Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos para Análise de Expressão Gênica

Resumo

Tecidos de Drosophila contêm muitas vezes uma mistura heterogénea de tipos celulares. Para examinar a expressão de genes em tipos específicos de células a partir de um tecido em particular, os núcleos podem ser geneticamente marcado e, subsequentemente, isolado usando uma abordagem baseada em afinidade. Isolado núcleos pode ser utilizado para aplicações a jusante, tais como a análise de expressão génica e imunoprecipitação da cromatina.

Resumo

Tecidos embrionários e de larvas de Drosophila melanogaster, muitas vezes contêm uma mistura altamente heterogénea de tipos de células, o que pode complicar a análise da expressão dos genes nestes tecidos. Assim, para analisar os perfis de expressão de genes específicos de células a partir de tecidos de Drosophila, pode ser necessário isolar os tipos de células específicas, com elevada pureza e em rendimentos suficientes para aplicações a jusante, tais como o perfil de transcrição e imunoprecipitação da cromatina. No entanto, a morfologia celular irregular em tecidos, tais como o sistema nervoso central, juntamente com a população rara de tipos específicos de células nestes tecidos, pode apresentar desafios para os métodos tradicionais de isolamento de células, tais como por microdissecção laser e células activadas por fluorescência (FACS) . Aqui, uma abordagem alternativa para caracterizar os perfis de expressão de genes específicos de células usando o isolamento com base em afinidade de núcleos marcados, em vez de células intactas, está descrito. Núcleos do c específicoell tipo de interesse são geneticamente marcado com um marcador EGFP localizada envelope nuclear utilizando o sistema de expressão binário Gal4/UAS. Estes núcleos marcaram-EGFP pode ser isolado utilizando anticorpos contra GFP que são acoplados a esferas magnéticas. A abordagem descrita neste protocolo permite o isolamento de núcleos coerente de tipos de células específicas no sistema central nervoso larvas de Drosophila em elevado grau de pureza e em quantidades suficientes para análise de expressão, mesmo quando estes tipos de células compreendem menos de 2% da população total de células na tecido. Esta abordagem pode ser usada para isolar os núcleos a partir de uma ampla variedade de Drosophila embrionárias e tipos de células de larvas usando condutores Gal4 específicas, e podem ser úteis para o isolamento de núcleos a partir dos tipos de células que não são adequados para FACS ou microdissecção a laser.

Introdução

Tecidos de Drosophila, tais como o sistema nervoso central contém uma mistura complexa de tipos de células. Assim, para analisar os perfis de expressão de genes específicos de células a partir de tecidos de Drosophila, que é necessário em primeiro lugar isolar uma população homogénea de células específicas em quantidades suficientes para permitir aplicações a jusante. Os métodos para isolar as células de tecidos intactos incluem microdissecção a laser, e de células activadas por fluorescência (FACS) de células inteiras. Enquanto FACS tem sido usado para isolar as células e os núcleos a partir de embriões de Drosophila e de Caenorhabditis elegans para a expressão do gene e cromatina de perfis ^1-3, FACS e microdissecção laser pode ser difícil de realizar com sucesso em tecidos que contêm tipos de células altamente misturados entre si ou que contêm células com morfologia irregular, tais como os neurónios. Para ultrapassar esta dificuldade, os núcleos, em vez de células podem ser isoladas a partir de tipos de células específicos e utilizado para subsequente gene perfil de expressão. Importante, com base em análise de expressão de mRNA microarray utilizando amostras de RNA nucleares apresenta resultados geralmente comparável à realizada utilizando RNA total ^{4, 5.} Além disso, a análise da expressão de genes usando o RNA nuclear tem sido usado com êxito para estudar a expressão de genes em vários organismos, incluindo C. elegans, Arabidopsis thaliana, de Drosophila, e seres humanos ^{4, 5 2, 3.}

