Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Resumo

Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.

Resumo

Embriões de peixe-zebra são uma poderosa ferramenta para a triagem em larga escala de pequenas moléculas. Zebrafish transgênicos que expressam proteínas repórter fluorescentes são freqüentemente usados ​​para identificar os produtos químicos que modulam a expressão do gene. Telas químicas que ensaio de fluorescência no peixe-zebra ao vivo muitas vezes dependem de caros, equipamentos especializados para rastreio de alto conteúdo. Nós descrevemos um procedimento usando um microscópio de epifluorescência padrão com um palco motorizado a imagem automaticamente embriões de peixes-zebra e detectar a fluorescência de tecido específico. Usando zebrafish transgênicos que relatam a atividade do receptor de estrogênio via expressão de GFP, foi desenvolvido um processo semi-automatizado para triagem de ligantes do receptor de estrogênio que ativam o repórter de uma forma específica de tecido. Neste vídeo, descrevemos os procedimentos para arraying embriões de peixe-zebra em 24-48 horas pós fertilização (hpf) em uma placa de 96 poços e adicionando pequenas moléculas que se ligam receptores de estrogênio. Em 72-96 hpf, imagens de cada poço a partir detoda a placa são coletados automaticamente e inspecionados manualmente para fluorescência de tecido específico. Este protocolo demonstra a capacidade para detectar os estrogénios que activam os receptores de válvulas cardíacas, mas não no fígado.

Introdução

Paulistinha transgênico foram desenvolvidos que permitem a visualização direta de atividade em vias de sinalização, como fatores de crescimento de fibroblastos ^1, o ácido retinóico ² e ³ estrógenos, em embriões vivos. Estas ferramentas permitem o rastreio de produtos químicos que perturbam as vias de sinalização (ensaiado como uma mudança na intensidade de fluorescência) ou por produtos químicos que modulam a sinalização de um modo específico do tecido (alteração na fluorescência de localização) ^4. Captura de imagem automatizado aumenta a taxa de transferência de telas químicas dramaticamente ^5,6. Telas que fluorescência automaticamente ensaio no peixe-zebra ao vivo muitas vezes dependem de caros, equipamentos especializados. O chamado de triagem de alto teor fornece o benefício de alta resolução, imagens quantitativas, mas ao custo de usar leitores de placas especializadas equipadas para microscopia confocal ^7,8. O objectivo deste método é a fluorescência específica de tecido automaticamente ensaio em embriões de peixe-zebraem uma placa de 96 poços, utilizando um microscópio de epifluorescência padrão. Fluorescência de tecidos específicos podem ser distinguidos utilizando esta técnica e pode ser uma abordagem razoável para laboratórios que não têm acesso a leitores de placas especializadas ou equipamentos de alta teor de triagem.

Neste protocolo, usamos de imagens automatizado para detectar receptor de estrogênio tecido específico (ER) agonistas em peixe-zebra ao vivo em três dias após a fertilização (dpf). A linhagem transgênica Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 contém 5 seqüências em tandem de resposta de estrogênio elementos de DNA (ERE) a montante da proteína verde fluorescente (GFP) ^3. Na ausência de ligando, ERs são normalmente inactivos. Ligação do ligante desencadeia uma mudança conformacional, permitindo que os receptores para ligar DNA ERE e regulam a transcrição ^9. 5xERE: peixe GFP pode ser utilizado para pesquisar bibliotecas químicas para moduladores de ER e pode ser utilizado para rastrear as amostras de água do meio ambiente para os contaminantes estrogênicos.

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Protocolo

NOTA: Este protocolo foi aprovado pela Universidade de Alabama em Comitê Animal Care e Use Institucional Birmingham.

1. Breeding Zebrafish e ovo Coleções

1. Três dias antes do início da exposição a produtos químicos, montar tanques de criação com divisórias para machos e fêmeas separados. Encha cada metade do caminho tanque com água do sistema de aquicultura. Usando uma rede, transferir Tg (5xERE: GFP) peixe ^c262/c262 para tanques de criação, colocando 2 machos e 3 fêmeas em cada tanque separado por uma divisória. Coloque uma tampa em cada tanque e etiqueta com data e as tensões a serem cruzados.
2. Na manhã seguinte, retire todas as barreiras e inclinação defletores para criar uma área rasa em uma extremidade do tanque de criação. Permitir peixe-zebra para acasalar, a coleta de embriões em intervalos de 10 min para garantir a encenação de desenvolvimento precisa. Ovos limpos lavando através de um coador de chá usando E3B médio e lave delicadamente embriões em placas de Petri. Retornar peixes adultos para permanentetanques.
3. Usando um microscópio de dissecação, classificar, contar, e remover todos os embriões não fertilizados, anormais ou danificados. Coloque embriões em placas de Petri em E3B médio e casa de 28,5 ° C, com 14:10 de luz: ciclo de escuro. Densidade de embriões pode afetar o desenvolvimento. Coloque no máximo 100 embriões em um prato de 100 mm x 35 e não mais de 50 embriões em um prato mm 60 x 15.
4. Por 24 hpf, substituir a mídia com E3B contendo 200 mM 1-fenil-2-tiouréia (PTU). PTU evita a formação de pigmento e mantém embriões de peixes-zebra e larvas transparente para melhorar a nitidez da imagem. CUIDADO: estoque PTU concentrado é perigoso; usar luvas ao fazer solução E3B + PTU.
5. Em 1 º dia pós fertilização (dpf), remover manualmente o córion de cada embrião usando uma pinça fina. O córion não parece afetar a penetração de estrogênios, porém remoção aumenta a nitidez da imagem. Não há necessidade de remover córions da mídia. NOTA: Como alternativa ao dechorionation manual, lotes de embriões pode ser checamente dechorionated utilizando 1 mg / mL de pronase de tratamento, como anteriormente descrito ^11.

