Método in vitro para observar interações E-selectina mediadas entre próstata células tumorais circulantes derivadas de pacientes e células endoteliais humanas

Resumo

O nosso relatório descreve um método único para visualizar e analisar as interações CTC / CE no câncer de próstata em condições de fluxo fisiológicos.

Resumo

A metástase é um processo em que as células tumorais derramado a partir do tumor primário intravasate vascular arterial e do sistema linfático, assim, ganhar acesso ao extravasamento e formar um nicho secundário. A extravasão de células de tumor a partir do sistema vascular de sangue podem ser estudados utilizando células endoteliais (ECs) e as células tumorais obtidas a partir de diferentes linhas celulares. Os estudos iniciais foram realizados usando condições estáticas, mas tem sido bem documentado que os CEs se comportar de forma diferente sob condições de fluxo fisiológico. Portanto, diferentes conjuntos de câmara de fluxo estão sendo usados ​​para estudar as interações de células de câncer com ECs. Montagens atuais câmara de fluxo oferecem resultados reproduzíveis, seja através de diferentes linhagens celulares ou fluidos em diferentes condições de estresse de cisalhamento. No entanto, para observar e estudar as interações com células raras, tais como células tumorais (CTCs) circulando, algumas alterações são necessárias a serem feitas para a montagem de câmara de fluxo convencional. CTCssão uma população de células raras entre os milhões de células sanguíneas. Por conseguinte, é difícil a obtenção de uma população pura do CTC. Contaminação de CTCs com diferentes tipos de células normalmente encontradas na circulação é inevitável o uso presente enriquecimento ou técnicas de depleção. No presente relatório, nós descrevemos um método único para rótulo circulando células cancerosas da próstata fluorescente e estudar as suas interacções com os ECs em um sistema de câmara de fluxo auto-montados. Esta técnica pode ser aplicada ainda para observar as interações entre CTCs próstata e qualquer proteína de interesse.

Introdução

A metástase é um processo multi-passo complexo que permanece pouco compreendido. O eixo ligando E-selectin/selectin tem mostrado desempenhar um papel importante na metástase de tumores através da promoção de interacções adesivas primárias entre o endotélio vascular e nas células cancerosas ^1,2. Endotelial (E)-selectina é uma proteína transmembranar expressa por células endoteliais activadas, enquanto ligando diferente (s) de E-selectina é expressa por células de tumor ^3. Numerosas abordagens in vitro têm sido utilizados com sucesso para modelar as interacções ligando E-selectin/selectin entre células tumorais e células endoteliais (ECs) ^1. Para estudar essas interações, diferentes sistemas de câmara de fluxo estão sendo empregados para simular sistema vascular sanguíneo. Entre os conjuntos de câmara de fluxo, o fluxo de placas paralelas câmara (PPFC) em conjunto com ECs é rotineiramente utilizado como um modelo in vitro simulando em condições de estresse de cisalhamento in vivo. Nestemétodo, ECs são cultivadas numa placa de 35 mm e depois de atingir uma monocamada, ECs estão ligados ao PPFC e experiências baseadas tensão de cisalhamento são executados.

No entanto, PPFC e outros sistemas actuais apresentam muitas limitações para estudar as interacções adesivas entre as células tumorais (CTCs) derivadas de doentes e CEs, circula principalmente, porque CTC são uma população rara de células, verter a partir do tumor primário, que circula entre os milhões de células sanguíneas (1 CTC 10 ⁹ por células do sangue) ^4. Assim, ao contrário de oferta ilimitada de linhas de células cultivadas, baixa contagem CTC levar para muito poucos e raros interações CTC / CE, requerendo a largura do canal fluxo adequado para gravar as interações para análise de reprodução. Além disso, uma vez que pacientes CTC derivados são uma população impuro, portanto, um marcador de identificação é necessária para controlar CTC em específico. Para resolver este problema, foi desenvolvido um novo método para identificar o câncer de próstata (CaP) CTCs tirando partido do facto de que praticamente todos estes CTC expressam antigénio de membrana específico da próstata (PSMA) na sua superfície celular ^5,6. Neste relatório, foi utilizada a linha de células de câncer de próstata, MDA PCa2b (MDA), para demonstrar a utilidade potencial do nosso novo sistema para estudar as interações de próstata CTC com ECs, eventualmente, para entender o mecanismo de metástases.