Várias abordagens têm sido recentemente descrita para o isolamento de populações específicas de núcleos marcados a partir de tecidos de Drosophila que são adequados para análise da expressão do gene e / ou da cromatina imunoprecipitação. O isolamento lote de cromatina tecido-específicas para o método de imunoprecipitação (bits-chip) utiliza FACS para isolar núcleos fixos com base na expressão de tipo específico de célula de energia nuclear localizada GFP ^2. Esta abordagem tem sido successfully utilizado para analisar a distribuição de modificações de histonas e factores de transcrição, utilizando a imunoprecipitação da cromatina de núcleos isolados a partir da mesoderme de embriões de Drosophila ^2. No entanto, as abordagens baseadas em FACS pode ser menos adequado para o isolamento de núcleos marcados que constituem apenas uma pequena proporção de uma população mista, devido ao aumento do tempo de classificação necessária para obter números adequados para aplicações a jusante. Para superar estas limitações, vários grupos têm utilizado técnicas de isolamento à base de afinidade para purificar os núcleos, que são marcadas com um epitopo específico de um tipo de célula particular. O isolamento dos núcleos marcados em tipos específicos de células de método (intacto) desenvolvidos para uso em Arabidopsis thaliana, ^{6, 7,} foi recentemente adaptado para uso em Drosophila ^8. Neste método, uma proteína de fusão de envelope nuclear que é um substrato para in vivo biotinilação é coexpressed com a Escherichia coli biotina ligase BirA em tipos específicos de células. Núcleos marcados com biotina podem ser, posteriormente, purificado a partir de populações mistas, utilizando a afinidade de isolamento à base de estreptavidina. Utilizando esta abordagem, os núcleos foram rotulados com sucesso e isolado a partir da mesoderme de embriões de Drosophila, em que uma proteína de fusão de envelope nuclear foi expresso sob o controlo de um potenciador específico para mesoderme ^8. Os autores também geradas proteínas de fusão de envelope nucleares que podem ser expressas em qualquer tipo de células sob o controlo da sequência reguladora GAL4 UAS ^9. Esta abordagem é capaz de isolar rapidamente subconjuntos de núcleos marcados a partir de populações mistas, mas requer três construções transgénicas separadas e podem, portanto, ser inadequada para aplicações genéticas particulares. Recentemente, uma aproximação tem sido descrita na qual SOL (S AD1 e C-84 da ONU) proteínas contendo o domínio que se localizam na membrana interior do envelope nuclear foram etiquetados comas proteínas fluorescentes e expresso sob o controlo do sistema Gal4/UAS ^10. Os núcleos foram isolados na presença de detergente não iónico para remover a membrana externa do envelope nuclear, e de afinidade-purificada utilizando esferas magnéticas acopladas a anticorpos anti-GFP. Esta abordagem foi usada com sucesso para isolar pequenas populações de núcleos marcados de subtipos neuronais específicas no cérebro adulto de Drosophila ^10.

Aqui, um protocolo para o isolamento de núcleos marcados a partir de uma população mista de células a partir de tecido de larvas de Drosophila é descrito. Este método foi desenvolvido de forma independente, mas é semelhante ao método descrito por Henry et al. ¹⁰ Em primeiro lugar, os núcleos foram marcadas com um marcador fluorescente que é expresso apenas em tipos de células específicos em Drosophila melanogaster para facilitar o subsequente isolamento de núcleos marcados a partir de populações mistas usando uma abordagem baseada em afinidade. Para identificar os núcleos,foi utilizado o domínio KASH (K larsicht / D nc-1 / S ino h omology). O domínio KASH é um domínio de transmembrana que se localiza na membrana externa do envelope nuclear, em parte através de interacções com proteínas contendo o domínio SUN dentro do espaço perinuclear ^11. O domínio KASH C-terminal de proteínas, tais como as de Drosophila MSP-300 e Klarsicht ancora estas proteínas para a membrana nuclear externa, ao passo que os seus domínios N-terminais interagir com proteínas do citoesqueleto tais como actina ou microtúbulos no citoplasma ^12-14. As construções foram geradas em que o domínio de Drosophila KASH MSP-300 foi fundido com o terminal C de EGFP, sob o controlo da sequência reguladora GAL4 UAS no vector pUAST ^{attB-15, 16.} Usando a integração específica de sítio phiC31, moscas transgénicas foram geradas em que os UAS-EGFP :: MSP-300 ^KASH transgene foi inserido no locus no cromossoma attP23L ^17. A UAS-EGFP :: MSP-300 ^KASH moscas podem ser cruzadas com moscas que expressam Gal4 o condutor em um tipo particular de células, o que resulta na expressão do alvo de EGFP na membrana nuclear externa no tipo celular de interesse. Núcleos marcados podem então ser purificados a partir de populações de células misturadas, utilizando anticorpos contra GFP acoplados a esferas magnéticas. Nesta abordagem, não é necessária a utilização de detergente não iónico, porque a etiqueta de EGFP está localizada ao lado citoplasmático da membrana nuclear externa, e é, portanto, acessível aos anticorpos.