2. Química Tratamento de embriões

1. No dia antes do tratamento, preparam-se soluções de estoque de cada produto químico, na concentração de 1000 vezes em DMSO (ou num solvente adequado). Por exemplo, para expor os embriões a 10 uM de bisfenol A (BPA), preparar uma solução de estoque 10 mM de BPA em 100% de DMSO. Isto assegura a concentração de DMSO uniforme em cada tratamento e permite uma diluição 1:1.000 não-tóxico de DMSO para servir como um controlo do veículo. As soluções de armazenar a -20 ° C. Para este protocolo, os embriões serão expostos a 1 uM e 10 uM de BPA, 18,5 nM e 1,85 uM de genisteína, 367 nM de estradiol (controlo positivo) e veículo (DMSO a 0,1%, de controlo negativo).
   ATENÇÃO: Produtos químicos, como BPA e estradiol são perigosos e podem ter efeitos deletérios sobre o feto humano. Lidar com disruptores endócrinos com cuidado e use sempre equipamento de protecção individual adequado.
2. No dia do tratamento, descongele preparadas soluções químicas de ações. Dilui-se 1:1000 pipetando 1 ml + E3B PTU para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e a adição de 1 ml de solução de estoque de produtos químicos. Vortex vigorosamente. Dilui-se 1:1000 em DMSO + E3B PTU como um controlo do veículo. Use 1 mL + E3B PTU num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, como um controlo não tratado.
3. Usando uma pipeta de transferência de plástico grande furo, embriões de transferência a partir de placas de Petri para cada poço de uma placa de 96 poços, 3 embriões por poço, 3 poços por condição. Para evitar a evaporação durante o tratamento prolongado, omitir embriões de linhas exteriores e as colunas da placa (linhas A e E, as colunas 1 e 12). Poços exteriores podem ser preenchidos com 300 ul de E3B + PTU. Rotular a tampa da placa de forma adequada.
4. Remova a mídia de cada poço com uma fina ponta da pipeta de transferência de plástico. Trabalhe rapidamente para evitar a secagem dos embriões.
5. Adicionar 200 ul de solução de tratamento em cavidade correspondente. Coloque a tampa underneath a placa como um guia para assegurar a adição de tratamentos para os poços apropriados. Vortex cada tubo antes da pipetagem para distribuir o produto químico em solução. Confirmar visualmente cada embrião é na solução de tratamento. Se os embriões estão do lado do poço, utilizar uma pipeta de transferência limpa para lavá-los para dentro do poço, com a solução de tratamento.
6. Colocar a placa na incubadora a 28,5 ° C. Embriões serão analisados ​​quanto à fluorescência no 72 hpf.

