Induzida por laser Breakdown Spectroscopy: Uma Nova Abordagem para Mapeamento e Quantificação de nanopartículas em Organ Tissue

Resumo

Espectroscopia de decomposição induzida por laser realizada em órgão fina e tecido do tumor detectado com sucesso elementos naturais e gadolínio injetado artificialmente (Gd), emitidos a partir de nanopartículas à base de Gd. Imagens de elementos químicos atingiu uma resolução de 100 um e sensibilidade quantitativa sub-mM. A compatibilidade da instalação com microscopia óptica padrão enfatiza seu potencial para fornecer várias imagens de um mesmo tecido biológico.

Resumo

A espectroscopia de emissão de plasma induzido por laser foi aplicado para a análise elementar de amostras biológicas. Espectroscopia de desagregação induzida por laser (LIBS) realizada em secções finas de tecido de roedor: rins e do tumor, permite a detecção de elementos inorgânicos, tais como (i) de Na, Ca, Cu, Mg, P, e Fe, presente naturalmente no corpo e (ii) Si e D'us, detectada após a injeção de nanopartículas à base de gadolínio. Os animais foram sacrificados 1 a 24 horas após a injecção intravenosa de partículas. Um varrimento bidimensional da amostra, realizada por meio de um micrométrica 3D-platina motorizada, permitiu que o feixe de laser de infravermelho a explorar a superfície com uma resolução lateral inferior a 100 μ m. Imagens química quantitativa de elemento Gd dentro do órgão foram obtidos com sensibilidade sub-mM. LIBS oferece um método simples e robusto para estudar a distribuição de materiais inorgânicos sem qualquer labeli específicong. Além disso, a compatibilidade da instalação com microscopia óptica padrão enfatiza seu potencial para fornecer várias imagens do mesmo tecido biológico com diferentes tipos de resposta: elementares, moleculares ou celulares.

Introdução

O grande desenvolvimento de nanopartículas para aplicações biológicas incitou a melhoria paralela de técnicas analíticas para a sua quantificação e formação de imagens de amostras biológicas. Normalmente, a detecção e o mapeamento das nanopartículas em órgãos são feitos por fluorescência ou microscopia confocal. Infelizmente, estes métodos requerem a rotulagem das nanopartículas por um corante do infravermelho próximo que pode alterar a biodistribuição das nanopartículas, em especial para as nanopartículas de muito pequenas, devido às suas propriedades hidrofóbicas. A detecção de nanopartículas rotulados, e especialmente as muito pequenas nanopartículas (tamanho <10 nm), pode, assim, interferir com a sua biodistribuição em toda a escala do corpo, mas também a nível de tecidos e células. O desenvolvimento de novos dispositivos capazes de detectar nanopartículas sem qualquer rotulagem oferece novas possibilidades para o estudo do seu comportamento e cinética. Além disso, o papel de elementos vestigiais tais como ferro e cobre em doenças cérebro umd doenças neurodegenerativas, como Alzheimer ^1, Menkes ^2,3, ou Wilson ⁴ sugerem o interesse de estudar e localizar esses elementos em tecidos.

Várias técnicas têm sido utilizadas para fornecer mapeamento elementar ou microanálise de materiais diferentes. Em seu artigo de revisão publicado em 2006, R. lobinski et al. Forneceu uma visão geral das técnicas padrão disponíveis para microanálise elementar em meio biológico, um dos ambientes mais desafiadores para as ciências analíticas ^5. A microssonda de electrões, que é constituído por energia dispersiva de microanálise de raios X de um microscópio electrónico de transmissão, pode ser aplicado a numerosos estudos se a concentração do elemento é suficiente (> 100-1.000 mg / g). Para alcançar limites de detecção mais baixos, foram utilizadas as seguintes técnicas:

• microssonda feixe de íons através das partículas induzida emissão de raios X μ-PIXE (1-10 mg / g) ⁶
• synchrotron microanálise radiação μ-SXRF (0,1-1 mg / g) ⁷
• espectrometria de massa de iões secundários SIMS (0,1 ug / g) ⁸
• ablação a laser em espectrometria de massas LA-ICP-MS (até 0,01 mg / g) ^9,10

As técnicas acima mencionadas proporcionam resolução micrométrica, como mostrado na Tabela 1 extraiu-se a partir de lobinski et al.

Reconstrução 3D de investigações 2D de série também pode ser proposto para a reconstrução de tecidos mais profundos ^11. No entanto, todos os dispositivos e sistemas exigem profissionais qualificados, ambos moderados para equipamentos de alto custo e experimentos de longa duração (normalmente mais de 4 h para um mM 100 x 100 mm para μ-SXRF de 10 mm x 10 mm para LA-ICP-MS ) ^12. Em conjunto, esses requisitos tornam microanálise elementar muito restritivo e incompatível com sistemas de imagem óptica convencional,A microscopia de fluorescência ou microscopia não linear. Um outro ponto que se pode mencionar aqui é que a capacidade de medição quantitativa ainda é bastante limitada e depende da disponibilidade dos padrões laboratoriais de correspondência de matriz. Quanto mais generalização do uso de microanálise elementar em processos da indústria, geologia, biologia e outros domínios de aplicações irá gerar avanços conceituais e tecnológicos significativos.

