Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Resumo

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Resumo

Estudos realizados em Drosophila melanogaster embriões e larvas de fornecer informações cruciais nos processos de desenvolvimento, como especificação de destino celular e organogênese. Imunocoloração permite a visualização do desenvolvimento de tecidos e órgãos. No entanto, uma cutícula protectora que se forma na extremidade da embriogênese impede a permeação de anticorpos em embriões de fase tardia e de larvas. Enquanto dissecção antes de imunomarcação é regularmente utilizado para analisar Drosophila tecidos larvais, prova ineficiente para algumas análises, porque pequenos tecidos podem ser difíceis de localizar e isolar. Sonication fornece uma alternativa para dissecção em protocolos de positividade de larvas de Drosophila. Ela permite a rápida transformação, simultânea de um grande número de embriões em estágio final e larvas e mantém na morfologia situ. Após fixação em formaldeído, uma amostra é sonicada. A amostra é então submetida a imunocoloração com antigénio específico da formiga primárioibodies e anticorpos secundários marcados com fluorescência para visualizar os tipos de células-alvo e as proteínas específicas, através de microscopia de fluorescência. Durante o processo de sonicação, a colocação adequada de uma sonda de ultra-sons acima da amostra, bem como a duração e intensidade de ultra-sons, é crítica. Pequenas modificações adicional a protocolos de positividade padrão pode ser necessária para manchas de alta qualidade. Para os anticorpos com baixa relação sinal-ruído, o tempo de incubação mais longos são tipicamente necessário. Como prova de conceito para este protocolo facilitou-sonificação, mostramos immunostains de três tipos de tecidos (testículos, ovários e tecidos neurais) em uma série de estágios de desenvolvimento.

Introdução

Embriões de Drosophila e larvas de fornecer um excelente modelo para estudar os processos de desenvolvimento em vários órgãos e tecidos. Imagem de células individuais é muitas vezes necessário nestes estudos, a fim de apurar os ambientes complexos em que as células se desenvolvem. A visualização de células em tecidos pode ser realizada através de imunomarcação. Bem descrito imunomarcação existem protocolos para tecidos de Drosophila embrionárias <17 horas após a postura dos ovos (AEL) ^1-3. No entanto, se forma uma cutícula protetora para o fim da embriogênese, impedindo a permeação de anticorpos eficazes. Assim, estes protocolos imunocoloração são ineficientes na análise de tecidos em embriões em estágio final e em fases posteriores do desenvolvimento larval ⁽¹ º instar (L1), 2 ^º instar (L2), e 3 ^º instar (L3)). Essa ineficiência impõe uma barreira à nossa compreensão dos processos dinâmicos que ocorrem durante este período de desenvolvimento prolongado ^4. Tissue dissecção é uma técnica amplamente utilizada para contornar essa barreira ^5-7. No entanto, a dissecção pode provar ineficiente. Extração podem ser sobrecarregados com dificuldade em localizar ou isolar embrionário e tecidos larvais. Além disso, a remoção física dos tecidos-alvo pode causar danos pela ruptura los ou ao não extraí-los em sua totalidade.

A sonicação é um método que emprega ondas sonoras para perturbar interacções intermoleculares. Tem sido usada para romper a integridade da cutícula larval Drosophila, a fim de imunocoloração tipos de células neurais em desenvolvimento ^6. Este protocolo foi adaptado para imunocoloração embrionário de fase final e gónadas larvais, o que pode ser tão pequeno quanto 50 um de diâmetro ^{de 8-10.} Através desses estudos, o processo de célula-tronco da linhagem germinativa (GSC) formação nicho masculino tem sido caracterizada em fase final de embriões de Drosophila ^8-10 e mecanismos que regulam o desenvolvimento de células-tronco e difdife- em fase final de gônadas embrionárias e as larvas foram elucidados ^9-12. Assim, de ultra-sons constitui uma alternativa eficiente para a dissecção de tecidos que pode ser difícil por causa do tamanho dos tecidos. Além disso, permite a imunocoloração de tecidos in situ de Drosophila, deixando as células no contexto de todo o organismo e manutenção da morfologia situ. Aqui, nós descrevemos um protocolo passo-a-passo para a fluorescência imunocoramento tarde-estágio embrionário através primeiros tecidos / mid-L3 in situ. Análise de Drosophila gonadal e tecido neural é mostrado nos resultados representativos para demonstrar a eficácia do presente protocolo. Além disso, este protocolo de imuno pode ser adaptado para analisar outros tecidos de Drosophila, bem como os tecidos em outros organismos com uma cutícula externa.