O protocolo abaixo descrito pode ser utilizado para isolar / enriquecer núcleos marcados com EGFP de tipos específicos de células de Drosophila em tecidos larvais, para quantificar a pureza e o rendimento de núcleos isolados, e para extrair o RNA nuclear apropriado para a transcrição reversa-reacção da polimerase em cadeia quantitativa (qRT -PCR), a análise da expressão do gene. O isolamento e purificação de afinidade-núcleos (excluindo tissue dissecção) pode ser realizada em menos de uma hora. Os resultados são apresentados mostrando que os núcleos da glia podem ser isolados com sucesso a partir do lóbulo óptica das larvas e do olho do disco imaginal, e usado para posterior análise da expressão do gene. Prevê-se que esta abordagem seja útil para o isolamento / enriquecimento de núcleos marcados a partir de tecidos embrionários e de larvas, em que as células alvo constituem menos de 5% da população geral. Todas as ações de Drosophila e plasmídeos gerados por este estudo estão disponíveis a partir dos autores, mediante solicitação.

Protocolo

1. Geração e Caracterização de EGFP :: KASH Drosophila

1. Cruz Gal4 motorista voa para UAS-EGFP :: MSP-300 ^KASH voa. Alternativamente, moscas recombinantes que transportam tanto o condutor de Gal4 e do transgene UAS-EGFP :: MSP-300 ^KASH pode ser gerada utilizando técnicas genéticas convencionais. Esta segunda abordagem é vantajoso se forem necessárias grandes quantidades de progenitura.
2. Caracterizar a expressão do marcador EGFP :: KASH usando técnicas de microscopia padrão. Nota: expressão EGFP pode ser observada por técnicas de microscopia de padrão em dissecadas, fixas tecidos de Drosophila, ou em conjunto larvas, e não requer a utilização de um anticorpo.
   1. Determinar o padrão de expressão de EGFP :: KASH marcador em todo o organismo sob um microscópio de fluorescência de dissecação (ver Materiais PDF). Nota: Muitos controladores de Gal4, incluindo o controlador de repo-GAL4 mostrado na Figura 1, n exibemonspecific padrões de expressão em outros tecidos, tais como larvas da glândula salivar (ver Resultados).
   2. Analisar o padrão de expressão de EGFP :: KASH no tecido dissecado de interesse através de microscopia confocal.
      1. Fixar o tecido de interesse, utilizando formaldeído numa concentração final de 4%, e ADN de mancha utilizando DAPI, a uma concentração final de 0,1 ug / ml para visualizar a localização da EGFP :: KASH marcação em relação ao ADN.
      2. Aquisição de imagens utilizando uma objectiva de 40x / 1,30 óleo de imersão ou uma objectiva 20X / 0,75 imersão de óleo, dependendo do tamanho do tecido de interesse. As seguintes condições de excitação / emissão podem ser utilizados para a aquisição de imagens: 408 nm/425-475 nm (DAPI), 488 nm / 525-550 nm (GFP).