Nossa metodologia pode ser aplicada para vários experimentos de corte com base em simulação de sistema vivo vascular ^7-9. Além de examinar as interações PCa CTC / CE, o atual sistema de câmara de fluxo pode ser facilmente adaptado para a análise de células mononucleares do sangue periférico ou células tumorais interações 'com ECs. A facilidade de desmontagem e remontagem da câmara de fluxo, um MicroSlide III ^(0,1) (doravante referida como MicroSlide), permite a cultura ECs sob perfusão e estimulando ECs com diferentes citocinas para induzir protein expressão. Além disso, em cultura células endoteliais, as proteínas recombinantes, tais como a L-e P-selectina podem ser revestidos na microlâmina e interacções com as células tumorais podem ser observados sob condições de escoamento laminar ^10.

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Protocolo

1. Cultivar HUVECs em Microslides para Interações Observing CTC-endoteliais

1. Sob a capa de cultura de tecidos, primeiro lave o MicroSlide, a largura do canal de 1 mm com PBS. Suavemente revestimento a microlâmina com 200 mL de 50 ug / ml de fibronectina (dissolvida em PBS) utilizando uma seringa de 1 ml de bloqueio Luer.
2. Cobrir a microlâmina com a tampa e mantê-lo dentro do capuz de cultura de tecidos durante 30 min. Distribuição lenta do líquido na microlâmina impede a formação de bolhas no canal.
3. Perfundir 200 mL de água morna (37 ° C) HUVEC meio de crescimento (meio M199, 1M de HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml de heparina, factor de crescimento de célula endotelial de 100 ug / ml, e L-glutamina) através da microlâmina e incubar 20 min à TA. Durante a perfusão, preparar a suspensão de células HUVEC.
4. Lavar HUVECs com PBS e adicionar 0,05% de tripsina-EDTA durante 1-2 minutos à temperatura ambiente. Centrífuga HUVECs em 2 ml de meio de crescimento a 180 xg durante 5 min.
5. Medir a concentração de células utilizando um Neubahemocitômetro uer e preparar 10 ⁷ HUVEC células/100 mL meio de crescimento. Em seguida, remover cuidadosamente o meio a partir da entrada da microlâmina com uma pipeta de ponta de 200 ul.
6. Trazer o MicroSlide ao nível dos olhos e usando a 1 ml seringa Luer-lock, perfuse gentilmente 200 mL de concentração preparado de HUVECs para o canal. É necessário ter cuidado nesta etapa para evitar a formação de bolhas. Se as bolhas aparecem, manter perfusão por um tempo maior até que as bolhas entrar no canal de saída.
7. Colocar um volume igual (~ 80 ul) de meios de HUVEC em tanto à entrada e à saída da microlâmina. Isto evita que o fluxo de células em ambas as direcções.
8. Cobrir o corrediça e mantê-lo na incubadora (37 ° C) durante 1,5 horas.

2. Preparação de montagem de câmara de fluxo para Overnight Cultura HUVEC em um MicroSlide

1. Coloque uma seringa estéril de 20 ml, conectores Luer femininos e masculinos, tubulação, e uma bomba de seringa na incubadora por 15 min.
2. Para um volume morto mínimo, utilizar o tubo com diâmetro interno de 0,04 polegadas. Diâmetro da tubulação menor evita a formação de bolhas.
3. Encher a seringa de 20 ml com água morna (37 ° C) meios de HUVEC (12 ml). Conecte o tubo com os conectores na seringa. Retirar as bolhas. Conecte este conjunto à MicroSlide.
4. Terminado o preenchimento da entrada da MicroSlide com a mídia HUVEC. Traga a seringa cheia de 20 ml ligado ao conector do lado da microlâmina. Delicadamente, anexar o conector ao MicroSlide.
5. Traga o set-up para a incubadora e conecte-o a bomba de seringa, fixada em 10 taxa de cisalhamento mL / min. Deixar as células S / N na incubadora a 37 ° C.
6. No dia seguinte, desmontar o conjunto--se através da remoção do conector ligado à entrada da microlâmina.
7. Para regular a expressão de E-selectina em células endoteliais, preparar o meio de crescimento fresco contendo IL-1β a 10 ng / ml em 4 ml de meio. Aspirar a mídia em uma seringa de 10 ml. Remover tque media a partir da entrada da microlâmina e ligar a seringa para a corrediça.
8. Definir a bomba de seringa a 10 velocidade de corte ul / min durante 4 horas na incubadora.

