High Yield purificação<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoítos Para uso em opsonizantes Anticorpo Ensaios

Resumo

Medindo função anticorpo é fundamental para compreender a imunidade para Plasmodium falciparum da malária. Este método descreve o purificação dos merozoitos viáveis, e medição da fagocitose dependente de opsonização por citometria de fluxo.

Resumo

Antígenos merozoite Plasmodium falciparum estão em desenvolvimento como potenciais vacinas contra a malária. Um aspecto da imunidade contra a malária é a remoção de merozoitos livres do sangue pelas células fagocíticas. No entanto a avaliação da eficácia funcional dos anticorpos opsonizantes específicos merozoite é difícil, devido à meia-vida curta de merozoítos e a variabilidade de células fagocíticas primárias. Aqui descrito em pormenor um método para a geração de merozoítos viáveis ​​utilizando o inibidor de protease E64, e um ensaio de fagocitose dos merozoítos opsonina-dependente utilizando a linha de células pró-monocítica THP-1. E64 impede ruptura esquizonte, permitindo o desenvolvimento de merozoítos que são liberados por filtração de esquizontes tratados. Merozoítos brometo de etídio marcadas são opsonizadas com amostras de plasma humano e adicionados a células THP-1. A fagocitose é avaliada por um protocolo de alto rendimento padronizado. Merozoites viáveis ​​são um recurso valioso para a avaliação numeraspectos ous de P. biologia falciparum, incluindo a avaliação da função imunológica. Os níveis de anticorpos medidos por este ensaio estão associados com a imunidade à malária clínica em indivíduos naturalmente expostos. O ensaio pode também ser usado para avaliar a vacina induziu anticorpos.

Introdução

A importância de anticorpos para a imunidade ao Plasmodium falciparum da malária foi mostrado há 40 anos, quando imunoglobulina dos adultos hiperimunes foi passivamente transferidos para crianças que sofrem de malária grave, resultando em doença aliviada ^1. Consequentemente, um esforço considerável tem procurado identificar alvos de imunidade protetora da malária, principalmente por meio de realização da sorologia para peptídeos ou proteínas expressas por bactérias ELISA. Sorologia ELISA baseado também provou altamente variável entre os estudos, e não trata a funcionalidade do anticorpo ^2. Muitos antigénios de malária induzir uma IgG1 e IgG3 citofílico perfil de anticorpos, particularmente antigénios de superfície merozoite ^3. Esse viés subclasse sugere que-Fc-receptor de anticorpos (CA) interações com os fagócitos são importantes para as funções efetoras da opsonizante anticorpos antimerozoite ^4. Várias vacinas antígeno merozoite em desenvolvimento são projetados paraprovocar funções efetoras fagócitos ^{5, 6} e embora exista evidência significativa para a importância das interações anticorpo-TFR em modelos de roedores malária ^7-9, e alguns estudos recentes reforçam a importância de anticorpos funcionais e funções dos fagócitos efetoras de imunidade à malária em seres humanos ^{10, 11,} esta área continua a ser pouco estudado. Estudo em anticorpos opsonizantes específicos merozoite tem sido limitada por dois factores; a dificuldade de isolar merozóitos de boa qualidade; e respostas fagocitose variáveis ​​de células primárias.

Até recentemente, a centrifugação de alta velocidade ou de densidade de Percoll gradientes foram utilizados para isolar a partir de sobrenadantes de cultura de merozóitos de ruptura culturas esquizontes. Estes merozóitos eram raramente viável, e muitas vezes ainda manipulados por centrifugação de densidade e de lavagem múltiplos passos ^{12, 11} ou criopreservação antes da utilização em ensaios. Estes proccessos potencialmente separar muitas proteínas associadas perifericamente a partir da superfície do merozoíto, proteínas conhecidas para ser alvos antigénicos de imunidade malárico ^13. Recentemente, o inibidor de protease de cisteína trans-epoxisuccinil-L-leucylamido (4-guanidino) butano (E64) foi usado para gerar merozoítos viáveis. E64 impede ruptura esquizonte, os merozoítos gerando membrana fechada ^14, que pode ser interrompido por meio de filtração para libertar merozoítos viáveis ^{​​15, 16.} Esta técnica levou à resolução espacial de numerosas proteínas durante a invasão de eritrócitos ^{15, 17-19} e esclareceu o efeito específico palco de vários medicamentos antimaláricos ^{16, 20.} No entanto, a geração de merozoítos viáveis ​​permanece um desafio técnico. Para ajudar na divulgação desta técnica e aplicação de testes funcionais da imunidade, um protocolo detalhado para a purificação merozoite viável e seu uso em umensaio funcional padronizado de anticorpo: cooperação celular em opsonização e fagocitose é descrito aqui.

