvolvimento do SNC, nervos, células do sistema imunológico e vasos sanguíneos estabelecer redes notavelmente acoplados para garantir adequada perfusão tecidual e permitir a transmissão de informações sensoriais ^1-5. O colapso dos sistemas vascular resulta na oxigenação dos tecidos ea oferta insuficiente metabólica comprometida e é cada vez mais reconhecida como um importante contribuinte para a patogênese de doenças neurodegenerativas ^6. Abandono vascular e a deterioração da unidade neurovascular dentro do cérebro, por exemplo, está associado com a demência vascular, lesões vasculares da matéria branca do cérebro ⁷ e doença de Alzheimer com estenose de arteríolas e vasos de pequeno calibre ^8. Além disso, a função de barreira vascular prejudicada é pensado para contribuir esclerose múltipla ⁹ e esclerose lateral amiotrófica ^10.

De relevância direta para o modelo de retina descrito neste protocolo, cegandodoenças tais como a retinopatia diabética ¹¹ e retinopatia da prematuridade ^{12, 13} são caracterizados por uma fase de degeneração vascular precoce. O estresse isquêmico que se seguiu na retina neurovascular desencadeia uma segunda fase de neovascularização excessiva e patológica que provavelmente se origina como uma resposta compensatória ao oxigênio restabelecer o fornecimento de energia e ^14-16. Uma estratégia atractiva para superar o stress isquémico que é central para a progressão da doença é o de restaurar redes vasculares funcionais especificamente nas zonas isquêmicas do sistema neuro-retina (Figuras 2 e 3). Provocar uma resposta angiogênico controlado pode vir transversalmente como um contra-senso para uma condição em que os tratamentos anti-angiogênicos, tais como anti-VEGF são considerados tratamentos adaptados. No entanto, a evidência para a validade desta abordagem é montagem. Por exemplo, aumentando a rebrota vascular "fisiológico-like" em ischemretinopatias ic foi elegantemente demonstrado através da introdução de células precursoras endoteliais ^17, a inibição da Müller VEGF expresso de células na supressão induzida de outros fatores angiogênicos ^18, injeção de células progenitoras mielóides ^19, a inibição da NADPH oxidase a apoptose induzida por ^20, aumentando dietético ω-3 fatty poliinsaturados ingestão de ácido ^21, o tratamento com um fragmento do terminal carboxilo do triptofano tRNA ^22, e a administração directa de VEGF ou FGF-2, para a protecção de células gliais ^23. Além disso, foi demonstrado que o modulando pistas de orientação neuronais clássicos, tais como netrinas Semaforinas ou em retinopatias isquêmicas acelera a regeneração vascular de vasos saudáveis ​​dentro da retina e, consequentemente, reduz a angiogénese patológica ^{24, 25.} De relevância clínica direta, vários dos estudos realizados em animais acima mencionados fornecem evidências de que a promoção re vasculargeração durante a fase isquêmica precoce de retinopatias pode reduzir significativamente risco de vista pré-retinal neovascularização ^{19, 23, 24, 26,} provavelmente através da redução da carga isquêmica.

Elaboração de estratégias terapêuticas que estimulam a regeneração dos vasos funcionais continua a ser um desafio significativo para os biólogos vasculares. Aqui nós descrevemos um sistema experimental que utiliza o modelo do rato de retinopatia induzida por oxigênio (OIR), para explorar estratégias para modular a rebrota vascular dentro da retina. Desenvolvido por Smith et al., Em 1994, ^27, este modelo serve como um proxy para retinopatias proliferativas humanos e consiste em expor filhotes P7 rato para 75% O ₂ até P12 e, posteriormente, re-introduzir os filhotes para a sala ambiente O _2-tensão (Figura 1). Este paradigma vagamente imita um cenário onde um bebê prematuro é ventiladocom o O _2. A exposição de filhotes de rato à hiperóxia provoca degeneração dos capilares da retina e microcirculação, e produz uma área reprodutível de vaso-obliteração (VO) normalmente avaliada em saída de O ₂ no P12, embora a área VO máxima é atingida aos 48 hr (P9) após exposição ao O ₂ ^28. No ratinho, as zonas avasculares VO regenerar-se espontaneamente ao longo da semana seguinte re-introdução de ar ambiente e, eventualmente, as zonas de VO são completamente re-vascularização (figura 2). Re-introdução de ar ambiente, de ratinhos submetidos a OIR também provoca neovascularização pré-retinal (NV) (máximo a P17), que é tipicamente avaliada para determinar a eficácia de paradigmas de tratamento anti-angiogénicos. Na sua forma mais pura, o modelo OIR fornece uma ferramenta altamente reprodutível e quantificável para avaliar a degeneração vascular induzida por oxigénio e determinar a extensão da neovascularização destrutiva pré-retiniana ^29-31.