2. Isolar Núcleos de Drosophila larval Tecidos

1. Preparar equipamentos para a dissecção dos tecidos larval e posterior isolamento núcleos. Note-se quedechorionated embriões inteiros também pode ser utilizado como material de partida, se desejado. Recomenda-se utilizar tecidos de larvas parcialmente dissecados em vez de larvas inteira, se o tipo de células de interesse está presente em um tecido específico, tal como o disco imaginal. Isto reduz a ligação não específica, e também elimina os problemas que podem ser causados ​​pela expressão de alguns condutores Gal4 em células não alvo.
   1. Preparar dois pares de pinças cortantes (ver Materiais PDF), um 9-siliconizada bem placa de vidro (ver Materiais PDF) e PBT (1x PBS, pH 7,4, 0,1% de Tween-20).
   2. Prebind o anticorpo GFP às pérolas magnéticas. Esta etapa deve ser iniciada antes do início da dissecção. Adicionar 10 uL de pérolas magnéticas (Invitrogen, ver Materiais PDF) e 2 ug de anticorpo GFP (Roche, ver Materiais PDF) para 400 ul de tampão de lavagem (1x PBS, pH 7,4, 2,5 mM de MgCl ₂₎ em um tubo de 1,5 ml . A quantidade de pérolas e o anticorpo utilizado pode ser optimizada se necessário, com base na quantidade de alvo na samplo e a afinidade de ligação do anticorpo às pérolas.
   3. Incubar as pérolas e o anticorpo com rotação durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente,.
   4. Colocar o tubo de 1,5 ml contendo as contas e do anticorpo no suporte magnético (ver Materiais PDF) e permitem que as esferas se liguem ao magnética para aproximadamente 1-2 min. Retirar o sobrenadante contendo o anticorpo não ligado e tampão de lavagem, utilizando uma pipeta de 1 ml. Os grânulos permanecerá ligada à parede do tubo de 1,5 ml, no lado adjacente ao íman.
   5. Lave as contas duas vezes com 1 ml de tampão de lavagem de cada vez, conforme descrito no ponto 2.1.4. Remover o tubo de 1,5 ml a partir da cremalheira magnética e inverter momentaneamente para misturar os grânulos e tampão de lavagem, durante cada etapa de lavagem.
   6. Guarde as contas ligadas a anticorpos em tampão de lavagem até que esteja pronto para continuar com o passo 2.7. As contas não devem ser autorizados a secar em qualquer fase do protocolo.
2. Dissecar tecidos larvais em PBT e transferir tecidos dissecados paraum poço da 9-bem prato. Normalmente, a dissecção do lobo óptico e olho disco imaginal de 100 larvas de terceiro instar fornece material suficiente para a análise de expressão gênica a jusante após isolamento núcleos.
3. Lavar o tecido isolado em tampão de extracção nuclear (10 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 2,5 mM de MgCl _2, 10 mM de KCl) em um tubo de 1,5 ml. Transferir tecidos larvais isoladas para um homogeneizador Dounce de 1 ml (ver Materiais PDF) em gelo que contém 1 ml de tampão de extracção nuclear fresco. Incubar no gelo por 5 min. Não é necessário adicionar os inibidores de protease, se o RNA é para ser extraída a seguir ao isolamento de núcleos.
4. Perturbar o tecido por 20 ciclos com o pilão solta e depois incubar a amostra em gelo durante 10 minutos para permitir que as células inchar. Extrair os núcleos das células, utilizando 15 pancadas com o pil apertado. O número de golpes com os pilões soltos e apertados precisa ser otimizado para diferentes tecidos e tipos de células; excesso de homogeneização pode resultar emnúcleos cortados, enquanto homogeneização insuficiente não irá extrair todos os núcleos do tecido.
5. Filtrar o homogeneizado, que contém os restos nucleares e celulares, por meio de um 40 um tamanho de poros de filtro (ver Materiais PDF) que foi prerinsed com tampão de homogeneização nuclear. Recolhe-se o homogeneizado filtrado num tubo fresco.
