Guiada por ultra-som transtorácica intramiocárdico Injection em Ratos

Resumo

Injeção intramiocárdica percutânea guiada por ecocardiografia representa uma modalidade eficiente, confiável e targetable para a entrega de agentes de transferência de genes ou células no coração murino. Seguindo os passos descritos neste protocolo, o operador pode rapidamente tornar-se competente nessa técnica versátil, minimamente invasiva.

Resumo

Modelos murino de doença cardiovascular são importantes para a investigação de mecanismos fisiopatológicos e explorar potenciais terapias regenerativas. Experimentos envolvendo injeção do miocárdio são actualmente desempenhadas pelo acesso cirúrgico direto através de uma toracotomia. Enquanto conveniente quando realizada no momento de outra manipulação experimental, como a ligadura coronária, a necessidade de um procedimento invasivo para entrega intramiocárdica limita potenciais projetos experimentais. Com cada vez melhor resolução ultra-som e modalidades avançadas de imagem não invasivos, é agora possível realizar rotineiramente guiada por ultra-som, injeção intramiocárdica percutânea. Esta modalidade de forma eficiente e confiável fornece agentes para uma região alvo de miocárdio. As vantagens dessa técnica incluem a prevenção de morbidade cirúrgica, a facilidade de atingir regiões do miocárdio seletivamente sob a orientação do ultra-som, bem como a oportunidade para entregar injetado ao myocardium em vários intervalos de tempo predeterminados,. Com a técnica praticada, complicações da injeção transmural são raros, e os ratos rapidamente retornar à atividade normal na recuperação da anestesia. Seguindo os passos descritos neste protocolo, o operador com experiência básica ecocardiografia pode rapidamente tornar-se competente nessa técnica versátil, minimamente invasiva.

Introdução

A doença cardíaca é a principal causa de morte para homens e mulheres nos Estados Unidos, sendo responsável por 600 mil mortes por ano ^1. Modelos murino de doença cardiovascular são extremamente importantes para a investigação de mecanismos fisiopatológicos e para explorar potenciais terapias. Entrega do Miocárdio de vetores de terapia genética, células-tronco, RNAs modificados e outros agentes terapêuticos permite a investigação de seu potencial terapêutico para doenças do coração ^2-7. Atualmente, há poucas opções para entrega do miocárdio de agentes terapêuticos em modelos de ratos ^6. A injeção transmural sob visualização directa é comumente utilizada, mas requer uma esternotomia ou toracotomia e é limitada à região exposta do coração. Embora conveniente quando realizada no momento de uma outra manipulação experimental tal como LAD ligadura, a necessidade de um procedimento invasivo para entrega intramiocárdicas limita potenciais modelos experimentais e introduz umADICIONAIS efeitos do procedimento (por exemplo, fibrose devido a toracotomia). Entrega de pericárdio percutânea de vetores virais tem sido relatada, mas o local e distribuição de agente terapêutico não é homogênea e é difícil de controlar ^8. Percutâneas resultados injeção coronárias em distribuição mais homogênea do material injetado, mas a entrega coronária eficaz e reprodutível, é um desafio em modelos murinos.

Aqui, descrevemos um baú técnica de injeção intramiocárdica fechado que permite minimamente invasivo, controlado pelo operador orientação dos agentes terapêuticos sob a orientação do ultra-som. A técnica é fácil de aprender, elimina a necessidade de toracotomia ou esternotomia e suas complicações experimentais de atendimento, e proporciona uma maior flexibilidade do calendário e locais de injeção transmural. Assim, a injecção assistida por ecocardiografia intramiocárdicas representa um método tecnicamente simples e altamente eficaz de manipular omiocárdio em modelos experimentais murinos.

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Protocolo

Todos os passos descritos foram realizados no âmbito de protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso do Hospital Infantil de Boston Animais Institucional.