3. Automated imagem de embriões em placas de 96 poços

1. Anestesiar os embriões por adição de 10 uL de 4 mg / ml tricaina a cada poço.
   NOTA: Anestesie embriões antes da imagem. Na 24-96 hpf, peixe-zebra exibem movimento espontâneo e uma resposta de sobressalto para a fonte de luz mudando durante a captura da imagem. Anestesiar embriões reduz o movimento durante o exame.
2. Colocar a placa de 96 poços na plataforma motorizada e calibrar o palco. Usando 2011 software para microscopia automatica Zeiss Zen Azulon e controle, selecione a opção transportadora amostra e selecione multiwell 96. Selecione Calibrar. Siga as instruções passo a passo para calibrar o palco.
   NOTA: Não desmarque o botão azulejos após esta etapa. Se o botão de telhas é desmarcada, as configurações de calibragem podem ser perdidos ea placa de 96 poços terão de ser recalibrado.
3. Usando uma objetiva de 10x eo campo claro (BF) definir, identificar um embrião controle positivo e definir as configurações de exposição adequadamente para BF e canais de GFP, certificando-se que o sinal de fluorescência não está saturando a câmera. Concentre-se em um único embrião e programar o microscópio para adquirir 3 total de Z-seções, uma imagem 50 mm acima e outra 50 mm abaixo do plano focal atual.
   NOTA: Uma vez que os tecidos diferentes ocupam diferentes planos focais, o que irá garantir que para cada peixe-zebra imagens são capturadas com o coração eo fígado em foco.
4. Defina os parâmetros de software para adquirir uma imagem em mosaico usando GFP e BF channels. Sob a guia de aquisição, selecionar a configuração avançada. Selecionar as regiões de azulejos, então telhas. Escolha a opção de círculo bem.
   NOTA: ladrilhos é usada para criar uma imagem composta de cada poço. Um campo de visão-single captura apenas uma pequena parte de cada poço. A função de azulejos pode capturar automaticamente várias adjacente campos de visão de cada poço, criando uma imagem composta de todo o bem. Por conseguinte, é possível captar automaticamente 96 imagens compostas por placa, em que cada imagem composta contém várias dezenas de imagens individuais a partir de um único poço.
5. Escolha operadora e preencher fator de 90%. A seleção de um fator de preenchimento de 90% irá capturar várias imagens dos poços selecionados de tal forma que 90% da área de cada poço será visível na imagem composta.
   NOTA: Ao selecionar o fator de preenchimento, um diagrama será exibido representando a área a ser trabalhada. Selecione uma porcentagem que vai incluir a área do poçoque é apropriado para a experiência.
6. Em Opções, selecione a quantidade de sobreposição desejado.
   NOTA: Quando costurando telhas para uma única imagem representativa, uma sobreposição de 5-10% permite uma costura suave entre imagens. No entanto, se a imagem de costura é necessário, utilizando uma sobreposição 0% irá reduzir o tempo de imagiologia. Utilização de factor de enchimento de 90% e 5% de sobreposição, uma imagem composta de um único poço consiste de 59 imagens individuais.
7. Comece imagem. O microscópio irá adquirir automaticamente as imagens.
8. Inspeccionar manualmente imagens compostas de cada poço para fluorescência específica de tecido (Figura 1).
9. NOTA: É melhor começar com o controle positivo para confirmar que a exposição a substâncias químicas trabalhou antes de observar poços de tratamento experimental.

4. Manual de captura de imagem de Embriões em placa de 96 poços

NOTA: Para confirmar os resultados, use uma objetiva de 20x distância de trabalho longa para acquire imagens mais detalhadas manualmente (Figura 2).

1. Usando uma objetiva de 20x eo campo claro (BF) definir, identificar um embrião controle positivo e definir as configurações de exposição para os canais de BF e GFP adequadamente, certificando-se que o sinal de fluorescência não está saturando a câmera.
2. Identificar embriões individuais e capturar imagens manualmente.
   NOTA: Uma vez que as configurações de exposição foram selecionados para o embrião controle positivo, não alteram as configurações. Esta permite uma comparação da intensidade de fluorescência para cada imagem é capturada em condições uniformes.

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Resultados

A Figura 1 mostra imagens compósitas a partir de poços individuais de uma placa de 96 poços. Cada imagem composta é composta de 59 imagens individuais com 5% de imagem de sobreposição. Note-se que o peixe-zebra vivos são orientadas aleatoriamente dentro de cada poço, ainda que são capazes de distinguir da fluorescência no coração a partir do fígado. Imagens de campo claro, são úteis como referências para avaliar a orientação peixe-zebra e visualizar anormalidades morfológicas ...

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Discussão

Este protocolo descreve um método simples para automaticamente a imagem de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra. O protocolo foi desenvolvido utilizando uma Zeiss Axio Observer. Z1 com software Zen azul 2011, no entanto, a técnica pode ser adaptada usando qualquer microscópio invertido com uma platina motorizada e software de controlo do microscópio que possa realizar a telha para criar imagens compostas. Equipar um microscópio invertido com um palco motorizado pode fornecer uma alternat...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic transfer pipettes; wide bore	Fisher	13-711-23
Plastic transfer pipettes; fine tip	Fisher	13-711-26
96-well, round, flat bottom plates	Fisher	21-377-203
100 x 35 mm plates	Fisher	08-757-100D
35 x 60 mm plates	Fisher	08-757-100B
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	A5040-25G	see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage
20x long working distance objective	Carl Zeiss		We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance
Axiocam HRm digital camera	Carl Zeiss
ZenBlue 2011 microscope control software	Carl Zeiss		Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage
Methylene Blue	Sigma Aldrich	MB-1; 25 grams	make 2% solution in RO water for use in E3B (below)
E3B			60X E3 SOLUTION: NaCl                    - 17.2 grams KCl                       - 0.76 grams CaCl2-2H2O     - 2.9 grams MgSO4-7H2O  - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3      150 ml 2% methylene blue     100 μl  Bring to 9 liters with Milli-Q water