O objectivo da presente manuscrito é propor soluções para mapeamento elementar quantitativa (ou microanálise elementar) em tecidos biológicos com uma instrumentação mesa compatível com microscopia óptica convencional. A nossa abordagem é baseada na espectroscopia de decomposição induzida por laser (tecnologia LIBS). Em LIBS, um pulso de laser é focado na amostra de interesse para criar a composição e centelha do material. A radiação emitida atómica no plasma é subsequentemente analisados ​​por um espectrómetro e os elemenTal concentração pode ser recuperada com medidas de calibração realizados previamente ^13,14. As vantagens de LIBS incluem sensibilidade (mg / g para quase todos os elementos), compacidade, preparação muito básico amostra, ausência de contato com a amostra, a resposta instantânea e precisamente localizada (micro) análise de superfície. No entanto, a aplicação da imagem química de tecido permanece um desafio uma vez que a ablação a laser dos tecidos devem ser finamente controlado para realizar mapas com uma elevada resolução espacial, juntamente com o intervalo de sensibilidade em ug / g ^15,16.

Com esta solução, a adjunção de marcadores ou agentes de rotulagem não é necessário, o que permite a detecção de elementos inorgânicos directamente no seu ambiente nativo em tecidos biológicos. O instrumento LIBS desenvolvido em nosso laboratório oferece uma resolução atual inferior a 100 mm, com uma sensibilidade estimada para Gd abaixo de 35 mg / g, o equivalente a 0,1 mM ^16, que permite queo mapeamento de grandes amostras (> 1 cm ²⁾ dentro de 30 min. Além disso, o software caseiro facilita a aquisição e exploração dos dados. Este instrumento é usado para detectar, mapear e quantificar a distribuição de tecido de gadolínio de nanopartículas à base de (Gd), ^{17 - 18,} em rins e amostras de tumor de animais de pequeno porte, de 1 a 24 horas após a injecção intravenosa das partículas (tamanho <5 nm) . Elementos inorgânicos, que são intrinsecamente contidos em um tecido biológico, tais como Fe, Ca, Na e P, foram também detectadas e gravadas.

Protocolo

1. Biológica Preparação de Amostras

Todos os experimentos descritos neste estudo foram aprovados pelo Comitê do CECCAPP (Lyon, França) (autorização # LYONSUD_2012_004) Animal Care e Use, e os experimentos foram realizados sob a supervisão de pessoas autorizadas (L. Sancey, DDPP autorização # 38 05 32).

1. Adicionar 1 ml de H ₂ O para 100 umol de nanopartículas à base de gadolínio (Gd), aguardar 15 minutos e adicionar 20 ul de HEPES 50 mM, NaCl 1,325 M, _CaCl2 20 mM para 100 ul de _H2O e 80 ul da solução primária de nanopartículas à base de Gd para obter uma solução de 200 mL em 40 mM prontos para injetar (Cidade: Villeurbanne, em laboratório).
2. Injectar a solução de nanopartículas de Gd 200 mL por via intravenosa em roedores portadores de tumor anestesiados (Cidade: Lyon Sud (Oullins), a 15 km do laboratório).
3. 1-24 horas após a injeção, sacrificar os ratos umad colocar as amostras biológicas em isopentano resfriado por nitrogênio líquido. Conservar as amostras a - 80 ° C (Cidade: Lyon Sud (Oullins), a 15 km do laboratório).
4. Corte da amostra (Cidade: geralmente Grenoble, a 100 km do laboratório, vou tentar ter um acesso em Lyon Sud) em 100 slides m de espessura e colocar os slides biológicos em pratos de plástico específicos (Petri). Armazenar a -80 ° C.
   Nota: pratos de plástico são, basicamente, uma amostra de polímero muito puro. Eles são utilizados para evitar a interferência com os elementos contidos no tecido.

2. Preparação de Amostras para Calibração

1. Prepare frascos com doses crescentes de nanopartículas à base de Gd em água (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 pM, 5 pM, 10 pM, 50 uM, 100 uM, 500 pM, 1 mM e 5 mM).
2. Coloque um pi-gota de cada solução espaçados regularmente por 3 mm em placas de Petri 5.
3. Seca à temperatura ambiente durante 20 min.