Vários paradigmas de tratamento exploratório que modulam a regeneração vascular CNS pode ser investigado usando o modelo OIR incluindo o uso de compostos farmacológicos, terapia genética, deleção do gene e muito mais. A propensão de uma determinada abordagem para influenciar rebrota vascular é avaliada passo a passo na janela entre P12 (VO máxima após saída da hiperóxia) e P17 (NV máxima). A avaliação dos resultados do tratamento na NV patológico pode ser rapidamente e facilmente determinada em paralelo e foi exaustivamente descrito por Stahl e colegas ^{30, 31.} Aqui nós fornecemos um procedimento simples passo-a-passo para investigar a modulação da revascularização fisiológica dentro da retina neural por compostos farmacológicos, terapêuticos potenciais, vetores virais ou para estudar a influência dos genes candidatos em camundongos transgênicos ou nocaute.

Protocolo

Declaração de Ética: Todos experimentação animal adere as diretrizes de cuidados de animais estabelecidas pela Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração para o uso de animais em Ophthalmic and Vision Research e pelo Conselho Canadense de Cuidado Animal.

1. Oxigênio Induzida Retinopatia (OIR)

1. Registar a data de nascimento de filhotes de rato como P0.
2. Registre todos os pesos dos animais aquando da entrada em O ₂ para garantir uma faixa de peso adequado. Nota: Para C57BL / 6 ratos em P17, o peso corporal deve variar entre 5 e 7,5 g de NV máxima ^32. A fim de manter a consistência do ambiente, é recomendado o uso da mesma ninhada de controlo (para ratinhos geneticamente modificados, bem como ratinhos que receberam tratamentos experimentais). Ao avaliar os efeitos de um vetor viral, deve-se considerar o tropismo do vírus e dar tempo suficiente para a plena expressão de transgenes por vírus entregues. Rapidamente expressar viralOs vectores, tais como os lentivírus 3 ^ª geração ^{24, 25, 33} são recomendados.
3. Filhotes lugar do mouse no P7 (C57BL / 6 ou desejado tensão) e um CD1 fomentar mãe em uma câmara de oxigênio fixado em 75% O ₂ por 5 dias ^27. Umidade e temperatura ambiental foram mantidas constantes durante toda a exposição O _2. Nota: As instalações de investigação equipados com uma fonte central de O ₂ são ideais e limitar a substituição pesado de O vazio ₂ tanques. Se estiver trabalhando com camundongos transgênicos ou nocaute, é importante para garantir que o controle e os ratos experimental são adquiridos do mesmo fornecedor para limitar desvios genéticos dentro das mesmas cepas ^{30, 29.}
4. Em P12, remover ratinhos a partir da câmara de oxigénio e retornar os animais ao ambiente _de O _2.