Protocolo

1 Preparação de uma gaiola coleção

1. Anestesiar jovens, moscas férteis com CO _2. Transferir moscas anestesiadas para uma gaiola. Para obter o rendimento ideal, use 100-120 moscas adultas variam de 2-7 dias de idade em uma proporção de 4: 1 de mulheres para homens. Permitir moscas um período de aclimatação apropriada, ~ 24 horas antes da obtenção de amostra para a fixação. Se a gaiola foi criado com fêmeas virgens acoplado aos homens, o uso de um 36 - período de aclimatação de 48 hr.
2. Na extremidade aberta da gaiola, colocar uma placa de agar pré-preparados sumo de maçã com uma gota do tamanho de uma moeda, de levedura pasta no centro ao longo da abertura da jaula. Em seguida, prenda com fita adesiva. Selar a junção entre a placa de ágar suco de maçã ea gaiola com Parafilm.
3. Coloque a gaiola em um contentor secundário com sumo de maçã placa de agar na forma de base e permitir que as moscas para reproduzir a uma temperatura definida por um período de tempo adequado, tal como determinado pela experiência.
   Nota: Os tempos de colheita de amostras wivai variar. Por exemplo, quando a recolha de embriões de fase tardia / larvas L1 precoce (17 - 24 horas), permitir que as moscas a pôr ovos em placas de agar de sumo de maçã durante 7 horas a 25 ° C, antes do envelhecimento das amostras durante 17 horas a 25 ° C. Da mesma forma, para uma recolha de larvas de primeiro estádio de meados de atraso (36 - 48 h) permitir que as moscas a pôr ovos durante 12 horas a 25 ° C, antes do envelhecimento das amostras durante 36 horas a 25 ° C.
4. Uma vez que o período de tempo é completo, toque na gaiola em uma mesa para que as moscas cair longe da placa de ágar suco de maçã sem anestesia. Substituir rapidamente a placa utilizada por uma nova, contendo uma gota de pasta de levedura. Fixe a placa de fresco com fita adesiva e parafilm e armazenar a gaiola com suco de maçã placa de ágar como base.
5. Remova cuidadosamente a queda levedura da placa usada com uma espátula de metal. Coloque a tampa na placa de suco de maçã usado e permitir que os embriões colocados para a idade, se experimentalmente necessário.
   Nota: Embora as amostras de envelhecimento, as placas podem ser armazenadas a 25 ° C, a menos que as temperaturas mais elevadas são experimentally necessária. Exemplos de como envelhecer embriões para a coleta são descritos acima (ver nota para o passo 1.3). A remoção da levedura pasta antes de provar o envelhecimento é realizada para evitar larvas de rastejar na levedura e quebrando o agar por baixo. O resíduo ágar suco de maçã e levedura pasta restante fornecer nutrientes para o crescimento larval. Enquanto os embriões fixados directamente na pasta de levedura são perdidos através de remoção de pasta de levedura, esta perda é preferível para levedura e agar de resíduo na amostra, que pode reduzir a eficiência da coloração. Se uma escolha não remover a pasta de levedura, a levedura pode ser liquefeito com Tampão Fosfato de Triton X-100 (PbTx), misturado com um pincel, e em seguida removido a partir da amostra com um filtro de células antes da fixação.