1 Preparação

1. Realizar avaliação anatômica e funcional cardíaca inicial por ecocardiografia antes de iniciar o protocolo de injeção, como a posição do transdutor fixo ideal para injeção transmural pode não produzir as ótimas vistas padrão para delinear a anatomia ea avaliação da função.
2. A configuração da injecção é mostrado nas figuras 1A-1C. Coloque uma seringa vazia com uma agulha com bainha, para cima orientada cônicas, na braçadeira seringa (ver Figura 1C) e fixe a sonda transdutor de ultra-som no grampo varredura-cabeça (ver Figura 1B). Soltar a verificação da cabeça de bloqueio bola grampo comum (Figura 1B) e manipular a orientação do transdutor de modo a que ele está alinhado paralelo ao eixo da agulha. Fixe a digitalizaçãoposição da cabeça, apertando a varredura-cabeça bola bloqueio braçadeira conjunta.
   NOTA: Para injeção em ratos adultos, uma agulha G 30 com a 1 in / 2,5 cm de comprimento é o ideal. Uma seringa de 1 ml podem ser usados ​​para volumes maiores, enquanto que uma seringa estanque ao gás pode ser utilizado para um controlo mais preciso de volumes mais pequenos (5-10 ul).
3. Aplicar gel de ultra-som para liberalmente a ponta do transdutor com uma espátula para cobrir a cabeça ao longo da sua totalidade. Desembainhar cuidadosamente a agulha e usar a montagem de agulha controlo para avançar a agulha directamente sob o transdutor e dentro do gel de ultra-som para a visualização. Faça ajustamentos menores, utilizando o controlo de montagem da agulha de modo que a agulha é claramente visualizada ao longo do seu comprimento a imagem de ultra-som em. Se o transdutor foi devidamente alinhado paralelamente à agulha na etapa 1.4, em seguida, a agulha deve permanecer no interior do plano da imagem, uma vez que é avançado e retirado com o botão de controlo de injecção (Figura 1C).
4. Em etapas subsequentes, não perturbe a necessidadele / transdutor alinhamento horizontal pelo movimento no eixo horizontal. Em vez disso, partes específicas do coração por injecção, alterando a posição vertical (eixo y) de montagem da agulha e pelo movimento da plataforma de animais.
5. Mover o transdutor superiormente a partir da plataforma de animal utilizando a verificação de controlo de altura (Figura 1B) para permitir a subsequente colocação do rato anestesiado para a plataforma animal. Isto não vai perturbar o alinhamento do eixo x do transdutor ao longo do eixo da agulha.
6. Retirar a seringa que foi usado para o alinhamento do grampo seringa e descartar cuidadosamente. Carregar a nova agulha e seringa com o injectado para o volume de destino final, permitindo espaço morto na ponta da seringa. Tenha cuidado para remover as bolhas de ar. Colocar a seringa no encaixe da seringa, sem ajustar o alinhamento do eixo-x. Totalmente retirar a seringa usando o controle de injeção.
   NOTA: Para fins de formação inicial, o uso do azul de Evancorante (1%), corante azul de tripano (0,4%) ou uma suspensão de microesferas fluorescentes como o injectado pode ajudar o operador a confirmação de competência e sucesso de injecção direccionada.