Esta técnica demonstra um avanço significativo sobre os ensaios anteriores in vitro de merozoíto opsonização, como a explosão respiratória dos neutrófilos, Antibody Dependent Cellular Inibição (ADCI), e ensaios de fagocitose de merozoítos alternativos. Estes ensaios são pouco reprodutível devido à variação dos insumos do parasita ea atividade das células fagocíticas primários ^{11, 21.} Contaminando hemozoin também pode afetar profundamente a função fagocitária ^22. Um ensaio de merozoítos fagocitose robusto e reprodutível recentemente relatado ²³ utiliza a linha de células promonocíticas THP-1 ^24. Este é um tipo de célula ideais para ensaios de citometria de fluxo de alto rendimento, uma vez que é não-aderente e, especificamente, realiza Fc-Receptor fagocitose mediada por ^{25, 26.} Uma complexidade adicional, enquanto investidorestigating fagocitose é que o grau de fagocitose está dependente do número de merozoítos relativos a células THP-1 e de concentração de plasma. Para garantir a reprodutibilidade entre experimentos, merozoites devem ser enumeradas e uma concentração definida usado. Devido ao seu pequeno tamanho, por citometria de fluxo de quantificação é necessária.

O procedimento aqui descrito remove hemozoína e gera merozoítos viáveis, e descreve a aplicação desses merozoítos por citometria de fluxo de enumeração de merozoítos seguido por opsonização e fagocitose. Embora tecnicamente exigente, as técnicas descritas podem ser úteis para elucidar a contribuição de respostas de anticorpos específicos de superfície merozoite a adquirida naturalmente e vacina induziu imunidade.

Protocolo

Nota: Todos os passos de, para além da centrifugação e a citometria de fluxo, deve ser realizada dentro de uma câmara de fluxo laminar, para manter a esterilidade. Assegurar as devidas precauções sejam tomadas em relação a manipulação de amostras humanas. O ensaio é muito sensível para pequenas quantidades de plasma. As diluições fornecidas são ideais para a resolução de respostas que vão 5-78% com plasma de crianças semi-imunes de Papua Nova Guiné (PNG). A diluição ideal pode variar com aparelhos de plasma a ser testado e, portanto, recomenda-se que o plasma ser titulada para determinar as condições experimentais para cada aplicação. Garantir a inclusão de dois controles negativos células THP-1 com merozoites na ausência de plasma; e células THP-1 com merozoites opsonizadas com um pool de plasma de malária indivíduos ingênuos. Isto irá permitir um controlo para a adesão dos merozoítos para células THP-1 e para permitir rigorosa gating citometria de fluxo de eventos de fagocitose.

O uso de amostras de plasma foi PNGaprovado pelo Comitê Consultivo de Pesquisa Médica, Papua Nova Guiné Ministério da Saúde, o Walter e Eliza Hall Institute Comitê de Ética em Pesquisa Humana (número do projeto 04/04). Foi obtido consentimento escrito dos pais / encarregados de educação de todos os participantes.

1. THP-1 Cultura

1. Manter a linha celular monocitica humana THP-1 em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 55 uM de 2-mercapthoethanol (THP-1 médio) e a 37 ° C numa atmosfera de 5% de _CO2 umidificada.
2. Manter as células a uma densidade inferior a 5 x 10 ⁵ células / ml. NOTA: Supercrescimento irá resultar em diferenciação em células aderentes e infra-regulação de receptores Fc. Uma vez que as células foram passadas a aproximadamente 10 vezes, descongelar um frasco novo para manter o fenótipo da célula.

2. Preparação de Amostras de anticorpos e de diluição

1. Calor plasma inativar a ser testado e plasma controle da malária ingênuo por incubação a 56 °; C durante 30 min
2. Diluir em série de amostras de plasma a 1/2, 000, em células THP-1 de gama média.
3. Plasma loja diluída a -20 ° C.

3. Cultura de Altamente Sincronizado P. falciparum

NOTA: A linha parasita expressando GFP-D10-PfPHG ²⁷ foi utilizado devido ao seu ciclo de vida de 48 horas, que auxilia a sincronização de parasitas eo momento controlada de E64 disso. Além disso, porque esta linha expressa GFP no citosol, esta linha permite a detecção de parasitemia e merozoitos livres por citometria de fluxo, detecção de GFP. No entanto, a intensidade de fluorescência da GFP não é suficiente para proporcionar a visualização no interior de células THP-1, e, portanto, os merozoítos são contrastadas com brometo de etídio (EtBr). Outras estirpes do parasita podem ser utilizados, desde que a sincronia apertado é realizável. Sincronizar parasitas utilizando uma combinação de tratamento de sorbitol para lisar as formas maduras ^{de 28} e heparina para inibir a invasão ¹⁵ .