2 Fixação

1. Uma vez que os embriões fixados sobre a placa de agar de sumo de maçã têm idade para o ponto de tempo desejado, utilizar um pequeno pincel humedecido com solução de tampão fosfato de Triton X-100 (PbTx) para remover cuidadosamente amostras de poe placa.
   Nota: larvas mais velhas são móveis e podem rastejar para o interior da tampa. Esta amostra pode ser recolhida de forma semelhante por remoção com um pincel.
2. Limpe o pincel amostra-laden contra virado para o interior cume de um filtro de células. Em seguida, lave as paredes do filtro e do pincel com uma garrafa de esguicho contendo solução PbTx. Coloque uma tampa de placa de petri por baixo do filtro para capturar a solução PbTx.
3. Depois de toda a amostra foi transferida para o filtro, despeje PbTx suficiente no filtro de levantar a amostra para fora da malha. Em seguida, levante a peneira e despeje o conteúdo da placa de petri em um recipiente de resíduos líquidos.
4. Repita o passo 2.3 três vezes para remover fungos e resíduos que possam ter sido transferidos juntamente com a amostra de voar.
5. Despeje suficiente 50% de lixívia _(ddH2O) (NaOCl) / água no filtro para aumentar as larvas fora da malha. Permitir que as larvas se sentar na solução por 5 min. Em seguida, levante a peneira e deitar fora tele conteúdo da placa de petri em um recipiente de resíduos líquidos.
   Nota: Bleach é necessária apenas em amostras embrionárias com idades entre 0-22 horas, a fim de remover a membrana coriônica. A aplicação de água sanitária para amostras mais velhas pode ser omitido, mas a sua inclusão não é prejudicial. Se a omissão for desejado, substituir a água sanitária nesta etapa com PbTx. Água sanitária diluída deve ser utilizada dentro de 24 horas de preparação da solução.
6. Lave amostra no coador com PbTx derramando bastante PbTx no coador para aumentar a amostra para fora da malha. Deixar a amostra para sentar-se em solução para 3 min. Em seguida, levante a peneira e despeje o conteúdo da placa de petri em um recipiente de resíduos líquidos.
7. Repita o passo 2.6 cinco vezes.
8. Dab parte inferior do filtro de células secas, em seguida, transferir a amostra para um frasco de cintilação contendo 1,75 ml de solução de PEMS utilizando um pincel.
9. Trabalhando numa hotte ventilada, adicionar 250 mL de formaldeído a 37% e 8 ml de heptano de grau de reagente para o frasco de cintilação.
   Nota: Formaldeído e heptano são perigosos. Por razões de segurança, continuar a trabalhar em um exaustor ventilado e usar luvas apropriadas para as etapas 2,9-3,3.
10. Deixe o frasco para agitar a 200 rpm ou uma velocidade moderada semelhante para 20 min.
11. Adicionar 10 ml de metanol a ampola de cintilação, sem remoção da fase aquosa anterior e permitir que o frasco para agitar vigorosamente a 500 rpm durante 1 min.
    Nota: O metanol é perigoso. Continuar a trabalhar em um exaustor ventilado e usar luvas apropriadas.
12. Remover o frasco do shaker e imediatamente despeje o conteúdo em um filtro de células sobre um recipiente de resíduos líquidos na capa. Adiciona-se metanol adicional para o frasco e executado através do filtro, conforme necessário para garantir que todo célula da amostra foi removido.
    Nota: coadores célula pode drenar lentamente. Para remediar esta situação, um toque de tecido de laboratório para a parte inferior do coador de células, de modo a extrair a solução através do filtro de forma mais rápida. Metanol, formaldeído, e heptano deve serarmazenado em lixeiras apropriadas até o descarte adequado de acordo com as diretrizes institucionais.
13. Inferior a seco de filtro de células utilizando um tecido de laboratório, em seguida, usar um pincel para transferir a amostra capturada na peneira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 0,5 ml de metanol.
    Nota: Se vários frascos de cintilação estão em uso, conclua as etapas de 2,12 e 2,13 um frasco de cada vez para evitar a amostra de secagem em filtros celulares.
14. Assim que a amostra foi adicionada ao tubo de microcentrífuga, remover o metanol, com uma pipeta. Certifique-se de amostra tenha assentado no fundo do tubo.
15. Lavar amostra no tubo de microcentrífuga, adicionando cerca de 0,5 ml de metanol ao tubo. Espere por amostra para resolver depois remover o metanol com uma pipeta.
16. Repita o passo 15 três vezes.
17. Adicionar 0,5 ml de metanol ao tubo, em seguida, armazenar em um freezer -20 ° C para uso posterior.