3. Preparação de Anti-PSMA (J591-488) marcada células cancerosas da próstata

1. Durante IL-1β incubação de HUVECs, preparar anti-PSMA J591-Alexa488 rotulado células APC. Adicionar 0,05% de tripsina-EDTA para células MDA durante 1 min. Não expor as células a tripsina para tempos mais longos, uma vez que pode afectar os glicopéptidos presente na superfície da célula. Reagente de dissociação de células livres de enzima também pode ser usado em vez de tripsina. Centrifugar a 200 xg durante 5 min.
2. Ressuspender MDA sedimento celular em 1 ml de H / H tampão (Hanks sal equilibrada solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM _CaCl2). Adicionar anticorpo anti-PSMA J591-Alexa488 a 20 ug / ml durante 30 minutos à temperatura ambiente num local escuro. Ressuspender as células durante a incubação.
3. Depois de 30 minutos, centrifugar a solução de células a 800 xg durante 5 min. Aspitaxa e ressuspender o pellet em 1 ml de tampão de H / H. Contar as células MDA rotulados e trazer a concentração final de 1x10 ⁶ células / ml. Encha uma seringa de 5 ml com J591-488 células MDA rotulados e remover as bolhas.

4. Preparação de Anti-PSMA (J591-488) marcada CTCs Enriched de CaP pacientes

1. Recolha de 7,5 ml de sangue de pacientes com cancro da próstata num tubo de tampa azul (contendo citrato de sódio). Suavemente diluir 1:01 sangue em 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS.
2. Adicionar 5,3 ml de Ficoll-Paque em mais de um tubo cónico de 50 ml. Camada diluído sangue no topo do Ficoll-Paque. Centrifugar a 400 xg durante 30 min.
3. Pré-revestimento de todos os tubos e pontas entram em contacto com os CTC com 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM de CaCl _2/4 mM de _MgCl2 (tampão de R / S) para evitar a ligação não específica do CTC para as superfícies. Manter 4 ° C Temperatura de mídia e buffers em contacto com CTCs.
4. Recolha de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) fracçãocontendo CTC a partir da interface de outro tubo cónico de 50 ml contendo 30 ml de tampão de I / S. Centrifugar a 400 xg durante 8 minutos.
5. Ressuspender o sedimento e lavar novamente em tampão de R / S a 400 xg durante 8 minutos. Após a centrifugação, ressuspender o sedimento em tampão H / H. Adicionar anti-PSMA J591-488 de anticorpo a 20 ug / ml durante 30 minutos à temperatura ambiente num local escuro.
6. Depois de 30 minutos, centrifugar os PBMC contendo J591-488 CTC rotulados a 800 xg durante 5 min. Ressuspender em tampão H / H. Encher uma seringa de 1 ml (pré-revestido com um tampão de R / S) com a amostra.