1. Manter P. falciparum parasitas em O + eritrócitos humanos (RBC) em 3% de hematócrito em meio RPMI-1640 (pH 7,4) suplementado com 25 mg / ml de HEPES, 50 ng / ml de hipoxantina, 10% de soro humano, 2 mg / bicarbonato de sódio ml, e 20 ug / ml de gentamicina (meio parasita). Adicionam-se 5 mg / ml de blasticidina S-hidrocloreto ao meio de cultura para seleccionar para GFP + parasitas.
2. Incubar as culturas em caixas estanques ou frascos de cultura, alternativamente dupla selados a 37 ° C numa atmosfera de 1% _de O2, 4% de _CO2 e 95% de _N2.
3. Prepare esfregaço finas, fixar em 100% de metanol durante 10 segundos, e a mancha com uma solução de 10% de Giemsa em 6,7 mM (pH 7,1), tampão fosfato (solução de Giemsa) durante 10 minutos para monitorar a parasitemia. Após a coloração, lavar com água e ar seco. Avaliar a parasitemia usando uma lente de imersão em óleo de 100X.
4. Manter culturas de parasitas em uma parasitemia abaixo de 5% RBC infectado dividindo culturas e adicionando não infectadoRBC, conforme necessário.
5. Para sincronizar com heparina, adicionar 20 UI / ml de heparina de grau médico para tocar em estágio culturas.
6. Quando a maioria dos parasitas estão na fase de esquizonte, células de pelotas a 300 xg durante 5 min, remove-contendo heparina de médio e ressuspender em meio de parasita para permitir a ruptura esquizonte e merozóito invasão.
7. Depois de 4 horas, adicionar 20 UI / ml de heparina de volta para as culturas, bloqueando qualquer outra invasão merozoite. NOTA: Vários ciclos de sorbitol e de tratamento de heparina pode ser necessária antes de parasitas são suficientemente sincronizada. Para gerar números adequados de merozoítos, preparar 150 ml de cultura parasita a 3 - 5% parasitemia.

4. Isolamento de Final Stage P. falciparum Trofozoítos

1. Trinta e seis horas após o retorno da heparina para culturas, sedimentar as células cultivadas a 300 xg durante 5 min, e ressuspender em meio de pelota do parasita a 25% hematócrito.
2. Anexar uma grande coluna magnética (volume de matriz de 6,3ml) para um íman, e equilibrar a coluna com meio de parasita, certificando-se de que todas as bolhas de ar são removidas.
3. Adicionar o P. ressuspensas cultura falciparum para a coluna, e ajustar a taxa de fluxo de uma gota por segundo.
4. Uma vez que a cultura foi passado através da coluna, lava-se a coluna com meio parasita até que o fluxo de passagem corre claro.
5. Eluir parasitas a partir da coluna em 30 ml de 37 ° C meio parasita.
6. Preparar um esfregaço fino de parasitas, fixar em 100% de metanol por 10 segundos, e manchar com solução Giemsa por 3 min. Examine a lâmina sob o microscópio, e garantir que os parasitas quase encher o glóbulo vermelho, e parece estar em estágios iniciais esquizontes. Se os parasitas não tenham atingido a fase de maturação apropriado, retornar parasitas purificados para uma incubadora a 37 ° C numa atmosfera de 1% _de O2, 4% de _CO2 e 95% de _N2 até desenvolvido adequadamente. NOTA: pureza superior a 90% de células vermelhas do sangue infectados é necessária para assegurar a RBCs não contaminam preparações merozoite.
7. Tratar esquizontes isolado com 10 uM E64 (epoxisuccinil-L-leucylamido (4-guanidino) butano (E64) para 6-10 h NOTA:. Tempos de incubação mais longos com E64 é possível, no entanto, os merozoítos produzidos deixará de ser invasivo.