3. LIBS Experiment

1. Inicialização da Configuração LIBS
   1. Configurações de laser. Depois de ligar os instrumentos, esperar 10-20 min para pulso estabilização energia do laser e resfriamento da câmera ICCD até -20 ° C. Ajuste a energia de pulso com o atenuador.
      Nota: Os parâmetros do laser ideais para tecidos de mapeamento são 5 ns duração de pulso, 1.064 nm de comprimento de onda e energia de pulso de cerca de 4 mJ. O laser usa é um típico Nd: YAG nanossegundo.
   2. LIBS Configurações. Definir a posição do laser de focagem (em relação à superfície da amostra) para se obter o diâmetro da cratera menor (cerca de 50 um ou inferior).
      Nota: Isto corresponde a um impulso de laser de focalização 100 um abaixo da superfície da amostra.
   3. Configurações espectrômetro. Use o espectrômetro de Czerny-Turner combinado com um 1200 linhas / mm grade e uma câmera de resolução ICCD temporais alta. Controlar todos esses dispositivos por computador. Defina o valor de fenda de entrada para 40 mM. Defina a faixa espectral reGarding o elemento a ser analisado. Utilizar a faixa espectral abrangendo 325-355 nm para a detecção Gd com elevada sensibilidade, bem como Na, Ca e Cu. Defina os parâmetros ICCD com um atraso de 300 ns, um portão de 2 ms, e um ganho de 200.
2. Medição Mapping
   1. Colocar a amostra biológica em porta-amostras de LIBS motorizados.
   2. Ajuste a altura da amostra de acordo com a posição do foco do laser.
   3. Tire uma foto de alta resolução da fatia da amostra.
   4. Coloque o módulo de mapeamento do software de aquisição de LIBS para realizar um mapa com tipicamente 100 x 100 pontos de medição espaçados por uma resolução de cerca de 100 mm.
   5. Comece a aquisição. A partir deste ponto de automatizar tudo; o movimento seqüência, bem como a gravação de espectro e poupança. 40 minutos são necessários para um mapeamento de 10.000 pontos (equivalente a 1 ^cm2 por resolução de 100 um). Reagrupar todos os espectros registrados em um mesmo arquivo.
   6. Quando finished, dê uma segunda fotografia da fatia de amostra
3. Medição Calibração

Com os mesmos parâmetros experimentais, medir as amostras de calibração (para detalhes de preparação, ver secção 2). Executar um mapa ou ficha 25 espectros (obtido a partir de locais de medição na parte do centro da gota) em cada uma das gotas de calibração.

4 LIBS Análise de Espectro:. Construção de Química Images

1. Grave todos os espectros LIBS a partir do mapeamento de tecidos e carregá-los na análise de software LIBS. Subtraia a linha de base para cada espectro e construir as imagens químicas com escala de intensidade relativa usando uma cor falsa.
   Nota: Um algoritmo recupera intensidades de linhas específicas, como D'us, Cu, Na, ou Ca.
2. Realizar a mesma operação no espectro medido a partir da amostra de calibração para permitir o cálculo das curvas de calibração (relação entre a intensidade e a concentração) e de construção aqmapa quantitativas ou imagem para D'us (ou outro elemento de interesse).
3. Aplicar os tratamentos adequados para as imagens de produtos químicos, tais como a interpolação ou de alisamento. Salve os mapas de intensidade ou concentração em formato de imagem (bitmap).

Resultados

Como mostrado na Figura 1, o feixe de um laser Nd: YAG do comprimento de onda fundamental de 1,064 nm foi focado verticalmente para baixo sobre a fatia de tecido através de uma lente de quartzo de 50 mm de distância focal. A energia de pulso foi de 4 mJ e taxa de repetição de 10 Hz. A fim de evitar a geração de plasma no ar, o feixe de laser foi centrada em torno de 100 mm abaixo da superfície da amostra. No plasma do ar foi observada nesta condição. Durante as experiências, a amostra foi movi...

Discussão

Aplicado a amostra biológica, a técnica permite a imagem química, isto é, o mapeamento e quantificação, de Gd e Si a partir de nanopartículas à base de Gd injectados em diferentes órgãos. A partir das configurações principais críticos, o controlo das propriedades de laser (comprimento de onda, a energia do pulso, centradas, e de estabilidade) é crítico para uma ablação de tecido preciso e fino (ou seja, uma resolução de mapeamento), bem como para a sensibilidade. Trabalhando em alta ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser nanosecond Nd:YAG	Quantel	Brillant	5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm
Spectrometer	Andor Technology	Shamrock 303	with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating
Detector ICCD	Andor Technology	Istar	2 nsec temporal resolution
LIBS Unit	ILM		Homemade Instrumentation
Gd-based nanoparticles	Nano-H		particles
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	for particle's dilution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21108	for particle's dilution
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	for particle's dilution
Mice	Charles River	depending of animal breeding
Isoflurane	Coveto / Virbac		for anaesthesia - Isofluranum
Isopentane	Sigma-Aldrich	59060	to froze the sample  slowly
Liquid nitrogen	Air Liquide		to cool down the isopentane
Cryostat	Leica	CM-3050S	to slide the samples
Petri dishes	Dutscher	353004	to stick the sample