3. Reidratação e Preparação de Amostras para Imunocoloração

1. Remover o metanol a partir do tubo de microcentrifugadora com uma pipeta, deixando a amostra no tubo. Loja resíduos de metanol para o recipiente adequado de lixo até à hora de eliminação adequada.
   Nota: Para aumentar a eficiência de ultra-sons, utilizar não mais de 3 mm de amostra depositada no fundo do tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Excesso de amostra pode ser transferida para um tubo separado com uma pipeta, antes de começar a etapa de re-hidratação acima. Cortar a ponta da pipeta com uma lâmina de barbear limpa pode ser usada para evitar o entupimento da ponta da pipeta.
2. Adicionar 1,0 ml de uma solução a 50% de metanol / tampão de fosfato Tween (PBTw) para o tubo e rocha durante 3 min.
3. Remover solução de metanol para o recipiente de resíduos adequado e enxaguar com 1,0 l de PBTw duas vezes. Depois de cada lavagem, deixar a amostra para resolver antes de tirar fora do PBTw com uma pipeta.
4. Adicionar 1,0 ml de albumina sérica bovina / tampão fosfato Tween (BBTw) misturar ao frasco e rock. Após 3 min em uma cadeira de balanço, permitir que o sample para resolver e remover o BBTw com pipeta.
5. Repita o passo 3.4 duas vezes, tendo o cuidado de retirar o máximo BBTw possível, sem perder de amostra após a última lavagem.
6. Adicionar 0,5 ml de BBTw para o tubo e colocar o tubo em gelo.

4. Sonicação de Amostra

1. Defina o sonicador a 10% da amplitude máxima e designar um tempo de execução de 2 seg sonicação constante.
   Nota: Essas configurações são específicas para o sonicador indicada nos Materiais e Equipamentos Tabela e pode exigir de otimização para diferentes sonicators.
2. Antes de ultra-sons de amostra, limpar a sonda de ultra-sons colocando a ponta da sonda em um tubo de 50 ml cheia de água deionizada e de execução sonicador de limpar a sonda. Sonda de ultra-sons a seco com tecido laboratório após corrida.
3. Submerge da sonda para o tubo de microcentrífuga contendo amostra de modo que fique posicionado aproximadamente 3 a 4 mm acima da amostra e iniciar sonicação.
4. Remover o microcentrifuge tubo e coloca-se em gelo durante pelo menos 30 segundos para dissipar o calor a partir de ultra-sons e permitir que a amostra se depositam no fundo do tubo de microcentrífuga.
5. Repita os passos 4.3 e 4.4, conforme necessário, com base na idade da amostra que está sendo processado.
   Nota: Para um volume ótimo de amostra sonificação, os embriões mais jovens do que 17 horas não necessitam de ultra-som, mas aqueles entre 17 e 24 horas (fase 17 / early-L1) requerem dois sonicações. Larvas entre 24-36 (início / meio-L1), 36-48 (mid / late-L1), 48-60 (início / meio-L2), 60-72 (mid / late-L2), 72-84 ( early-L3), 84-96 (início / meio-L3), 96-108 (mid / late-L3) hr exigem 5, 9, 11, 13, 15, 18 e 22 sonicações respectivamente. Veja a discussão para posterior elaboração em tempos de sonicação.
6. Enxágüe com 1,0 ml BBTw duas vezes. Depois de cada lavagem permitir que a amostra para resolver antes de tirar fora BBTw com uma pipeta.
7. Adicionar 1,0 ml de BBTw ao frasco e rock. Após 3 min do roqueiro, permitir que a amostra se estabelecer e remover o BBTw com pipeta.
8. Repita o passo 4.7 duas vezes.