5. Isolamento de P. falciparum Merozoítos

1. Após a incubação com E64, esfregaço parasitas, fixar as células em 100% de metanol, e a mancha com solução Giemsa para avaliar a formação de merozoítos fechado por uma membrana. NOTA: Um bom rendimento de merozoites será obtida se for maior que 50% dos parasitas formaram membrana merozoites fechados.
2. Pellet E64 tratados esquizontes a 1.900 xg por 8 min. Lava-se com 50 ml de RT meio RPMI-1640 (pH 7,4) suplementado com 25 mg / ml de HEPES, 50 ng / ml de hipoxantina, 2 mg / ml de bicarbonato de sódio, e 20 ug / ml de gentamicina (meio de lavagem) para remover o restante do soro humano .
3. Ressuspender o sedimento em 2 ml de meio de lavagem. NOTA: Usando FCS contendo meio THP-1 vai produzir espuma durante a filtração.
4. Filtrar os 2 ml de ressuspensos E64-esquizontes através de um filtro de seringa de 1,2 mm μm/32. Recolhe-se o filtrado em um tubo de 10 ml. NOTA: O filtrado contém merozoites e cristais hemozoína, com esquizontes rompeu-un e detritos coletados no filtro.
5. Coloque uma pequena coluna magnético de um ímã, e equilibrar com 500 mL THP-1 médio.
6. Passa-se o filtrado sobre a coluna magnética. Recolhe-se o fluxo de passagem. NOTA: hemozoin ligarão à coluna, enquanto merozoítos vai passar.
7. Passar o fluxo de passagem através da coluna mais duas vezes para remover hemozoína, recolhendo o fluxo através de cada vez.
8. Lavar a coluna com 2 ml de RT THP-1 médio de recolher quaisquer merozoites restantes.
9. Adicionar EtBr em 10 ug / ml (concentração final) e mancha durante 30 min à temperatura ambiente. Proteger da luz para evitar a fotodegradação. Nota: Certifique-se que todo o líquido e p EtBr contaminadoresíduos lastic é descartado de forma adequada para produtos químicos citotóxicos. Merozoítos já não são invasivos seguir a esta incubação.
10. Girar merozoites a 4.000 g durante 10 min.
11. Elimine o sobrenadante para um recipiente adequado de lixo.
12. Ressuspender merozoite sedimento em 4 ml de THP-1 médio, e girar para baixo a 4.000 g durante 10 min.
13. Adicionar THP-1 médio até um volume de 15 ml, e proteger da luz.

6. Quantificação Merozoito Concentração por Citometria de Fluxo

1. Traga contando grânulos para a TA.
2. Prepare PBS com 0,5% de BSA para diluir merozoites.
3. Contagem merozóitos em 3 diluições; 1 em 100; 1 em 50 e 1 em 25. Preparar tubos de FACS com 3 940, 930 e 910 ul de PBS, 0,5% de BSA, respectivamente. Adiciona-se 10, 20 e 40 ul de merozoítos purificados por tubo, respectivamente.
4. Pérolas de contagem Vortex durante 30 segundos, e adicionar 50 ul de esferas por tubo de FACS contendo merozoítos diluído.
5. Execute o três dilamostras merozoite buído num citómetro de fluxo equipado com um laser de 488 nm. Definir um portão rigorosas para merozoítos baseados em EtBr e a fluorescência de GFP dupla fluorescência, e os grânulos de contagem de porta por meio de fluorescência de um canal separado. Adquirir eventos até 2.000 contas são coletados. Nota: Estas instruções referem-se a contagem de GFP + merozoites que foram contra-corados com EtBr. Se não utilizando GFP expressando parasitas então fixados portões merozoite com base em dispersão lateral e EtBr fluorescência.
6. Determinar a proporção de merozoítos: grânulos, dividindo o número de eventos de merozoítos por contagem dos 2.000 eventos talão, calcular uma proporção para cada diluição. Utilize as especificações de lote contagem de contas para determinar o número de contas na década de 50 mL de contas adicionadas por tubo.
7. Multiplique o número de contas em 50 ul pelo fator de diluição e pelo merozoite: relação talão para que o fator de diluição. Este número é igual à concentração de merozoítos por ml. Realize ªese de passos para cada diluição.
8. Calcular a média dos concentrações merozoite medidos nas três diluições. NOTA: Os desvios padrão acima de 10% para as concentrações determinadas para 1 em 100, 1 em 50 e 1 em 25 diluições indicam imprecisões técnicas na preparação de amostras de contagem.
9. Ressuspender merozóitos em 8 x 10 ⁶ / ml em merozóitos de THP-1, meio para assegurar uma razão final de quatro merozoítos por THP-1 celular. Nota: Outras merozoite para THP-1 índices podem ser usados, e as concentrações devem ser alterados em conformidade.