5. Preparação de microscópio, Bomba de Seringa e montagem de câmara de fluxo

1. Ligue o microscópio invertido e definir a iluminação Kohler em 10X objetiva. Traga a bomba de seringa, ao mesmo nível como a fase da amostra do microscópio e ajustá-la em uma dines / cm ² a tensão de cisalhamento (~ 10 mL / min).
2. Abra o software Zeiss Axiovision. Selecione o objetivo na tela do computador. Criar um novopasta na opção ferramentas do software.
3. Abra a opção experimentos inteligentes em Axiovision e ajustar as configurações para gravar 30 vídeos curtos SEC de 30 min.
4. Para vídeo fluorescente ao vivo, defina as opções de imagem-12 ms exposição, 2 x 2 bin, 5 Gain. Estes parâmetros ajudar na obtenção de vídeos perto da taxa de quadros de vídeo (~ 23 quadros por segundo) com a câmera Zeiss MRM.
5. Para visualizar toda a largura do canal de fluxo em 10 objetiva X na tela do computador, usar um adaptador C-mount (0,63 xf/60 mm Interface).
6. Ligue a lâmpada de mercúrio.
7. Colocar a seringa e o conector contendo as células sobre a bomba de seringa.
8. Traga a IL-1β HUVECs estimuladas da incubadora. Ligue o conector para o canal de entrada cheia do MicroSlide contendo HUVECs.
9. Conectar o canal de saída com o conector ligado ao tubo. Coloque o tubo em um prato ou 15 ml tubo cônico para coletar o fluxo através.
10. Inicie o infusino meio da microlâmina a 10 ul / min. Observar as interacções entre as células endoteliais e células MDA marcados ou rotulados CTC derivadas de doentes com filtro de 488 nm sobre o microscópio de epifluorescência.
11. Comece a gravar o experimento como 30 seg vídeos curtos. Durante a análise de reprodução, medir a velocidade de rolamento. Velocidade de rolamento é medida dividindo-se a distância percorrida pelas células ao longo do tempo.

6. Imunocoloração da microlâmina

1. Remova a mídia da entrada e saída do MicroSlide após perfusão células MDA em IL-1β estimulada pela HUVECs por 10 min.
2. Utilizando uma ponta de 200 mL, colocou quente (37 ° C) PBS contendo cálcio e magnésio para dentro da entrada da microlâmina, durante 5 min. Incline a MicroSlide usando sua tampa como um suporte no banco. Manter a microlâmina numa posição inclinada para todas as incubações durante a imunocoloração.
3. Fix HUVECs irrigando quente 2% de formaldeído na entrada
4. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. Lavar duas vezes com PBS durante 5 minutos cada.
5. Adicionar Triton X-100 (0,1%) em 5% de BSA em PBS durante 10 min à temperatura ambiente.
6. Lavar duas vezes com PBS durante 5 minutos cada. Bloco com 5% BSA em PBS durante 30 min.
7. Incubar com anticorpo de cabra primário anti-VE-caderina (1:100) em BSA a 2,5% O / N a 4 ° C.
8. No dia seguinte, lava-se duas vezes com PBS durante 5 minutos cada. Adicionar burro secundário anti-cabra 647 anticorpo por 45 min. Lavar duas vezes com PBS durante 5 minutos cada.
9. Incubar à temperatura ambiente com anticorpo conjugado J591-Alexa488 humanizado durante 1 hora.
10. Lavar duas vezes com PBS durante 5 minutos cada. Adicionar DAPI por 5 min. Lava-se com água destilada durante 5 minutos.
11. Adicionar PBS (ou Mowiol para armazenamento a longo prazo). Visualize a MicroSlide sob o microscópio confocal.

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Resultados

A Figura 1 mostra uma cultura D / N de uma monocamada de células endoteliais na microlâmina. Os extrapolação da Figura 1A mostra que 100% da microlâmina é visível usando objectivo 5X, enquanto 70% é visível usando uma objectiva de 10X (Figura 1B). Para o E-selectina interacções mediadas, as células que rolam nas bordas não são considerados o que torna mais do que 70% da microlâmina disponível para gravação de vídeo e análise de reprodução. Em nossa...

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Discussão

Devido ao baixo número de CTCs entre as células do sangue, é difícil isolar CTCs como uma população pura de células. Para estudar interações CTC / CE, a população rara e impura de CTCs coloca dois desafios principais: a) Identificação de CTCs entre as células do sangue; b) Observação de interações CTC / CE.

Para superar a primeira limitação de identificar CTCs próstata entre as células do sangue, aproveitamos o fato de que praticamente todas ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02