2. Injeção intravítrea para entrega de Compostos para o Inner Retina (When avaliar os efeitos de um composto farmacológico ou proteína recombinante)

1. No P14, anestesiar ratos com 2% de isoflurano em oxigênio 2 L / min (ou proteção animal aprovado pelo comitê de anestésico de escolha). A fim de verificar a eficácia da anestesia, sequencialmente beliscar a cauda, ​​pé de trás e da orelha com uma pinça.
2. Posicione o mouse sobre o ventre.
3. Usando uma seringa esterilizada de 10 mL equipado com uma agulha de vidro puxado chanfrada, realizar uma injecção de um volume máximo de 1 ml de solução contendo o composto a ser investigada ou veículo (solução salina fisiológica) no limbo posterior do olho, com um 45 ° ângulo de evitar a lente. Nota: A-agulha de vidro puxado está ligado à seringa utilizando uma gota de epoxi-resina.
4. Aplique uma gota de pomada oftálmica lubrificante (de preferência com antibiótico) com um cotonete para o olho do mouse.
5. Retorne o mouse de volta para a jaula com a promoção mãe. Ratos são, então, cuidadosamente monitorizados até recoberto e totalmente ambulatorial.

3. Avaliação da perfusão navio e função de barreira (Integridade) por Angiofluoresceinografia

1. Anestesiar ratos com isoflurano a 2% em oxigênio 2 L / min (ou proteção animal aprovado pelo comitê de anestésico de escolha). A fim de verificar a eficácia da anestesia, sequencialmente beliscar a cauda, ​​pé de trás e da orelha com uma pinça. Nota: Esta é normalmente realizada no P17 quando a regeneração é avaliada. Também levar a cabo a análise em P19 e P21 para determinar se a integridade vascular é preservada ao longo do tempo.
2. Uma vez anestesiados, pesar o mouse.
3. Faça uma incisão na linha média do abdome com uma tesoura de dissecação. Nota: Os instrumentos de dissecação devem ser regularmente verificados e afiada.
4. Cortar costelas lateralmente e levantar a caixa torácica com o auxílio de uma pinça. Nota: É necessário cortar lateralmente como possível, para evitar danos no coração.
5. Após a remoção peripHeral tecido do coração, prender a aorta descendente com pinça hemostática.
6. Lentamente injetar fluoresceína-dextrano para o ventrículo esquerdo usando uma agulha G 25. Nota: Se a função de barreira vascular é investigado, 70 kDa fluoresceína-dextrano é empregado como ele vai vazar para fora dos vasos quando a integridade dos vasos é comprometida. Se o investigador quer fundido vasos sanguíneos, 2 MDa fluoresceína-dextrano é usado. As etapas críticas: 1) Para garantir uma repartição homogênea, centrífuga fluoresceína-dextrano e injetar o sobrenadante, 2) a fim de evitar a constrição dos vasos, injetar solução de fluoresceína-dextrano aquecido, 3) O seu tempo de circulação não deve excesso de 4 min.
7. Decapitar ratos 2 min após a injeção com uma tesoura de operação.

4. Enucleação e Eye Fixation

Nota: Ao avaliar as taxas de regeneração vascular, primeiro coletar retinas no P12 e, adicionalmente, no P14 e P17. Aumentar o número de ponto de tempo amostrados para determinação mais precisa das taxas de revascularização ^24.

1. Incline a cabeça do rato e colocá-lo de lado.
2. Retire a pele e as pálpebras cobrem os olhos com uma tesoura de dissecação.
3. Coloque uma pinça curva abaixo do olho e puxe-o até que o nervo óptico é cortada.
4. Vire a cabeça do rato para seu outro lado e realizar os mesmos passos (passos 4.2 e 4.3).
5. Para garantir uma melhor penetração do fixador, perfurar um buraco na câmara anterior do olho usando 30 G agulha.
6. Transferir os olhos para um tubo contendo 4% de paraformaldeído (PFA) e fixar durante 1 hora à temperatura ambiente.
7. Remover e lavar os olhos PFA 4 vezes com uma solução de PBS gelado.

5. Dissecção da retina

1. Coloque rato olhos em uma placa de Petri contendo PBS frio e realizar dissecção das retinas sob microscópio estereoscópico.
2. Retire a gordura / tecido extra em torno do olho com micro-dissecção scissors.
3. Corte a córnea com uma tesoura micro-dissecção.
4. O uso de dois pares de pinças, minuciosamente descascar a esclera distância a partir da periferia em direcção ao nervo óptico e descartar.
5. Aperte a lente (bola esbranquiçada abaixo da córnea) com uma pinça e extraí-lo do copo olho. Utilizar um par de pinças, como um apoio, e a outra para agarrar e levantar cuidadosamente e remover a lente.
6. Separar os vasos hialóide da face interna da retina utilizando escovas pequenas (tamanho 0) e uma pinça.
7. Retirar feixes de vasos hialóide ligados ao disco óptico usando uma pinça.
8. Transferência dissecados retinas de dois tubos ml de microcentrífuga contendo PBS e colocar em gelo antes de se iniciar o processo de coloração.