7. Fagocitose Ensaio

1. Adicionar 200 mL de calor FCS inativos por poço de placas de 96 poços de fundo em U, e deixar à temperatura ambiente O / N para bloquear placas. Após a incubação, remove FCS e lavar os poços duas vezes com 200 ul de PBS estéril. Remover PBS e armazenar as placas a 4 ° C até ser necessário.
2. Calcular o número de células THP-1 necessários para a análise de amostras de plasma e controlos, permitindo poços em triplicado por amostra a 1 x 10 ^{5 células THP-1 por poço.}
3. Determinar a concentração de THP-1 de cultura através do carregamento de 10 uL de cultura em que um slide de hemocitómetro. Contar o número de células presente em 4 conjuntos de 16 esquinas do hemocitómetro sob um microscópio, em seguida, calcular a média das contagens. Multiplicar a contagem média de 10.000 para calcular o número de células por ml.
4. Girar o número necessário de células THP-1 a 500 xg durante 5 min, e ressuspender em 6,7 x 10 ⁵ células / ml em meio de THP-1.
5. Adicionar 150 ul de células THP-1 em células THP-1 por meio de um poço de FCS-bloqueado placa de 96 poços de fundo em U, o que resulta em 10 ⁵ células / poço. Preparar 3 poços por exemplo que irá ser testada. Retornar placa para incubadora até que esteja pronto para adicionar merozoites.
6. Adicionar 150 ul de preparação de merozoíto de 8 x 10 ⁶ / ml por poço para uma FCS-bloqueado placa de 96 poços de fundo em U separados. Prepare um bem por amostra testada
7. Adicionar 10 pi de amostras de plasma diluídas preparadas por poço, para tele placa que contém os merozoítos, e misture bem para garantir a solução homogénea.
8. Remova a placa de células THP-1 a partir do incubador, e adicionar 50 ul da solução de merozoítos / plasma por poço contendo células THP-1, com cavidades triplicadas por amostra de plasma.
9. Misturar bem e incubar a 37 ° C em 5% de CO _2, incubadora humidificada, durante 40 min. Cubra com papel alumínio para proteger da luz.
10. Após 40 min, as amostras de centrifugação por 5 minutos a 500 xg de um pré-arrefecido a 4 ° C centrífuga para prender a fagocitose.
11. Remover o sobrenadante e lavar as células duas vezes em PBS gelado 0,5% BSA EDTA 2 mM (tampão FACS). NOTA: EDTA vai facilitar a manutenção de uma suspensão de células individuais por citometria de fluxo.
12. Fix células em 90 ul de 2% de paraformaldeído (PFA) em PBS +0,5% de BSA EDTA 2 mM (FACS fixador). Deixar em gelo até à aquisição, protegido da luz.

8. Citometria de Fluxo

1. Adquirir amostras usando um citômetro de fluxo wi equipadoth um laser de 488 nm e alta taxa de transferência de anexo leitor de placas. NOTA: Este vai permitir que até 400 amostras de plasma para ser testada de uma preparação de merozóito. As células também podem ser transferidas para os tubos de amostra manual de carregamento.
2. Portão viáveis ​​células THP-1 de frente e dispersão lateral.
3. Defina o portão positivo EtBr com base nos 'células THP-1 com merozoites e sem plasma' controle.
4. Adquirir um mínimo de 10.000 eventos por amostra.

9. Data Analysis

1. Analisar dados por citometria de fluxo de software de análise e defina portões rigorosos para eventos positivos EtBr.
2. Calcule a porcentagem de fagocitose para cada amostra: a% de células ETBR + para a amostra menos as células positivas% com plasma não imune.
3. Os resultados médios em todo triplicatas. NOTA: Os desvios padrão para a triplicado em excesso de 10% indicam imprecisões experimentais. Alguns fundo eventos EtBr positivos podem ser observados como resultado de merozoite a adesão à superfície de células THP-1, mas deve ser consistente entre todas as amostras contendo os merozoítos. Definir a porta com base nos 'células THP-1 com e sem plasma merozoites' controle e, em seguida subtraindo qualquer fundo das "células THP-1 com os não-imune plasma" controle resultará em fagocitose% que reflete a fluorescência devido a internalizada / fagocitado apenas merozoites.

Resultados

O estádio de maturação dos parasitas antes do tratamento E64 é fundamental para a geração de merozoítos fechado à membrana. 1ai Figura mostra o estágio de maturação adequado de esquizontes para adicionar E64. Os parasitas devem ser grandes e quase encher o glóbulo vermelho. Um aspecto manchado de Giemsa indica merogonia tenha iniciado, e E64 deve ser adicionada para se obter merozoítos fechado por uma membrana (Figura 1Aii). Se E64 é adicionado anteriormente para trofozoíto parasitas palco, membrana merozoites fechados não são gerados, mesmo depois de 12 horas de E64. Em vez parasitas assumir morfologia anormal, tal como o alargamento do vacúolo digestivo (Figura 1BI e 1Bii), e merozoitos não são formados. Se E64 é adicionado mais tarde para esquizontes, merozoites fechado à membrana não são gerados como ruptura esquizonte é desinibida (Figura 1CI e 1Cii). É necessário um alto nível de parasita sincronia, outrosábio uma gama de todos os três resultados descritos será visto após o tratamento E64.