6. Coletar amostras de pré-isolamento para posterior análise para determinação do rendimento de núcleos, a integridade núcleos, e para determinar os níveis de transcrição de genes-alvo antes de núcleos isolados.
   1. Transferência de 50 ul do homogenato filtrado para um tubo de 1,5 ml fresco utilizando uma pipeta. Esta é a amostra de pré-isolamento. Adicionar 500 mL de reagente Trizol (ver Materiais PDF, CUIDADO), invertido para misturar e armazenar a -20 ° C para posterior isolamento do RNA (passo 3.1).
   2. Transferir 20 uL de homogeneizado do filtrado para um novo tubo de 1,5 ml.
      1. Adicionar DAPI para uma concentração final de 0,1 ug / ml, e incUbate amostra em gelo durante 10 min.
      2. Transferir núcleos DAPI-manchadas de uma lamela revestido poli-lisina, e coloque sobre uma lâmina de microscópio. Selar a lamela usando claro unha polonês.
      3. Verifique a integridade núcleos, e presença de núcleos GFP de interesse que usam o microscópio fluorescente. Nota: Não é necessário fixar os núcleos, ou para manchar para GFP se esses slides são analisadas razoavelmente rápido após a preparação (dentro de 24 horas).
   3. Transferência de 10 ul do homogenato filtrado para um novo tubo de 1,5 mL e adicionar 90 ul de tampão de lavagem (1x PBS, pH 7,4, 2,5 mM de _MgCl2). Adicionar DAPI para uma concentração final de 0,1 ug / ml, e incubar em gelo durante 10 min. Determine o rendimento núcleos na amostra pré-isolamento usando um hemocitômetro para contar os núcleos DAPI-positivos usando epifluorescência sob um objetivo ar 10X.
7. Colocar o tubo de 1,5 ml contendo as contas de anticorpo ligado (preparado na secção 2.1.6) num rack magnético,e permitir que as pérolas magnéticas de se ligar ao íman, pelo menos, 2 minutos, conforme descrito na secção 2.1.4. Remover o tampão de lavagem das pérolas com o anticorpo ligado, usando uma pipeta de 1 ml, e adiciona-se o homogeneizado filtrado do passo 2.5 para o tubo de 1,5 ml usando uma pipeta de 1 ml.
8. Inverter o tubo várias vezes para misturar e incubar a 4 ° C durante 30 min com extremidade-sobre-extremidade agitação. Evitar bolhas no tubo, se possível, uma vez que estas podem resultar na aglomeração dos núcleos.
9. Colocar o tubo de 1,5 ml contendo as contas e homogeneizado ligados a anticorpos em uma cremalheira magnética, e permitem que as esferas magnéticas para se ligar ao íman, pelo menos, 2 minutos, conforme descrito na secção 2.1.4. Remover o homogenato contendo a fracção de núcleos não ligada, utilizando uma pipeta de 1 ml.
10. Lava-se a amostra 3x com 1 ml de tampão de lavagem de cada vez. Remover o tubo de 1,5 ml contendo as contas de vidro, núcleos ligados e tampão de lavagem a partir da prateleira e inverter a mistura várias vezes, em seguida, colocar o tubo na cremalheira magnético como descritono passo 2.9 e remover o sobrenadante utilizando uma pipeta de 1 ml.
11. Adicionar 150 ul de tampão de lavagem para os grânulos, os quais devem ser ligados aos núcleos de alvo. Esta é a amostra de pós-isolamento. Preparar amostras para análise de microscopia e extração de RNA subseqüente.
    1. Transferir 20 uL da amostra de pós-isolamento de um novo tubo de 1,5 ml e mancha com DAPI e analisar tal como descrito na secção 2.6.2. Contar o GFP + / + e DAPI GFP-/DAPI + núcleos capturados por esferas magnéticas para determinar a pureza da GFP enriquecido + núcleos na amostra de pós-isolamento.
    2. Adicionar 1 ml de reagente Trizol para o restante da amostra de pós-isolamento, inverter para misturar e armazenar a -20 ° C para subsequente isolamento de ARN (passo 3.1). Nota: As amostras em Trizol pode ser armazenada durante várias semanas, caso seja necessário a -20 ° C. Não é necessário para eluir os núcleos dos grânulos magnéticos antes da extracção de ARN usando o reagente Trizol, because os grânulos não interferir com o subsequente isolamento do RNA.