5. Imunocoloração

1. Bloquear amostra por adição de 5% de soro normal diluído em BBTw ao tubo de microcentrífuga. Remova o bloco após balançar por 1 hora.
   Nota: Use soro normal das espécies em que os anticorpos secundários são gerados.
2. Diluir anticorpos primários para se apropriar concentração de trabalho na solução de 5% de soro normal de / BBTw.
3. Amostra de rocha no anticorpo primário solução O / N a 4 ° C ou durante pelo menos 3 horas à temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C.
   Nota: Os tempos de incubação de anticorpos e as temperaturas podem variar. S / N incubação a 4 ° C ou 3 horas à temperatura ambiente é tipicamente suficiente. No entanto, um período de incubação de dois dias, pode melhorar a qualidade de coloração, especialmente com amostras mais velhas ou quando os anticorpos primários de baixa afinidade são utilizadas. Incubações mais longas são geralmente realizados a 4 ° C. Considerações similares devem ser feitas quando se utiliza anticorpos secundários (ver 5.10).
4. Deixar a amostra em repouso para ainferior do tubo de microcentrífuga. Colhem-se anticorpos primários com pipeta. Salve anticorpos para reutilização, se desejar.
5. Enxágüe com 1,0 ml de BBTw duas vezes. Depois de cada lavagem permitir amostra para resolver antes de tirar fora BBTw com uma pipeta.
6. Adicionar 1,0 ml de BBTw ao frasco e rock. Após 3 min do roqueiro, permitir que a amostra se instalar e remover BBTw com pipeta.
7. Repita o passo 5.6 cinco vezes.
8. Bloco amostra por adição de uma solução de soro normal de / BBTw 5% para o tubo de microcentrífuga. Remova o bloco de balanço depois durante 30 minutos a 1 hora.
   Nota: Esta etapa bloqueio adicional não é necessária, mas pode melhorar a qualidade de coloração para detecção de anticorpos específicos.
9. Diluir anticorpos secundários se apropriar de concentração de trabalho na solução de 5% de soro normal de / BBTw.
10. Enrole tubo de microcentrífuga em papel de alumínio para reduzir o desbotamento devido à exposição à luz. Amostra de rocha na solução de anticorpo secundário por 12 a 48 horas a 4 ° C ou durante pelo menos 3 horas à temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C.
11. Deixar a amostra em repouso para a parte inferior do tubo de microcentrífuga. Empate fora de anticorpos secundários com pipeta.
12. Enxágüe com 1,0 ml de PBTw duas vezes. Depois de cada lavagem permitir que a amostra antes de se estabelecer a remoção do PBTw com uma pipeta.
13. Adicionar 1,0 ml de PBTw ao frasco e rock. Depois de 5 minutos sobre o roqueiro, permitir que a amostra se estabelecer e remover o PBTw com pipeta.
14. Repita o passo 5.13 três vezes.
15. Opcional: Adicione DAPI diluído 1: 1.000 em PBTw. Amostra de rocha embrulhados em papel alumínio por 3 min; em seguida, remover a solução DAPI com uma pipeta. Lavar cinco vezes com 1,0 ml de PBTw, permitindo amostra para resolver antes de remover PBTw com pipeta.
16. Adicionar 80 - 100 mL de 1,4-diazabiciclo solução [2.2.2] octano (DABCO) ao tubo de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C.
    Nota: Um outro agente anti-desbotamento base de glicerol pode ser substituído por.

6 Análise

1. Antes de amostra de montagem em lâminas, adicionar um extra de 5 - 10 mL de DABCO / p-fenylenediamine (PPD) antifade solução para tubo de microcentrífuga.
   Nota: A amostra pode ser adicionada a lâminas sem a dissecção. O volume de amostra adicionada a uma corrediça varia com o tamanho da tampa deslizante. Quando pipetar amostra em slide, a ponteira pode ser cortada com uma lâmina de barbear para evitar amostra de corte. Muitas vezes, é útil para a linha de exemplo em linhas de análise fácil. A adição de um agente de PPD como antifade adicional pode não ser necessária, mas pode evitar a fotodegradação se as amostras são armazenadas a longo prazo.
2. Delicadamente, coloque a tampa de vidro de deslizamento ao longo da amostra. Então, lamínula seguro no local usando unha polonês.
3. Ver montado amostra usando microscopia de fluorescência.

Resultados

Para demonstrar a eficácia de imunocoloração à base de ultra-sons na análise de embriões de fase final e tecidos larvais in situ, os embriões de tipo selvagem e as larvas foram processadas para imuno-coloração dos testículos, dos ovários, e tecido neural. As amostras foram fotografadas por microscopia confocal e os resultados representativos são mostrados (Figura 1 e Figura 2). Os resultados revelam que o protocolo descrito é eficaz para a visualização de caracte...

Discussão

Este protocolo fornece um método para atingir com sucesso imunocoloração Drosophila embrionário e larval tecidos in situ, eliminando, assim, a necessidade de dissecção. De acordo com os protocolos anteriores, para a coloração de embriões de ^1,2,3, a membrana coriónica é removido usando 50% de lixívia (hipoclorito de sódio). As amostras são fixadas em formol e metanol. Porque a cutícula larval provoca amostra mais para flutuar, a totalidade da amostra é então passada através...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx)			For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)			For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10%			For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS			0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes			For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde			37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane		CAS 142-82-5	n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol		CAS 67-56-1	Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10%			For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)		CAS: 281-57-9	To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution			1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates			To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10%			To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste			~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa			1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Mouse anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
mouse anti-Repo	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Goat anti-rabbit Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Goat anti-mouse Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Goat anti-rat Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.		Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 μm cellulose nitrate membrane filter