Remoção de hemozoin é mais um passo crítico para merozoites de purificação. Se não merozoítos são purificados a partir hemozoína seguida aglomerados merozoite-hemozoína formar o que não pode ser desalojado por pipetagem. Estes agregados executado no citômetro como eventos isolados, embora com características diferentes para a frente-de dispersão e de lado de dispersão do que merozoites individuais, resultando em contagem merozoite imprecisa por citometria de fluxo (Figura 2A). Como células THP-1, também podem fagocitar hemozoína, estes aglomerados de merozoítos-hemozoin também pode ser fagocitado (Figura 2B). Estes agregados são fluorescentes altamente EtBr, pois contêm vários merozoítos. A fagocitose dos agregados resulta em células THP-1 de perfil EtBr fluorescência equivalente à observada para a fagocitose de múltiplos merozoítos individuais. Assim, se hemozoína não for removido, a fluorescência do EtBr células THP-1 será um overestimate do potencial de opsonização do plasma testada. Hemozoína também é relatado para alterar significativamente a função dos fagócitos. GFP positivas merozoítos são contra-coradas com EtBr para aumentar a visualização dos merozoítos fagocitose por células THP-1. Usando as condições descritas no presente protocolo, todos os merozoítos GFP positivas são contrastadas com EtBr, que tem uma intensidade de fluorescência mais brilhante (Figura 3A). Avaliação de fagocitose por EtBr fluorescência permite uma resolução superior de merozoíto fagocitose de fluorescência da GFP (Figura 3B).

O número de merozoítos adicionadas ao ensaio irá modular a quantidade de fagocitose observada. Por esta razão, uma contagem precisa por citometria de fluxo é crítica. Aumentando rácios de merozoítos: THP-1 vai resultar num aumento da adesão de merozoítos para células THP-1 na ausência de plasma (Figura 4A). Aumentar merozoite: THP-1 índices também resulta em aumento do pHrespostas agocytosis quando merozoítas opsonizado (Figura 4B). Um 04:01 merozoíta: THP-1 rácio é recomendado para respostas fagocíticas robustos. Usando esta relação, e a diluição de plasma indicado, este ensaio é capaz de resolver baixas, intermediárias e níveis elevados de anticorpos opsonizantes. Entre 0 e 78 por cento de fagocitose respostas foram observadas em amostras de plasma PNG e as outras condições descritas. Tais respostas foram recentemente mostrado a associar com imunidade clínica adquirida naturalmente à malária ^10. Figura 5 mostra exemplos dos quatro quartis de respostas fagocitose de indivíduos PNG.

Figura 1. Sincronismo de E64 disso é crítico para a geração de merozoítos fechado por uma membrana. (A) maturatio Apropriada. fase de parasitas n i) antes do tratamento E64, e ii) merozoites fechado à membrana produzidos após 6 horas de tratamento E64 (B) membrana merozoites fechados não são gerados se E64 é adicionado parasitas imaturos; i) trofozoítos fase tardia, e ii) após 12 horas de E64 (C) esquizontes ruptura não é inibido se E64 é adicionado ao final segmentado esquizontes.; i) esquizontes fase tardia, e ii) após 6 horas de E64. A barra de escala representa 10 um.

Remoção hemozoin Figura 2. Crítico é para gerar uma suspensão de uma única célula de merozoíto. Agregados Merozoito-hemozoin formulário seguinte de filtração de membrana merozoítos fechados, a menos que hemozoína está magneticamente separada do merozoitos. (A) de avanço-dispersão e de lado de dispersão de parcelas com merozoítos hemozoin removidoe hemozoína retido. (B) agregados hemozoin-merozóito podem ser fagocitados pelas células THP-1. Coradas Diff-Quick lâminas cito-rotação de células THP-1 foram incubadas com plasma opsonizado PNG preparações merozoite com ou sem hemozoína. A barra de escala representa 10 um.

Figura 3. Coloração de brometo de etídio permite a resolução superior de merozoite fagocitose. D10-GFP merozoítos purificadas são contrastado com EtBr para melhorar a intensidade de fluorescência. (A) A citometria de fluxo histograma de merozoítos purificadas com gating em GFP merozoites positivos e um dot blot mostrando EtBr fluorescência dentro desta população positiva GFP fechado. (B) dispersão para a frente contra a GFP e dispersão para a frente contra EtBr de células THP-1 na sequência de fagocitose de GFP e EtBr merozoítos fluorescentes duplas. Portões foram d rawn com base nas células THP-1 com merozoítos e sem controlo de plasma.