3. Determinar níveis de transcrição em núcleos isolados de tecidos larval

1. Isolar RNA a partir das pré-isolamento e de pós-isolamento amostras preparadas nas seções 2.6.1 e 2.11.2 usando o protocolo padrão descrito para a extração de RNA baseado em Trizol (ver Materiais PDF) com as seguintes modificações:
   1. A seguir à precipitação do sedimento de ARN, adicionar 19,2 mL de água sem RNase e 0,8 ul de reagente RNASecure (ver Materiais PDF) para o sedimento e incubar a 60 ° C durante 20 min para inactivar ARNases.
2. Determinar a concentração de RNA com um corante fluorescente de ligação-ARN, tais como o kit de ensaio de RNA Qubit (ver Materiais PDF) utilizando o 2,0 Fluorometer QubitR seguindo o protocolo do fabricante.
3. Sintetizar ADNc, utilizando uma ampliação de transcriptase reversa, tais como a EpiScript kit da transcriptase reversa e iniciadores oligodT seguindo as instruções do fabricante. Nota: normalmente, de 50 a 100 ng de RNA gera ADNc suficiente para realizar a expressão de genes múltiplos análises. Quantidades equivalentes de pré-isolamento e RNA pós-isolamento deve ser utilizada para gerar ADNc.
4. Adicionar 180 mL de água isenta de nuclease para o cDNA de amostra de 20 ul para diluir este antes da análise em tempo real de 10 vezes por PCR quantitativa (qPCR). Esta diluição é um passo importante, porque as amostras não diluídas de cDNA pode inibir a qPCR.
5. Prepara-se uma mistura principal qPCR com polimerase e dNTPs, 4 pmoles de cada um de iniciador directo e inverso, fez-se com água esterilizada, para o volume de reacção final de 20 ul.
   1. Projete primers qPCR para atingir genes que são esperados para ser expressa no tipo celular de interesse, e no estágio de desenvolvimento em que o tecido é coletada. Conceber iniciadores para abrangem um intrão, se possível, de modo que genómico eprodutos de PCR de cDNA podem ser distinguidos. Nota: Se o perfil do tipo de célula alvo a expressão do gene não é conhecida, os iniciadores contra eGFP, que deve ser expresso especificamente na população de núcleos com etiquetas, pode ser utilizado para optimizar o protocolo para um tipo particular de células e tecidos (Tabela 1).
6. Determinar os níveis relativos de transcritos de cada gene de interesse em amostras pré-e pós-isolamento de isolamento por comparação com uma série de diluição de cDNA preparado a partir de todo o tecido. Níveis de transcrição de genes-alvo deve ser normalizada a um gene de referência, tais como Rpl32 (ou, de preferência vários genes de referência).

Resultados

O controlador de repo-GAL4 (Bloomington número de stock 7415) é expresso especificamente nas células da glia do sistema nervoso Drosophila em vários estágios de desenvolvimento ^18. As moscas foram geradas que estavelmente expressam UEA-EGFP :: MSP-300 ^KASH sob o controlo do controlador de repo-GAL4 utilizando técnicas genéticas convencionais. Para caracterizar o padrão de expressão da EGFP :: KASH transgene nestes moscas, o padrão de expressão da GFP n...

Discussão

Este protocolo pode ser utilizado para isolar ou enriquecer especificamente altamente núcleos marcados a partir de populações de células mistas na Drosophila embrionárias ou tecidos larvais. Usando este protocolo, os núcleos podem ser isoladas a partir de tecidos dissecados em aproximadamente 1 hora. A pureza e o rendimento dos núcleos isolados devem ser determinadas experimentalmente para cada tipo de célula. Pode ser difícil de quantificar os núcleos de talão ligado a na fase de pós-isolamento do ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	mAB24B10
Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)	Roche	11814460001	This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.
2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX	MidSci	BEQPCR-R
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)	Biotium	40011
Dounce Homogenizer (1 ml)	VWR	62400-595
Dumont #5 Tweezers, 11 cm	World Precision Instruments	14095
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Invitrogen	10003D	This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.
EpiScript Reverse Transcriptase	Epicentre	ERT12910K	http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Falcon cell strainers, 40 μm pore size	VWR	21008-949	Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.
Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)	Millipore	LSKMAGS08
Mini tube rotator	Genemate	H-6700
Qubit starter kit	Life Technologies	Q32871	Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
RNAsecure (Ambion)	Life Technologies	AM7010	The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.
RT-PCR machine Thermal Cycler	BioRad	CFX Connect Thermal Cycler
Siliconized 9-well glass plate	Hampton Research	HR3-134
Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440-460 nm) excitation + yellow barrier	Nightsea		This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)
StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand	Nikon	SMZ 745
Thermal Cycler	BioRad	T100
Trizol reagent	Life Technologies	15596018	CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20	Amresco	0777-1L