2 Injeção

1. Ligue o aquecedor integrado da plataforma de aquecimento e configurá-lo para 37 ° C. Coloque a plataforma animais 180 ° em relação à orientação normal de imagem, com a braçadeira de mangueira de anestesia e da cabeça do animal, mais próxima do operador. Isto permite que o coração (no lado esquerdo do peito) ser ipsilateral à braçadeira de seringa e agulha. Nota: menor no sentido horário ajustes adicionais para rotação da plataforma de animal pode ser necessário para orientar correctamente o coração para o plano da imagem do eixo curto para-esternal, que será utilizado para a injecção (Figura 2A).
2. Prepare camundongos para ecocardiografia conforme relatado anteriormente ^9. Anestesiar o mouse em uma câmara de indução com isoflurano a 2%. Remover pêlos no peito com Creme Depilatório umd aplicar gel lubrificante para ambos os olhos para evitar a secagem da esclera.
3. Elevar o transdutor usando o scan de controle da altura da cabeça (Figura 1B). Colocar o rato anestesiado supina sobre a plataforma de animais aquecidos com o focinho dentro de um cone de nariz entregar 1-3% de isoflurano (Figuras 2A-2B). Insira cuidadosamente a sonda retal e cole as quatro patas para os eletrodos de ECG, aplicando gel eletrodo para contato elétrico.
   NOTA: deve ser assegurado um nível adequado de anestesia para o tratamento humano do animal. Não deve haver nenhuma mudança na taxa de coração e não há resposta para a colocação da agulha através da parede torácica. Controles homeostáticos temperatura integrados da plataforma animal deve ser usado para manutenção da temperatura (37 ± 0,5 ° C), enquanto a hipotermia irá resultar em bradicardia relativa, dilatação ventricular, e possível desconforto.
4. Uma vez que o mouse está seguro sobre a plataforma animal, reduzir o transdutor na depilapeito ted usando o scan de controle da altura da cabeça (Figura 1B). A configuração ultra-som ideal para injeção é para o coração para ser visualizado na orientação do eixo curto paraesternal, conforme técnica ecocardiográfica padrão. Gire a plataforma animais de 20-30 ° no sentido horário para obter a janela acústica ideal para a injeção na imagem avião eixo curto (Figuras 2A-2B). Nota: Em alternativa, a injecção pode ser realizada a partir de uma orientação paresternal longo do eixo de rotação no sentido anti-horário da plataforma do animal (Figura 2C).
5. Use os animais controles para ajuste de plataforma para ajustar o campo de visão e atingir qualquer local da injeção desejada no miocárdio ventricular esquerdo. Pan vai-e-vem do ápice para a base do coração para atingir o local desejado injeção no miocárdio do ventrículo esquerdo (Figuras 3A-3C). Nota: O midpapillary parasternal vista-eixo curto (Figura 3A) oferece reproducible marcos que permitem acompanhamento de imagens do local da injeção. Observação: Como alternativa, o paraesternal longo eixo pode ser utilizado para atingir um local de injecção pré-definido (Figura 3D).
6. Começando com a seringa na braçadeira seringa totalmente retraída, mova lentamente a seringa contra o peito do animal, girando os ponteiros do relógio de controle de injeção (Figura 4A). Para permitir a visualização de ultra-som claro de ambos, o coração ea ponta da agulha que se aproxima do peito, use bastante gel de ultra-som sobre o lado esquerdo do peito e otimizar a janela acústica, estabelecendo um amplo campo de visão sobre os controles de ecocardiografia. Defina o ponto / zona focal no local de destino para a injecção. Pequenos ajustes para a agulha montar controles podem otimizar a imagem da agulha ao longo de seu comprimento.
   NOTA: Algumas máquinas de ultra-som tem uma função de software de guia de agulha para estender digitalmente uma linha ao longo do eixo longitudinal da agulha para a parte alvo miocárdio(Figura 4B). Tal ferramenta de software pode ser útil, mas não é essencial.
7. Com o animal adequadamente sedados (1-3% de isoflurano misturada com 0,5-0,8 L / min 100% de oxigénio), o avanço da agulha através da parede torácica do rato e no miocárdio, observando-se cuidadosamente a posição da ponta da agulha biselada em tudo vezes. Parar o avanço quando a ponta da agulha está no interior do miocárdio alvo (Figura 4C). Toda a ponta chanfrada deve ser firmemente dentro do miocárdio, para evitar a fuga de produto de injecção para dentro do espaço pericárdico.
8. Quando a ponta fica no local desejado, fornecer o produto de injecção, empurrando o êmbolo da seringa. Entregar o injectado lentamente, durante 5-30 segundos (dependendo do volume a ser entregue). Até 50 ul de produto de injecção podem ser apresentadas, sem comprometer a função ventricular. Um aspecto echobright transitória para a região do miocárdio injectado pode ser evidentes após a injecção com sucesso. Uma breve (segundos) período de relativa bradycardia ocasionalmente é observado com injeção no miocárdio e resolve rapidamente.
9. Uma vez que o material injetado foi administrado, prontamente retirar a agulha por rotação anti-horária do botão de controle de injeção. O mouse deve ser mantido sob anestesia por alguns minutos de observação ecocardiograma para confirmar função ventricular preservada e sem complicações pós-procedimento. Se indicado, várias regiões do miocárdio pode ser injectada em série com o reposicionamento do ângulo da agulha de abordagem por ajustamento da plataforma animal. Após a injeção intramiocárdica, o rato é colocado em uma gaiola por conta própria e autorizada a recuperar da anestesia sob observação.
10. Não deixe um animal sem supervisão até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que passou por injeção intramiocárdica para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. A gaiola deve ser colocada sobre uma almofada termorregulado com represtação ady de água e rato dieta. Desconforto pós-procedimento não se espera e falta de retomar de forma adequada o comportamento normal logo após a intervenção sugere uma complicação potencial (ver Discussão).
11. Cuidadosamente descarte a agulha imediatamente após a conclusão da injeção transmural de minimizar o risco de acidentes com perfurocortantes para o operador ou às pessoas presentes. Reutilizar uma agulha pode resultar em embotamento da ponta tornando-o mais difícil de furar o miocárdio, resultando em um maior risco de complicação.

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Resultados

A injeção transmural Murino com corante azul ou microesferas fluorescentes

A injecção de corante azul de Evan é útil para fins de treino. Logo após a injecção, o rato eutanásia e remover o coração para visualizar a localização do corante azul injectada. Figura 5 mostra um exemplo de uma injecção com sucesso, com o corante azul infiltrantes do miocárdio ao nível dos músculos papilares meados (Figura 5A, região delimitada pela linha a tracejad...

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Discussão

Biológicos podem ser entregues ao miocárdio por injecção directa intramiocárdica, injeção intrapericárdica, ou administração indireta através da corrente sanguínea. Com base em células ensaios de terapia recentes em modelos de infarto do miocárdio têm descrito uma abordagem toracotomia aberta para a entrega do material injetado ^12-14. Um fator importante para o sucesso de uma intervenção terapêutica do miocárdio depende da escolha da via de parto. A dose mais elevada do local biológico é ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100 ultrasound imaging system	Visualsonics
Vevo Integrated Rail System III	Visualsonics
Microscan MS400 transducer	Visualsonics
Microscan MS550D transducer	Visualsonics
PrecisionGlide needles	BD	305128	30 G x 1 in/2.5 cm
1 cc slip tip syringe	Exel International	26048	or equivalent
Gastight 50 μl glass syringes	Hamilton	1705
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250	or equivalent
Isoflurane	Baxter	AHN3640	or equivalent
Aquasonic 100	Parker Laboratories	(01-08)	or equivalent
Polystyrene microspheres (red fluorescent)	Life Technologies	F-8842	or equivalent