A Figura 4 A merozoíta:. THP-1 rácio influencia o grau de fagocitose observada. (A) Cinco merozoite: THP-1 índices são retratados; 50:1, 20:1, 10:1, 04:01, 01:01. Células único controle indica fluorescência de fundo devido a células THP-1. THP-1 de fluorescência EtBr para cada relação é indicado para merozoítos opsonizadas com um pool de plasma PNG ou com plasma australiano não imune (B) Média da intensidade de fluorescência de células THP-1 para merozoíta diferente:. THP-1, as proporções, e opsonização com uma piscina de plasma PNG ou plasma australiano não imune (média + SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5. Uma grande variedade de anticorpos opsonizantes pode ser medido. Merozoítos foram opsonizado com plasma de indivíduos PNG e incubadas com células THP-1. Quatro respostas fagocitose representativos são mostrados. Portões foram desenhadas com base nas células THP-1 com merozoites e sem controle de plasma, e os números indicam a fagocitose% após subtracção das células THP-1 com controle de plasma não imune. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Para medir merozoite fagocitose, a proficiência em duas técnicas é necessária: Purificação de merozoítos e THP-1 ensaio fagocitose. Os passos mais críticos para combinar estas duas técnicas são: 1) parasitas altamente sincronizadas; 2) Adicionando E64 no tempo correto para produzir membranas merozoites fechados; 3) A remoção hemozoin para evitar agregados; 4) contagem merozoite precisa por citometria de fluxo; 5) a diluição de plasma utilizado; e 6) mantendo baixa densidade celular e o número de passagem das células THP-1. Uma análise cuidadosa desses aspectos-chave irá garantir respostas fagocitose robustos são observados.

Embora, aqui descrita é a preparação de merozoítos para avaliar a fagocitose, a técnica pode ser utilizada para uma vasta gama de aplicações. Independentemente da metodologia de fluxo baixo, preparações merozoite ideais dependem de cronometrar corretamente E64 disso, a fim de gerar merozoites. O método descrito aqui E64 demonstrou yield merozoites invasivos para uso em microscopia de alta resolução de ocorrências de invasão e ensaios de sensibilidade a drogas ^15-20. Enquanto viabilidade merozoíta não é essencial para a fagocitose, é necessária a integridade do revestimento de superfície do merozoito. Portanto, o método descrito aqui E64 permite merozoites alta qualidade a ser produzido para avaliar as respostas de anticorpos ao revestimento de superfície. Conforme descrito na Figura 1, se E64 é adicionado demasiado cedo ou membrana merozoítos fechados demasiado tarde não são formados. Por esta razão, as culturas de parasitas altamente síncronos são necessários. Aqui, a utilização de tratamentos de sorbitol e de heparina para sincronizar firmemente D10-GFP culturas de parasitas para uma janela de 2 horas é descrita. A heparina pode promover gametocytogenesis em outro laboratório isola, e, portanto, deve ser usado com cuidado. Também podem ser utilizados métodos alternativos de sincronização, tais como alanina, desde que os parasitas fortemente sincronizadas são produzidos ^29. Se E64 é adicionado parasitas assíncronos, um suporte inferiorortion de merozoites fechado à membrana será produzido e restante parasita-infectados RBC será ou ruptura normalmente ou desenvolver morfologia anormal. A presença de parasitas que não foram desenvolvidos em membrana fechada merozoítos irá resultar em entupimento do filtro e reduzir significativamente o rendimento do merozoito obtido.

Durante a filtração de merozoites fechado por uma membrana, hemozoin é liberada dos vacúolos digestivos e está presente como cristais livres em solução. Hemozoína é altamente pró-inflamatória e tem sido relatado para modular monócitos e macrófagos fagocitose respostas ^{30, 31.} Além disso a modulação da fagocitose, como mostrado na Figura 2, hemozoína pode formar agregados com merozóitos em solução. Como células THP-1 pode fagocitar estes agregados, este pode ser um importante confundindo a resolução de fagocitose mediada por anticorpo. Portanto, a remoção de hemozoína é necessário neste ensaio para avcomplexidade adicional oid de hemozoin sobre a biologia dos fagócitos. Além disso, a incapacidade de remover hemozoína também pode ser prejudicial ao utilizar esta técnica para gerar merozoitos livres para outras aplicações, especialmente, onde é necessária uma quantificação merozóito.

Conforme descrito na Figura 4, o número de merozoítos adicionado ao ensaio pode influenciar o grau de fagocitose por células THP-1. Apesar de citometria de fluxo permite a enumeração de concentração merozoite, pipetagem cuidadosa e replicar acusações de merozoítos são necessárias para melhorar a precisão. Isto é especialmente crítico se várias linhas de parasitas devem ser testados side-by-side. Foi previamente demonstrado que o plasma de crianças semi-imunes de PNG pode ser diluída antes de respostas significativamente diminuir ^23. Aqui descrita é a diluição óptima de plasma (1/120, 000 da diluição final do plasma) para um grupo de 5 - 12 anos de idade crianças PNG que produziu a grande gama de phagocyt. respostas Osis descritos na Figura 5 Este intervalo permitido para a estratificação de respostas em quatro grupos (0 - 19%, 20-39%, 40-59% e 60-79% de fagocitose) e modelagem de regressão revelou que as respostas foram associadas com opsonizantes protecção contra a doença clínica e a parasitemia de alta densidade ¹⁰ Para coorte diferentes estudos pode ser necessário ajustar a diluição de plasma para garantir que a fagocitose por células THP-1 não está saturado ou abaixo do nível de detecção.