6. Retinal Vascular Coloração

1. Incubar as retinas dissecados durante a noite com agitação suave a 4 ° C em uma solução de fluorescência acoplado a isolectina B4 (rodamina-lectina ou outra) em PBS contendo 1 mM de _CaCl2 (uma diluição de uma solução B4 2 mg / ml isolectina é recomendado 1:100). Durante o procedimento de coloração inteira, cobrir os tubos com folha de alumínio ou uma película opaca para proteger da luz.
2. No dia seguinte, remover a solução de corante e lavar retinas 3x em PBS durante 10 min à temperatura ambiente.

7. Preparação de retina Flatmounts

1. Retinas, do lado fotorreceptor para baixo de transferência, sobre uma lâmina de microscópio e fazer quatro incisões radiais equidistantes profundas utilizando um bisturi cirúrgico para dividir a retina em quatro quadrantes de igual tamanho. Durante as incisões, a cinta da retina, com uma escova, de modo que ele não se mova.
2. Usando duas escovas embebidas em PBS, alise cuidadosamente a quadrantes fotorreceptor side-down e mergulhe a retina em meio de montagem para evitar a foto-branqueamento. Em seguida, coloque cuidadosamente uma lamela sobre a superfície da retina montado sem a aplicação de pressão e garantir que as bolhas de ar não se acumulam sob a lamínula.

8. Imagem e Quantificação de Vasoobliteration (VO) e neovascularização (NV), como descrito anteriormente ³¹

1. Tire fotos de retinas inteiras montado com um microscópio de epi-fluorescência com uma ampliação de 10x.
2. Abra a imagem da retina em software de edição de fotos, unir e medir a área total da retina, ea área avascular. Área pode ser expressa em pixels.
3. Determinar a extensão de VO, dividindo o número de pixels na área avascular pelo número de pixels na área total da retina.
4. Determinar a extensão da NV-se dividindo o número de pixels de NV pelo número de pixels na área total da retina, tal como descrito ^31.

Resultados

O modelo OIR é amplamente utilizada para estudar a degeneração vascular induzida por oxigênio e neovascularização patológica induzida por isquemia na retina e tem sido fundamental para o desenvolvimento de tratamentos atualmente empregados anti-angiogênicos para doenças oculares ^{27, 29, 30.} Os resultados obtidos com este modelo pode ser vagamente extrapolados para retinopatias isquêmicas, como a retinopatia diabética proliferativa e retinopatia da prematuridade ^30.

Discussão

Qual é a maneira mais eficaz de estimular o crescimento de novos vasos saudáveis ​​no tecido nervoso isquêmico? É terapeuticamente válida para interferir e acelerar ocorrem naturalmente rebrota vascular? Em patologias neuro-isquêmica, como retinopatias isquêmicas ou acidente vascular cerebral, degeneração vascular está associado à redução da função neuronal ^35-38. Daí para combater lesão precoce, restabelecendo micro-circulação regional durante o segmento de imediato / precoce da doenç...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers	Vendor of choice
Operating Scissors straight	World Precision Instruments	14192
Dissecting Scissors straight	World Precision Instruments	14393
Vannas Eye Scissors	Harvard Apparatus	72-8483
Iris Forceps, curved, serrated	World Precision Instruments	15915
Brushes 362R size 0	Dynasty
Dumont Forceps #3; straight	World Precision Instruments	500338
Surgical Blade, size 10	Bard-Parker	371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Laboratories, Inc	RL-1102
Microscope slides	VWR	16004-368
Fluoromount G	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope	Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope	Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000	Sigma-Aldrich	46945