A citometria de fluxo permite a fagocitose rápido e quantificável com maior precisão sobre microscopia. Este protocolo é uma alta taxa de transferência, placa de base e aquisição de placas de 96 poços para estudar a imunidade humoral adquirida naturalmente automatizado. O método requer a coloração de merozoítos com brometo de etídio, corantes de ADN entretanto alternativos tais como SYBRgreen, DAPI e propídio iodo, manchas ou nódoas de proteínas de membrana pode ser utilizado. Este ensaio seria passível de primarmonócitos ou neutrófilos y, e poderia ser adaptada se fagócitos ou biologia FcR era de interesse. As células primárias ou células THP-1 diferenciadas com PMA in vitro podem ser usadas para estudar a fagocitose em malária e outros agentes patogénicos ^{12, 32-34.} No entanto, utilizando células primárias pode ser um desafio uma vez que estas células são aderentes e também exibir não mediada por anticorpos fagocitose ^35. Além disso, a variabilidade em pureza, viabilidade e a funcionalidade de algumas limitações importantes para a utilização de células fagocíticas primárias. Os receptores Fc envolvidos na fagocitose merozoite permanecer descaracterizados e, portanto, usando anticorpos bloqueadores de receptores Fc específicos poderiam elucidar a contribuição de cada Fc Receptor para merozoite fagocitose. Como THP-1 fagocitose é FcR dependente, o que permite a interpretação direta da fagocitose observado. Este ensaio também se presta a abordar a especificidade do antígeno opsonizante anticorpos que podem ser atingidos por utilnalizar parasitas knock-out para antígenos de superfície merozoite, ou utilizando anticorpos humanos purificados de afinidade para merozoite proteínas de superfície. Além disso, em estudos aprofundados de respostas de citocinas seguintes merozoíta fagocitose está ausente, e pode ser alcançada com este ensaio.

Estas duas técnicas constituem avanços consideráveis ​​para o estudo de anticorpos antimerozoite funcionais. A purificação dos merozoitos alta qualidade é vantajoso utilizar merozoítos criopreservado, ou microesferas fluorescentes revestidas com os antigénios merozoite. Embora este ensaio tem sido usado como uma ferramenta para avaliar a imunidade adquirida naturalmente, pode ser uma ferramenta importante para tratar a aquisição de imunidade em resposta à vacinação. Embora tenha sido recentemente demonstrado que a fagocitose ou merozoitos opsonizado está relacionado com a protecção contra a malária clínica, não é possível tirar conclusões a partir directas in vitro de THP-1 para a fagocitose in vivo phagocytosis de merozoítos como fagocitose no ensaio ocorre sob condições estáticas e na ausência de células vermelhas do sangue competem. Os possíveis adaptações deste ensaio podem, assim, proporcionar uma ferramenta versátil para uma maior compreensão da malária e merozoite fagocitose.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
THP-1 cell line	American Type Culture Collection	TIB-202
RPMI-1640	Gibco	31800-089
Fetal Calf Serum (FCS)	Invitrogen	10099-141
2-mercapthoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML	Use in Fume Hood
Pen/Strep Solution (100x)	Sigma	P0781
HEPES	SAFC	90909C	Cell culture grade
Hypoxanthine	Calbiochem	4010
Human Serum	Donation from Australian Red Cross		Available commercially (i.e. Invitrogen)
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck	1.06329.0500
Gentamycin	Pfizer	61022027	Injection Quality
Heparin Sodium BP (5000 IU/ml)	Pfizer		Porcine origin
Blasticidin S-hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	50-70-4
E64 Protease Inhibitor	Sigma-Aldrich	E3132-10MG
KH2PO4	Sigma-Aldrich	98281-100G	Use for phosphate buffer
Na2HPO4.2H20	Merck	10383.4G	Use for phosphate buffer
Giemsa's azur eosin methylene blue solution	Merck	1.09204.0500	1:10 dilution in 6.7 mN Phosphate buffer (make fresh each stain)
EDTA disodium salt	Merck	10093.5V	0.1 M, pH 7.2
Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm	Pall Life Sciences	4656
QuadroMACS Separator (for small column)	MACS Miltenyi BioTec	130-091-051	Interchangeable with MidiMACS
VarioMACS Separator (for large columns)	MACS Miltenyi BioTec	130-090-282
MACS MultiStand	MACS Miltenyi BioTec	130-042-303
LS Column (small magnetic column)	MACS Miltenyi BioTec	130-042-401
Large magnetic column	MACS Miltenyi BioTec	130-041-305
Ethidium Bromide	Bio-Rad	1510433	Cytotoxic
CountBright Absolute Counting Beads	Invitogen	C36950
BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader	BD Biosciences
EDTA disodium salt	Merck	10093.5V	0.1 M, pH 7.2
FlowJo cytometry analysis software	Tree Star